Eine entscheidende Rolle einer eubiotischen Mikrobiota bei der Gewährleistung der richtigen Immunkompetenz bei Arabidopsis

Sep 11, 2023

Naturpflanzen (2023)Diesen Artikel zitieren

3302 Zugriffe

25 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Obwohl viele Studien gezeigt haben, dass Mikroben pflanzliche Immunantworten ektopisch stimulieren oder unterdrücken können, bleibt die grundlegende Frage, ob die gesamte bereits vorhandene Mikrobiota tatsächlich für die ordnungsgemäße Entwicklung der pflanzlichen Immunantwort erforderlich ist, unbeantwortet. Unter Verwendung eines kürzlich entwickelten, auf Torf basierenden gnotobiotischen Pflanzenwachstumssystems stellten wir fest, dass Arabidopsis, die in Abwesenheit einer natürlichen Mikrobiota gezüchtet wurde, keine altersabhängige Reifung der pflanzlichen Immunantwort aufwies und in mehreren Aspekten der mustergesteuerten Immunität defekt war. Axenische Pflanzen zeigten eine Überempfindlichkeit gegenüber einer Infektion durch den bakteriellen Krankheitserreger Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 und der Pilzpathogen Botrytis cinerea. Die durch Mikrobiota vermittelte Immunkompetenz wurde durch reichhaltige Nährstoffbedingungen unterdrückt, was auf eine dreigliedrige Interaktion zwischen Wirt, Mikrobiota und abiotischer Umgebung hinweist. Eine synthetische Mikrobiota bestehend aus 48 kultivierbaren Bakterienstämmen aus der Blattendosphäre gesunder Arabidopsis-Pflanzen konnte die Immunkompetenz ähnlich wie bei Pflanzen, die mit einer aus dem Boden stammenden Gemeinschaft beimpft wurden, im Wesentlichen wiederherstellen. Im Gegensatz dazu überstimulierte eine 52-köpfige dysbiotische Mikrobiota aus synthetischen Blättern das Immuntranskriptom. Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse Belege für eine kausale Rolle einer eubiotischen Mikrobiota bei der Steuerung der richtigen Immunkompetenz und altersabhängigen Immunität in Pflanzen.

Die ober- und unterirdischen Teile von Landpflanzen beherbergen eine Vielzahl von Mikroorganismen, die zusammen die pflanzliche Mikrobiota bilden. Mikrobiota-Mitglieder können auf oder in Pflanzen leben und scheinen auf der Phylum-Ebene taxonomisch konserviert zu sein1,2,3,4,5,6,7,8. Die umfassende Erhaltung der pflanzlichen Mikrobiota legt nahe, dass Pflanzen wahrscheinlich Mechanismen entwickelt haben, um die Häufigkeit, Zusammensetzung und Funktion der Mikrobiota auszuwählen und aufrechtzuerhalten, um Homöostase zu erreichen9. Eine korrekt zusammengesetzte Mikrobiota (d. h. eubiotische Mikrobiota) ist wahrscheinlich für die Gesundheit und das Überleben der Pflanzen von entscheidender Bedeutung, da neuere Studien begonnen haben, schädliche Auswirkungen genetisch induzierter dysbiotischer Mikrobiota auf die Pflanzengesundheit aufzudecken10,11,12,13. Obwohl gezeigt wurde, dass einzelne oder Gruppen von Mitgliedern der Mikrobiota die Nährstoffaufnahme, das Wachstum und die Widerstandsfähigkeit gegenüber abiotischem und biotischem Stress verbessern1,2,14,15,16, ist der Beitrag der gesamten einheimischen Mikrobiota einer Pflanze zu Pflanzenfunktionen nicht genau verstanden. Dies ist größtenteils auf schlecht untersuchte Mikroben-Mikroben- und Mikroben-Pflanzen-Interaktionen auf Gemeinschaftsebene zurückzuführen.

Verschiedene Mitglieder der pflanzlichen Mikrobiota können wechselseitige, kommensale oder pathogene Wechselwirkungen mit Pflanzen eingehen. Zum Schutz vor potenziell schädlicher Ausbeutung durch Mikroorganismen haben Pflanzen Zelloberflächen- und intrazelluläre Immunrezeptoren entwickelt, die evolutionär konservierte mikrobenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) oder von Krankheitserregern abgeleitete Effektorproteine ​​erkennen, was zu einer mustergesteuerten Immunität (PTI) oder effektorgesteuerten Immunität führt Immunität (ETI). Während ETI spezifisch für Krankheitserreger zu sein scheint, stellt PTI eine Grundlinie der pflanzlichen Abwehr sowohl gegen pathogene als auch nicht pathogene Mikroben dar und ist für die Aufrechterhaltung einer eubiotischen Phyllosphären-Mikrobiota in Arabidopsis erforderlich, um Dysbiose zu verhindern10,11. Die PTI-Signalisierung wird durch die Wahrnehmung von PAMPs durch in der Plasmamembran lokalisierte Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) ausgelöst17. Beispielsweise ist ein aus bakteriellem Flagellin abgeleitetes 22-Aminosäuren-Epitop (flg22) ein gut charakterisierter Auslöser von PTI und wird vom PRR FLAGELIN-SENSITIVE 2 (FLS2) erkannt (Lit. 18). FLS2 bildet einen Komplex mit dem Co-Rezeptor BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1 (BAK1) (Lit. 19). Phosphorrelais zwischen FLS2, BAK1, BOTRYTIS-INDUZIERTER KINASE 1 (BIK1) und einer MAPK-Kaskade initiieren nachgeschaltete PTI-Signalereignisse, einschließlich der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), Calciumflüssen, der Expression einer großen Reihe verteidigungsbezogener Gene und Zellen Wandumgestaltung und Stomatenverschluss20,21,22,23,24,25. Die Aktivierung von PTI vor einer Infektion kann auch zu einer erhöhten Pathogenresistenz führen26,27.

Altersbedingte Resistenz (ARR) ist ein weithin beobachtetes Phänomen bei Pflanzen, bei denen junge Pflanzen im Vergleich zu älteren Pflanzen eine größere Krankheitsanfälligkeit aufweisen28,29. Dies wird bei vielen Blütenpflanzen gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern beobachtet30. Bei Arabidopsis beispielsweise ist die basale Anfälligkeit junger Pflanzen gegenüber dem Blattbakterienpathogen Pseudomonas syringae pv. Tomaten (Pst) DC3000 ist im Vergleich zu älteren Pflanzen größer31. Eine Hypothese zur Erklärung von ARR beinhaltet das Konzept des Kompromisses zwischen Wachstum und Abwehr: Um die Ressourcenverteilung während eines kräftigen vegetativen Wachstums zu Beginn des Lebens auszugleichen, geben junge Pflanzen dem Wachstum Vorrang vor der Abwehr32,33. Tatsächlich gibt es Hinweise auf direkte molekulare Zusammenhänge zwischen Pflanzenwachstum und Immunität34,35,36, einschließlich gemeinsamer Signalkomponenten mit Doppelfunktion, wie im Fall von PTI und Brassinosteroid-abhängigem Pflanzenwachstum37. Es ist jedoch unklar, ob solche molekularen Zusammenhänge eine alleinige Grundlage für ARR in Pflanzen sind. Im Tierreich führte die Entwicklung gnotobiotischer Tiere wie keimfreier Mäuse dazu, dass Forscher einen wichtigen Beitrag endogener Mikrobiota bei der postnatalen Reifung angeborener Immunantworten bei neugeborenen Tieren entdeckten38,39. Dies erhöht die Möglichkeit, dass pflanzliche Mikrobiota auch zur Reifung der pflanzlichen Immunität beitragen können. Es bleibt jedoch eine offene Frage, ob die altersabhängige Immunität vollständig der Pflanzenentwicklung innewohnt oder ob die Reifung von PTI teilweise das Ergebnis der Besiedlung einer Mikrobiota ist. Darüber hinaus kann das Vorhandensein dysbiotischer mikrobieller Gemeinschaften bei Tieren mit übertriebenen Immunreaktionen verbunden sein, die schwächende klinische Folgen haben40. Genetisch bedingte und natürlich vorkommende dysbiotische Mikrobengemeinschaften wurden kürzlich in Pflanzen beschrieben10,41,42, es ist jedoch nicht klar, ob dysbiotische Mikrobiota in Pflanzen mit überaktiven Immunantworten verbunden sind. Die Beantwortung dieser grundlegenden Fragen des Mikrobioms erfordert die Entwicklung geeigneter gnotobiotischer Pflanzenwachstumssysteme und die Etablierung gut charakterisierter normaler (eubiotischer) und dysbiotischer mikrobieller Gemeinschaften.

In einer kürzlich durchgeführten Studie berichteten wir über zwei torfbasierte gnotobiotische Pflanzenwachstumssysteme, FlowPot und GnotoPot43, und zwei synthetische Bakteriengemeinschaften, eine eubiotische Gemeinschaft aus gesunden Arabidopsis-Blättern und eine dysbiotische Gemeinschaft aus Blättern des Arabidopsis-min7-fls2-efr-cerk1-(mfec)-Vierfachs Mutante, der die Fähigkeit fehlt, eine eubiotische endophytische Bakteriengemeinschaft aufrechtzuerhalten10. Hier haben wir diese Tools eingesetzt, um Fragen zur Rolle des endogenen Mikrobioms bei der Entwicklung von ARR und einer möglichen Rolle der Eubiose bei der Steuerung der richtigen pflanzlichen Basalimmunität zu beantworten.

Wir begannen dieses Projekt mit der Charakterisierung der möglichen Reifung von PTI im Laufe der Zeit in konventionell angebauten Arabidopsis-Pflanzen. Zu diesem Zweck führten wir die klassischen flg22-Schutztests mit 2,5 Wochen alten und 3,5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen durch, die konventionell in einem Blumenerdesubstrat in Wachstumskammern mit Luftzirkulation gezüchtet wurden. Bei 2,5 Wochen alten Pflanzen beobachteten wir bei flg22-behandelten Pflanzen im Vergleich zu scheinbehandelten Pflanzen ein mäßiges Maß an flg22-vermittelter Resistenz gegen das virulente Pst DC3000. Ältere, 3,5 Wochen alte Pflanzen zeigten jedoch im Vergleich zu 2,5 Wochen alten Pflanzen ein deutlich erhöhtes Maß an flg22-ausgelöster Resistenz (Abb. 1a). Dieses Ergebnis zeigte eine altersabhängige Entwicklung von PTI bei im Boden gewachsenen Arabidopsis-Pflanzen, was mit einer aktuellen Studie übereinstimmt, die zeigt, dass die FLS2-abhängige Immunität in den ersten 6 Tagen des Wachstums junger Sämlinge in Agarmedium ohne Mikroben zunahm.

a, flg22-Schutztest, der eine erhöhte Resistenz gegen Pst DC3000 zeigt, ausgelöst durch Vorbehandlung mit 500 nM flg22 in 2,5 Wochen alten und 3,5 Wochen alten Pflanzen. Jeder Balken stellt den mittleren (± Standardabweichung) Bakterientiter 24 Stunden nach der Inokulation als logarithmisch transformierte KBE cm−2 (n = 6 Pflanzen) dar. Verschiedene Buchstaben über den Balken stellen einen signifikanten Unterschied dar (P < 0,05, zweifache Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys ehrlichem signifikanten Unterschied (HSD) Post-hoc-Test). b, Altersabhängiger flg22-Schutz. AX- oder HO-Pflanzen wurden 24 Stunden vor der Inokulation mit Pst DC3000 entweder mit Wasser (Schein) oder 100 nM flg22-Lösung behandelt. Jeder Balken stellt den mittleren (± Standardabweichung) Bakterientiter 24 Stunden nach der Inokulation als logarithmisch transformierte KBE cm−2 (n = 3 Pflanzen) dar. Unterschiedliche Buchstaben stellen einen signifikanten Unterschied dar (P < 0,05, zweifaktorielle ANOVA mit Tukeys HSD-Post-hoc-Test). c, Relativer Schutz, angezeigt als fache Änderung der Bakterienzellzahl zwischen flg22- und scheinbehandelten Proben. Abgeleitet aus den in b quantifizierten absoluten Zählungen. Fehlerbalken stellen SD dar. Verschiedene Buchstaben stellen einen signifikanten Unterschied dar (P < 0,05, Zwei-Wege-ANOVA mit Tukeys HSD-Post-hoc-Test). d, e, basale (d) und flg22-induzierte (e) altersabhängige FRK1-Genexpression in 3,5 Wochen alten und 5,5 Wochen alten AX- und HO-Pflanzen. Die Gesamt-RNA wurde 4 Stunden nach der Behandlung mit einer Scheinlösung ohne flg22 für die Basalexpression oder 100 nM flg22 für die flg22-induzierte Expression extrahiert. Die Expressionsniveaus werden für beide Panels im Verhältnis zu scheinbehandelten 3,5 Wochen alten HO-Pflanzen angezeigt. Zur Normalisierung wurde PP2AA3 verwendet. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (n = 4 Pflanzen) dar. Unterschiedliche Buchstaben stellen einen signifikanten Unterschied dar (P < 0,05, zweifaktorielle ANOVA mit Tukeys HSD-Post-hoc-Test). a–e: Die Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die genauen P-Werte für alle Vergleiche sind in den Quelldaten aufgeführt.

Quelldaten

Traditionell wird altersbedingter Widerstand auf Entwicklungsübergangsprozesse zurückgeführt45. Wir untersuchten eine zusätzliche Hypothese, dass das endogene Mikrobiom an der altersabhängigen PTI in Pflanzen beteiligt sein könnte. Zu diesem Zweck untersuchten wir die zeitliche Reifung der flg22-vermittelten Resistenz in torfbasierten gnotobiotischen Pflanzenwachstumssystemen. Holoxenische (HO) Pflanzen, die mit einer natürlichen, aus dem Boden stammenden Mikrobengemeinschaft („MSU“, gesammelt aus landwirtschaftlichem Boden an der Michigan State University, East Lansing, Michigan; siehe Methoden) und entsprechenden axenischen (AX) Pflanzen besiedelt wurden, die scheingeimpft wurden mit autoklavierter „mikrobieller Gemeinschaft, die aus demselben „MSU“-Boden stammt“, verwendet. Wie in Abb. 1b, c gezeigt, zeigten H O-Pflanzen im Laufe der Zeit eine zunehmend robustere flg22-vermittelte Resistenz gegen Pst DC3000, was mit dem altersabhängigen PTI übereinstimmt, der bei konventionell in Blumenerde angebauten Pflanzen beobachtet wurde (Abb. 1a). Im Gegensatz dazu war der altersabhängige flg22-vermittelte Resistenzphänotyp bei AX-Pflanzen, die mit der autoklavierten Mikrobengemeinschaft scheingeimpft wurden, stark reduziert (Abb. 1b, c). Die Arabidopsis-Mutante bak1-5 bkk1-1 cerk1 (bbc) (Lit. 46), deren PTI-Signalisierung stromabwärts mehrerer PRRs, einschließlich des flg22-Rezeptors FLS2, defekt ist, zeigte in HO-Pflanzen in keinem Alter eine flg22-vermittelte Resistenz (Erweitert). Daten Abb. 1), was darauf hindeutet, dass eine durch Mikrobiota vermittelte altersabhängige Resistenz kanonische PTI-Signal-Co-Rezeptoren erfordert.

Als nächstes quantifizierten wir die Induktion des PTI-Markergens FLG22-INDUCED RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (FRK1), um die altersabhängige Aktivierung von PTI in HO-Pflanzen und deren offensichtliches Fehlen in AX-Pflanzen weiter zu charakterisieren. Während die Grundexpression von FRK1 sowohl für 3,5 als auch für 5,5 Wochen alte HO-Pflanzen ähnlich war (Abb. 1d), induzierte flg22 in alten HO-Pflanzen ein höheres Maß an FRK1-Expression als in jüngeren HO-Pflanzen (Abb. 1e). Interessanterweise war die Basalexpression von FRK1 in AX-Pflanzen im Vergleich zu jungen oder alten HO-Pflanzen geringer (Abb. 1d), und insbesondere wurde in AX-Pflanzen kein signifikanter altersabhängiger Anstieg der flg22-induzierten FRK1-Expression beobachtet (Abb. 1e). . Somit korreliert die verringerte altersabhängige Reifung von PTI in AX mit dem Fehlen eines starken Anstiegs der altersabhängigen Expression des FRK1-Gens.

Um die genomweite Genexpression in AX- und HO-Pflanzen über das FRK1-Markergen hinaus zu erfassen, führten wir eine Transkriptomanalyse von AX- und HO-Arabidopsis-Pflanzen durch, die im gnotobiotischen Torfsystem gezüchtet wurden. Um die Möglichkeit einer gemeinschaftsspezifischen Verzerrung aufgrund der Verwendung einer einzelnen Mikrobiota zu verringern, wurden mikrobielle Gemeinschaften aus zwei unterschiedlichen Böden verwendet: „MSU“, das als Alfisol-Bodentyp gesammelt wurde, und „Malaka“, das aus ungestörten Böden gesammelt wurde Grünlandboden in Malaka Township, Iowa (siehe Methoden) und ist ein Mollisol-Boden. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) der RNA-seq-Genexpressionsdaten ergab unterschiedliche Expressionsmuster zwischen HO-Pflanzen und AX-Pflanzen (PC1, 26 % Varianz; Abb. 2a). Mit |log2FC| ≥ 1 und einer Falscherkennungsrate (FDR) < 0,05 Cut-off identifizierten wir insgesamt 435 differentiell exprimierte Gene (DEGs) zwischen HO- und AX-Pflanzen über beide Mikrobiota-Inputs hinweg: 352 waren in AX-Pflanzen abgereichert und 83 waren in AX-Pflanzen angereichert (Abb. 2b, c und ergänzende Daten 1). Von den 352 in AX-Pflanzen abgereicherten DEGs waren 138 unabhängig von der Mikrobiota-Eingabequelle abgereichert (d. h. angereichert sowohl in von der „MSU“-Gemeinschaft besiedelten HO-Pflanzen als auch in von der „Malaka“-Gemeinschaft besiedelten HO-Pflanzen; Abb. 2d). Die Begriffsanreicherungsanalyse der Genontologie (GO) dieser 138 „Kern“-AX-depletierten Gene ergab eine Überrepräsentation von Begriffen, die an der Pflanzenimmunität beteiligt sind (Abb. 2e und ergänzende Daten 2). Die in AX-Pflanzen angereicherten Gene zeigten keine signifikante Anreicherung des GO-Terms. Eine genauere Untersuchung abgereicherter DEGs in AX-Pflanzen ergab zahlreiche Gene, die an PTI, der durch das Abwehrhormon Salicylsäure (SA) vermittelten Abwehr und der verteidigungsassoziierten Metabolitenbiosynthese beteiligt sind (Abb. 2c und ergänzende Daten 1). Zu diesen Genen gehörten FRK1; mehrere Leucin-reiche Wiederholungsproteinkinasen wie IMPAIRED OOMYCETE SUSCEPTIBILITY 1 (IOS1), AT1G51890, AT1G51790, AT1G51860 und AT5G59680; systemische Immunitäts-assoziierte Gene AZELAIC ACID INDUCED 1 (AZI1) und AZI3; PATHOGENESE BEZOGEN 2 (PR2) und PR4; Glucosinolat-Biosynthesegene wie FAD-LINKED OXIDOREDUCTASE (FOX1) und die Cytochrom-P450-Monooxygenasen CYP71A12 und CYP71B15; und verteidigungsassoziierte Transkriptionsfaktoren MYB15 und WRKY 30 (Abb. 2c und ergänzende Daten 1). In Übereinstimmung mit der in Abb. 1d gezeigten gezielten FRK1-Genexpressionsanalyse wiesen die Ergebnisse der Transkriptomanalyse unter Verwendung zweier unabhängiger aus dem Boden stammender Mikrobiota auf eine weitgehend verminderte PTI/SA-Abwehrgenexpression in AX-Pflanzen im Vergleich zu HO-Pflanzen hin, die gemeinsam dazu beitragen zur induzierten und basalen angeborenen Immunität.

a, PCA-Analyse von Genen, die unter AX- und HO-Bedingungen exprimiert werden, unter Verwendung mikrobieller Gemeinschaften von zwei verschiedenen Standorten/Bodentypen („MSU“: Michigan, Alfisol-Bodentyp; „Malaka“: Iowa, Mollisol-Bodentyp). b, Vulkandiagramm der DEGs. Farbige Bereiche stellen einen signifikanten Differentialausdruck mit |log2FC| dar > 1 und FDR < 0,05 Cut-off (Benjamini-Hochberg-korrigierter Wald-Test), wobei die Anzahl der Gene, die jeder Gruppe entsprechen, in Klammern angegeben ist. c, Wärmekarte von DEGs, die mithilfe hierarchischer Clusterbildung mit euklidischem Abstand und vollständiger Verknüpfung erstellt wurden. Das hochgestellte Etikett weist auf die Gemeinschaft hin, die zur Inokulation von HO-Pflanzen oder zur Schein-Inokulation von AX-Pflanzen verwendet wird. Rechts ist eine Teilmenge der unterschiedlich regulierten Gene in HO und AX dargestellt. d, Venn-Diagramm hochregulierter DEGs zeigte 138 gemeinsame Gene als Reaktion auf HOMSU- und HOMalaka-Behandlungen. e, GO-Terminreicherungsanalyse (GO:BP biologischer Prozess) an „Kern“-depletierten DEGs in AX-Pflanzen. Am häufigsten angezeigte angereicherte GO-Begriffe, sortiert nach Signifikanz (FDR < 0,05 Cut-off). a–e, n = 3 biologisch unabhängige Pflanzenproben pro Bedingung.

Zusätzlich zur verminderten Immungenexpression stellten wir fest, dass AX-Pflanzen im Vergleich zu HO-Pflanzen deutlich geringere Mengen anderer PTI-assoziierter Immunantworten zeigten. Beispielsweise zeigten 6 Wochen alte AX-Pflanzen im Vergleich zu HO-Pflanzen eine deutlich verringerte flg22-, elf18- und Pep1-induzierte ROS-Produktion, sowohl in der Größe der maximalen ROS-Produktion (Spitzenamplitude) als auch in der Zeit bis zum Erreichen des Maximums (Abb . 3a und erweiterte Daten Abb. 2). AX-Pflanzen zeigten im Vergleich zu HO-Pflanzen auch eine signifikant verringerte PAMP/DAMP-induzierte FRK1-Genexpression (Abb. 3b). Die Western-Blot-Analyse ergab, dass trotz ähnlicher Gesamt-MPK3- und MPK6-Werte (Abb. 3c, d) in AX-Pflanzen nach der Aktivierung von PTI durch Behandlung mit flg22 weniger MPK phosphoryliert wurde (Abb. 3e). Obwohl die Analyse der reversen Transkription und der quantitativen Polymerasekettenreaktion (RT-qPCR) durchgängig zeigte, dass sowohl die basale als auch die flg22-induzierte Expression des FLS2-Rezeptorgens im Blattgewebe der AX-Pflanze im Vergleich zum Blattgewebe der HO-Pflanze insgesamt signifikant verringert ist (Abb. 3f). Die FLS2-Proteinhäufigkeit war variabel und in AX-Pflanzenblättern nur gelegentlich verringert (Erweiterte Daten, Abb. 3). Im Gegensatz dazu wurde das Co-Rezeptor-BAK1-Protein in AX-Pflanzen im Vergleich zu HO-Pflanzen durchweg in geringerer relativer Häufigkeit gefunden (Abb. 3g). Darüber hinaus ergab die Quantifizierung des Abwehrhormons SA, das der PTI-Signalisierung nachgeschaltet ist, dass AX-Pflanzen im Vergleich zu HO-Pflanzen niedrigere SA-Grundwerte aufweisen (Extended Data Abb. 4a, b). Schließlich waren AX-Pflanzen im Vergleich zu HO-Pflanzen überempfindlich gegenüber Infektionen durch den virulenten hemibiotrophen Blattbakterienpathogen Pst DC3000 und den nekrotrophen Pilzpathogen B. cinerea (Abb. 3h, i). Zusammengenommen zeigen diese Studien mehrere beeinträchtigte PTI-Immunphänotypen in axenischen Pflanzen.

a, ROS-Burst-Dynamik, induziert durch 250 nM flg22, elf18 und Pep1 in AX- und HO-Pflanzen in GnotoPots. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (n = 8 Pflanzen). b: FRK1-Genexpression in AX- und HO-Pflanzen, induziert durch 250 nM flg22, elf18 und Pep1. Die Gesamt-RNA wurde 1,5 Stunden nach der Behandlung aus den Blattscheiben extrahiert. Balken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (n = 8 Pflanzen; flg22 P = 0,009, elf18 P = 0,017, Pep1 P = 0,034; Zwei-Wege-ANOVA mit Šidáks Mehrfachvergleichstest). c,d, Repräsentative Blots der gesamten MPK3- (c) oder MPK6-Proteine ​​(d) in 4,5 Wochen alten AX- und HO-Pflanzen. Protein wurde mit MPK3- oder MPK6-spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Die Zahlen geben die Bandenintensität relativ zu der von Ponceau S an, normalisiert auf HO = 1,00. e, Repräsentativer Blot phosphorylierter MPK3/6-Proteine, nachgewiesen unter Verwendung eines α-p44/42-ERK-Antikörpers nach Behandlung mit 100 nM flg22. Zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Behandlung wurden Proben entnommen. f, Basale und flg22-induzierte Expression des FLS2-Gens im AX- und HO-Pflanzenblattgewebe. Die Gesamt-RNA wurde 1 Stunde nach der Behandlung mit 100 nM flg22 oder Scheinlösung extrahiert. Balken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (n = 3 biologisch unabhängige Pflanzenproben). Unterschiedliche Buchstaben stellen einen signifikanten Unterschied dar (P < 0,05, zweifaktorielle ANOVA mit Tukeys HSD-Post-hoc-Test). g, Gesamt-BAK1-Protein, nachgewiesen in Blattlysaten von AX- und HO-Pflanzen. Die Zahlen geben die Bandenintensität relativ zu Amido Black an, normalisiert auf HO = 1,00. h, Pst DC3000-Populationen in AX- und HO-Pflanzen. Jeder Balken stellt den mittleren (± Standardabweichung) Bakterientiter 3 Tage nach der Inokulation als logarithmisch transformierte KBE cm−2 (n = 3 Pflanzen) dar. P = 0,0006, zweiseitiger ungepaarter t-Test. i, Größe der von B. cinerea in AX- und HO-Pflanzen gebildeten Läsionen. Jeder Balken stellt den mittleren (± SD) Läsionsdurchmesser 5 Tage nach der Inokulation dar (n = 6 Pflanzen). P = 2,26 × 10−6, zweiseitiger ungepaarter t-Test. a–i, Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. b,f, Genaue P-Werte für alle Vergleiche sind in den Quelldaten aufgeführt. c–e,g, siehe Quelldaten zum Bildzuschneiden.

Quelldaten

Wir haben kürzlich ein 48-köpfiges eubiotisches SynCom (SynComCol-0) zusammengestellt, das aus endophytischen Bakterien aus Blättern gesunder Arabidopsis Col-0-Pflanzen besteht10. Um festzustellen, inwieweit ein aus der Blattendosphäre gewonnenes eubiotisches SynCom die Immunkompetenz von AX-Pflanzen wiederherstellen könnte, verglichen wir die PTI-Phänotypen von Col-0-Pflanzen, die mit und ohne SynCom gezüchtet wurden (SynComCol-0 vs. MgCl2). Als Kontrolle wurden Col-0-Pflanzen verwendet, die mit der aus dem Boden stammenden Mikrobiota „MSU“ gezüchtet wurden. Wir beobachteten eine robuste flg22-induzierte Produktion von ROS in H O -Pflanzen, die mit den aus dem Boden stammenden Mikrobiota „MSU“ und mit SynComCol-0 inokulierten Pflanzen geimpft wurden (Abb. 4a und erweiterte Daten Abb. 5a). Als nächstes quantifizierten wir die flg22-induzierte FRK1-Genexpression und beobachteten, dass mit SynComCol-0 besiedelte Pflanzen ihre basale und flg22-induzierte FRK1-Expression wiederherstellten (Abb. 4b, c), was wiederum dem für HO-Pflanzen beobachteten ähnelte (Abb. 1d). ,e). Darüber hinaus wiesen mit SynComCol-0 besiedelte Pflanzen einen erhöhten Gehalt an BAK1-Protein auf (Extended Data Abb. 5b) und waren resistenter gegen eine Pst DC3000-Infektion (Abb. 4d) im Vergleich zu AX-Pflanzen, die mit dem gleichen Volumen von 10 mM scheingeimpft wurden MgCl2. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ein aus der Blattendosphäre stammendes bakterielles SynCom die Immunkompetenz von AX-Pflanzen im Wesentlichen wiederherstellen kann, ähnlich wie eine natürliche, aus dem Boden stammende Mikrobiota.

a, ROS-Burst-Dynamik, induziert durch 100 nM flg22 in axenischen Pflanzen, die mit 10 mM MgCl2 scheingeimpft wurden, und Pflanzen, die mit HO oder SynComCol-0 besiedelt wurden. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (n = 12 Pflanzen). b, c, basale (b) und flg22-induzierte (c) FRK1-Expression in axenischen MgCl2-scheininokulierten Pflanzen und Pflanzen, die mit SynComCol-0 inokuliert wurden. Die Gesamt-RNA wurde 3 Stunden nach der Behandlung mit einer Scheinlösung ohne flg22 (b) oder 100 nM flg22 (c) extrahiert. Ergebnisse relativ zur Basalexpression in mit SynComCol-0 inokulierten Pflanzen. Zur Normalisierung wurde PP2AA3 verwendet. Balken stellen den mittleren (± Standardabweichung) Expressionswert dar (n = 3 Pflanzen). Basalausdruck P = 0,0011; flg22-induzierter P = 0,0006, zweiseitiger ungepaarter t-Test. d, Pst DC3000-Populationen in mit 10 mM MgCl2 scheingeimpften axenischen Pflanzen und mit SynComCol-0 geimpften Pflanzen. Jeder Balken stellt den mittleren (± Standardabweichung) Bakterientiter 3 Tage nach der Inokulation als logarithmisch transformierte KBE cm−2 (n = 4 Pflanzen) dar. P = 4,80 × 10−5, zweiseitiger ungepaarter t-Test. a–d, Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Quelldaten

Um die mögliche Redundanz von SynComCol-0-Mitgliedern als Beitrag zur Immunkompetenz zu bewerten, haben wir eine vereinfachte Version von SynComCol-0 mit nur 19 Stämmen (SynComCol-mix19) zusammengestellt, um die taxonomische Vielfalt auf Gattungsebene abzudecken (Supplementary Data 3). Wir fanden heraus, dass SynComCol-mix19 die ROS-Produktion als Reaktion auf flg22 effektiv wiederherstellen konnte (Extended Data Abb. 6). Darüber hinaus haben wir unter Stämmen mit hoher Repräsentation in SynComCol-0 zufällig eine Mischung aus drei Stämmen ausgewählt, die in SynComCol-mix19 vorhanden sind, und festgestellt, dass diese drei Stämme (SynComCol-mix3, die die Gattungen Achromobacter, Comamonas und Stenotrophomonas repräsentieren) auch ROS teilweise wiederherstellten Produktion als Reaktion auf flg22 (Extended Data Abb. 6). Dies deutet darauf hin, dass es möglicherweise eine erhebliche Redundanz zwischen SynComCol-0-Stämmen gibt, die Immunkompetenz verleihen können.

Während der Entwicklung und Optimierung des torfbasierten gnotobiotischen Systems stellten wir einen Zusammenhang zwischen dem Grad der durch Mikrobiota vermittelten Wiederherstellung der Immunkompetenz und den Konzentrationen von Linsmaier- und Skoog47 (LS)-Nährmedien (die Mineralsalze sowie einige organische Verbindungen wie z. B. enthalten) fest als Myoinositol- und MES-Puffer; siehe Methoden zum Nährstoffgehalt), die während der Vorbereitung des gnotobiotischen Systems hinzugefügt werden. Um die Auswirkungen von Nährstoffen auf die durch Mikrobiota vermittelte Immunkompetenz systematisch zu bestimmen, haben wir die flg22-induzierte Produktion von ROS in AX- und HO-Pflanzen entlang eines Nährstoffkonzentrationsgradienten gemessen. Unter Verwendung des gleichen Flüssigkeitsvolumens wurden GnotoPots mit LS voller Stärke (1x), LS halber Stärke (0,5x) und einem Zehntel LS (0,1x) zubereitet. Wir beobachteten einen signifikanten Einfluss von Nährstoffen auf die flg22-vermittelte ROS-Produktion in HO-Pflanzen. Eine Verringerung der Nährstoffstärke erhöhte die Stärke des ROS-Ausbruchs deutlich und verkürzte die Zeit bis zum Erreichen der maximalen ROS-Produktion (Abb. 5a) in HO-Pflanzen. Bei mittleren Nährstoffkonzentrationen (0,5x LS) war die Stärke des ROS-Ausbruchs moderat erhöht und die Zeit bis zum Erreichen des Maximums verkürzt im Vergleich zu höheren Nährstoffkonzentrationen (1x LS), aber die insgesamt erzeugten ROS unterschieden sich nicht signifikant (Abb. 5a und erweiterte Daten). Abb. 7a). Bei niedrigen Nährstoffgehalten (0,1x LS) war die Stärke des ROS-Ausbruchs erhöht, die Zeit bis zum Maximum verkürzte sich und die Gesamt-ROS stiegen (Abb. 5a und erweiterte Daten Abb. 7a). Die Nährstoffkonzentration hatte keinen Einfluss auf den Zeitpunkt der ROS-Produktion in AX-Pflanzen und es wurde nur ein marginaler Einfluss auf die gesamte ROS-Produktion beobachtet. Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen einzelner Komponenten des LS-Mediums, einschließlich Stickstoff, Phosphor und Eisen sowie der kohlenstoffhaltigen Verbindungen Myo-Inositol und MES, auf die durch Mikrobiota vermittelte Immunkompetenz, indem wir 0,5x LS mit jedem Nährstoff/jede Verbindung in der vorhandenen Konzentration ergänzten in 1x LS. Nur 1x Stickstoff (bereitgestellt als NH4NO3- und KNO3-Salze) unterdrückte die durch flg22 induzierte ROS-Produktion und FRK1-Genexpression in HO-Pflanzen auf ähnliche Werte wie 1x LS (Extended Data Abb. 7b – d), was darauf hinweist, dass ein hoher N-Gehalt eine wichtige Rolle spielt Unterdrückung der durch Mikrobiota vermittelten Immunkompetenz.

a, ROS-Burst-Dynamik, induziert durch 100 nM flg22 in AX- und HO-Pflanzen, die in GnotoPots gezüchtet wurden, die mit 0,1-fachen, 0,5-fachen oder 1-fachen LS-Nährlösungskonzentrationen versorgt wurden. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (n = 6 Pflanzen). b, Absolute Häufigkeit von Phyllosphären-Bakterienpopulationen, die mit HO-Pflanzen assoziiert sind, die in GnotoPots gezüchtet werden, die entweder mit 0,5x oder 1x LS-Nährlösung versorgt werden. Jeder Balken stellt den mittleren (± Standardabweichung) Bakterientiter als logarithmisch transformierte KBE cm−2 dar (n = 12 Pflanzen). P = 6,20 × 10−5, zweiseitiger ungepaarter t-Test. a,b, Experimente wurden mindestens zwei unabhängige Male mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. c, PCoA gewichteter UniFrac-Abstände, erhalten aus 16S-rRNA-Gensequenzprofilen von aus dem Boden stammenden Input-Mikrobiota (MSU) und Phyllosphären-Mikrobiota von HO-Pflanzen nach 6-wöchigem Wachstum in GnotoPots, die entweder mit 0,5x oder 1x LS-Nährlösung (0,5x LS) versorgt wurden vs. 1x LS: q = 0,002, 0,5x LS vs. Eingabe: q = 0,002, 1x LS vs. Eingabe: q = 0,002; paarweise permutationelle multivariate ANOVA mit 999 Permutationen). d, Relative Häufigkeit von Bakterienpopulationen auf Stammebene. Mitglieder der Proteobacteria phylum werden in Klassen unterteilt und Mitglieder der Gammaproteobacteria-Klasse werden weiter in die Reihenfolge unterteilt. c,d, n = 5 biologisch unabhängige Bodenproben (Eingabe), n = 12 Pflanzen (0,5x LS), n = 12 Pflanzen (1x LS).

Quelldaten

Um festzustellen, ob die mikrobielle Besiedlung durch den Nährstoffgehalt beeinflusst wird, haben wir die absolute und relative Häufigkeit der bakteriellen Mikrobiota der Phyllosphäre mithilfe der Zählung kultivierbarer Bakterien und der Sequenzierung des 16S-ribosomalen (r)RNA-Gen-Amplikons in Pflanzen, ergänzt mit 0,5x LS oder 1x LS, bestimmt. Pflanzen, die mit 1x LS gezüchtet wurden, wiesen im Vergleich zu Pflanzen, die mit 0,5x LS gezüchtet wurden, etwa 10-fach geringere Mikrobiota-Gesamtwerte der Phyllosphärenbakterien auf (Abb. 5b). Die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) auf gewichteten UniFrac-Abständen zeigte einen signifikanten Unterschied in der Zusammensetzung zwischen den Phyllosphären-Bakteriengemeinschaften, die mit Pflanzen assoziiert sind, die unter den beiden Nährstoffniveaus wachsen (Abb. 5c). Es wurde beobachtet, dass Actinobacteriota, Bacteroidota und Gammaproteobactera (die zur Ordnung Pseudomonadales gehören) in der Phyllosphäre von Pflanzen, die mit 0,5x LS gezüchtet wurden, häufiger vorkommen, wohingegen ihre relative Häufigkeit bei Pflanzen, die mit 1x LS gezüchtet wurden, stark reduziert war. Umgekehrt nahm die relative Häufigkeit von Gammaproteobakterien der Ordnung Burkholderiales in Pflanzen zu, die mit 1x LS gezüchtet wurden, im Vergleich zu Pflanzen, die mit 0,5x LS gezüchtet wurden (Abb. 5d). Zusammengenommen veranschaulichen diese Ergebnisse eine dreigliedrige Interaktion zwischen Immunität, Mikrobiota und Umwelt während der mikrobiotavermittelten Reifung der durch flg22 ausgelösten Immunität.

Mehrere neuere Berichte haben begonnen, einen wichtigen Beitrag der Pflanzenimmunität, einschließlich PTI und vesikulärer Transportwege, zur Aufrechterhaltung der Mikrobiota-Homöostase in Arabidopsis-Blättern zu zeigen1,10,11. Insbesondere konnten wir zwei parallele, aus der Endosphäre der Blätter stammende bakterielle SynComs etablieren: 48-köpfiges SynComCol-0, das aus gesunden Col-0-Blättern stammt, und 52-köpfiges SynCommfec, das aus dysbiotischen mfec-Mutantenblättern stammt10. Um den Einfluss einer normalen (eubiotischen) Mikrobiota im Vergleich zu einer dysbiotischen Mikrobiota auf die Pflanzenimmunität zu untersuchen, untersuchten wir die Expression mehrerer immunitätsassoziierter Markergene (FRK1, PR1 und CYP71A12) in mit SynCommfec oder SynComCol-0 besiedelten Pflanzen im Vergleich zu AX Pflanzen in einem plattenbasierten gnotobiotischen System. Wir fanden einen Expressionsgradienten dieser Gene, wobei die höchste Expression in mit SynCommfec besiedelten Col-0-Pflanzen beobachtet wurde, ein mittleres Niveau in mit SynComCol-0 besiedelten Pflanzen und das niedrigste Niveau in AX-Pflanzen (Abb. 6a – c).

a–c, Basale Expression der verteidigungsbezogenen Gene FRK1 (a), CYP71A12 (b) und PR1 (c) in mit AX, SynComCol-0 und SynCommfec inokulierten Pflanzen, die auf Agarplatten gezüchtet wurden. Zur Normalisierung wurde PP2AA3 verwendet. Balken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (n = 4 biologisch unabhängige Pflanzenproben). Unterschiedliche Buchstaben stellen einen signifikanten Unterschied dar (P < 0,05, einfaktorielle ANOVA mit Tukeys HSD-Post-hoc-Test). d, Vulkandiagramm der Gene, die in mit SynComCol-0 und SynCommfec kolonisierten Pflanzen unterschiedlich exprimiert werden. Farbige Bereiche stellen einen signifikanten Differentialausdruck mit |log2FC| dar > 1 und FDR < 0,05 (Benjamini-Hochberg-korrigierter Wald-Test), wobei die Anzahl der Gene, die jeder Gruppe entsprechen, in Klammern angegeben ist. e, GO-Terminus-Anreicherung für hochregulierte DEGs in mit SynCommfec besiedelten Pflanzen im Vergleich zu mit SynComCol-0 besiedelten Pflanzen, geordnet nach Signifikanz (FDR < 0,05 Cut-off). f, Heatmap für ausgewählte Gene aus der hierarchischen Clusterung aller DEGs. Genbeschreibungen sind in den Zusatzdaten 4 aufgeführt. d–f, n = 3 biologisch unabhängige Pflanzenproben pro Bedingung.

Quelldaten

Um ein besseres Verständnis der Transkriptionsreaktionen von Pflanzen auf eubiotische Mikrobiota im Vergleich zu dysbiotischen Mikrobiota zu erlangen, führten wir eine RNA-Seq-Analyse von Col-0-Pflanzen durch, die mit SynCommfec und SynComCol-0 parallel im GnotoPot-System besiedelt wurden. Die Kolonisierung mit SynComCol-0 im Vergleich zu SynCommfec führte zu 774 Grad (|log2FC| > 1 und FDR <0,05) (Abb. 6d und ergänzende Daten 4). Die GO-Termanalyse der 609 DEGs, die bei der Kolonisierung mit SynCommfec im Vergleich zu SynComCol-0 hochreguliert wurden, zeigte eine Überrepräsentation der GO-Terme, die mit biotischem Stress und Immunität verbunden sind (Abb. 6e und ergänzende Daten 5). Darüber hinaus wurden mehrere Immunitätswege, einschließlich der systemisch erworbenen Resistenz, der PTI-Signalisierung und der Glucosinolat-Biosyntheseprozesse, hochreguliert. Weitere Analysen zeigten, dass mehrere Dysbiose-assoziierte Gene an pathogenetischen Prozessen bei biotischem Stress beteiligt waren, die mit Immunität, Zelltod und seiner Regulation verbunden sind (Abb. 6f). Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse, dass das Dysbiotikum SynCommfec die Immungenexpression im Vergleich zum Eubiotikum SynComCol-0 überstimuliert.

Als nächstes untersuchten wir die Fähigkeit einzelner SynCom-Mitglieder, die Immunstimulation zu verstärken. Um die Analyse der Immungenexpression bei einer großen Anzahl von Mikrobiota-Stämmen (48 SynComCol-0-Stämme und 52 SynCommfec-Stämme) zu erleichtern, führten wir zunächst qualitative β-Glucuronidase (GUS)-Tests mit 12 Tage alten Sämlingen des CYP71A12Pro:GUS durch Reporterlinie, gezüchtet in flüssigem LS-Medium, das mit jedem der 100 einzelnen SynCom-Mitglieder beimpft wurde. Wir fanden heraus, dass die Stenotrophomonas maltophilia-Stämme sowohl von SynComCol-0 (4 Stämme) als auch von SynCommfec (8 Stämme) den CYP71A12Pro:GUS-Reporter in Blättern induzierten. Darüber hinaus gibt es vier weitere Stämme, die es nur bei SynCommfec gibt, darunter Stenotrophomonas acidaminiphila (mfec-41), Stenotrophomonas sp. (mfec-48), Microbacterium sp. (mfec-31) und Pseudomonas citronellolis (mfec-34) zeigten CYP71A12Pro:GUS-Reporteraktivität in Sämlingsblättern (Extended Data Abb. 8). Somit verfügt SynCommfec über eine größere Anzahl und vielfältigere Stämme, die die CYP71A12-Promotoraktivität in Blättern induzieren können. Anschließend führten wir eine unabhängige RT-qPCR-basierte Analyse der CYP71A12-Genexpression in Blättern von 5 Wochen alten, im Boden gewachsenen Arabidopsis Col-0-Pflanzen durch und zeigten ein Muster der CYP71A12-Genexpression, das dem des CYP71A12Pro:GUS-Reporter-Assays ähnelt , trotz sehr unterschiedlicher Pflanzenwachstumsbedingungen in diesen beiden unabhängigen Experimenten (Ergänzungsdaten 6). Bemerkenswerterweise wurde zuvor gezeigt, dass die meisten der CYP71A12-induzierten SynCom-Mitglieder dysbiotische Symptome verursachen10.

Hier zeigen wir, dass Arabidopsis-Pflanzen, die ohne Kontakt mit Mikrobiota wachsen, stark in der altersabhängigen Immunität beeinträchtigt sind, die bei Pflanzen auftritt, die auf natürliche Weise von Mikrobiota besiedelt werden. Axenisch gewachsene Pflanzen weisen erhebliche PTI-Defekte auf und sind überempfindlich gegenüber Infektionen durch den bakteriellen Erreger Pst DC3000 und den Pilzerreger B. cinerea. Wir zeigen auch, dass die Immunkompetenz durch natürliche, aus dem Boden stammende Mikrobiota sowie eine 48-köpfige synthetische Gemeinschaft eubiotischer Bakterien (SynComCol-0), die aus endophytischen Blattbakterien stammt, wiederhergestellt werden kann. Im Gegensatz dazu überstimuliert eine 52-köpfige dysbiotische synthetische Gemeinschaft, die aus endophytischen Blattbakterien stammt, die Immungenexpression. Schließlich zeigen unsere Ergebnisse, dass die Immunmodulationsfunktion von Mikrobiota durch Umweltbedingungen beeinflusst werden kann. Zusammengenommen haben diese Ergebnisse bemerkenswerte Auswirkungen auf die Formulierung eines Rahmenwerks zur Erklärung der altersabhängigen Immunität, des Zusammenspiels von Mikrobiota und Immunität und der tritrophen Wechselwirkungen zwischen „Immunität, Mikrobiom und Umwelt“ in Pflanzen.

Im Hinblick auf die altersabhängige Immunität charakterisierte eine frühere Studie die Ontogenese der durch flg22 ausgelösten Immunität in sehr jungen Arabidopsis-Sämlingen (innerhalb von 6 Tagen nach der Keimung) in axenischen Nähragarplatten44,48 und lieferte Einblicke in die entwicklungskontrollierte Reifung von Immunantworten sofort nach der Keimung. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen jedoch, dass die durch flg22 ausgelöste Immunität eine altersabhängige Reifungsperiode aufweist, die sich mindestens über die ersten 2–3 Wochen des vegetativen Wachstums erstreckt, und dass eine vollständige altersabhängige Immunreifung die Exposition gegenüber Mikrobiota erfordert. Wie hier gezeigt, entwickelten mit Mikrobiota besiedelte HO-Pflanzen in torfbasierten gnotobiotischen Systemen im Laufe der Zeit altersabhängige PTI, was konventionell in Blumenerde gewachsene Pflanzen widerspiegelt. Im Gegensatz dazu war die Entwicklung altersabhängiger PTI in AX-Pflanzen stark reduziert. Die durch Mikrobiota vermittelte altersabhängige Reifung weist bemerkenswerte konzeptionelle Parallelen zu der bei keimfreien Mäusen beobachteten auf, bei denen ein wichtiger Beitrag endogener Mikrobiota zur postnatalen Reifung der angeborenen Immunität von Säugetieren allgemein anerkannt ist38,39. Während angenommen wird, dass ARR in der Regel durch Entwicklungsprozesse verursacht wird, die Immunantworten antagonisieren,45 zeigen die hier präsentierten Ergebnisse, dass die durch Mikrobiota unterstützte Immunreifung ein bisher unerkannter Faktor ist, der eine wichtige Rolle bei der altersabhängigen Immunreifung in Pflanzen spielt.

Es sollte darauf hingewiesen werden, dass die Entdeckung einer ursächlichen Rolle von Mikrobiota bei der altersabhängigen Immunreifung den Einsatz eines gnotobiotischen Systems erforderte, das in der Lage ist, Pflanzen mit oder ohne eine natürliche oder synthetische Mikrobengemeinschaft zu züchten. Da Agarplatten, ein häufig verwendetes gnotobiotisches System, aufgrund der künstlichen Überwucherung einiger Mikroben nicht ideal für die natürliche Besiedlung von Pflanzen durch eine komplexe mikrobielle Gemeinschaft sind, wurde dies in dieser Studie durch die Verwendung der gnotobiotischen Systeme FlowPot und GnotoPot auf Torfbasis erreicht Substrat, das teilweise dem natürlichen Bodensubstrat nachempfunden ist. Wir verwendeten FlowPots und GnotoPots abwechselnd und einige anfängliche Experimente wurden mit beiden Systemen wiederholt, mit ähnlichen Ergebnissen. Für die meisten nachfolgenden Experimente verwendeten wir GnotoPots, da sie den Pflanzen im Vergleich zu FlowPots43 ein längeres Wachstum ermöglichten. Eine wichtige Erkenntnis während dieser Studie ist, dass torfbasierte pflanzliche gnotobiotische Systeme fein abgestimmt werden können, um eine Reihe verschiedener abiotischer Bedingungen, wie z. B. Nährstoffe, zu simulieren. Dies war für unsere Studie nützlich, da viele der Mikrobiota-Funktionen in der Natur kontextabhängig zu sein scheinen. Beispielsweise hat sich gezeigt, dass eine Düngung mit hohem Stickstoffgehalt die Anfälligkeit von Pflanzen erhöht, die in einem nicht sterilen Hydrokultursystem angebaut werden49. Es war jedoch nicht bekannt, ob die Wirkung stickstoffreicher Nährstoffe teilweise durch Mikrobiota vermittelt wird. In dieser Studie konnten wir durch die Feinabstimmung der Nährstoffbedingungen von GnotoPots entdecken, dass die nährstoffvermittelte Immunsuppression in Gegenwart von Mikrobiota am deutlichsten war und dass ein hoher Stickstoffgehalt einen deutlichen Einfluss auf das Niveau und die Zusammensetzung der Mikrobiota hat, was auf ein komplexes Zusammenspiel zwischen Pflanzen schließen lässt , Mikrobiota und Nährstoffbedingungen.

Jüngste Studien haben begonnen, die Bedeutung des Zusammenspiels von Immunität und Mikrobiom in Pflanzen zu veranschaulichen. Beispielsweise haben wir und andere kürzlich gezeigt, dass PTI-assoziierte PRRs und ROS-erzeugende RBOHD/F wesentliche Bestandteile eines pflanzengenetischen Netzwerks bei der Konfiguration einer normalen eubiotischen Blattmikrobiota sind, um gesundheitsschädliche Dysbiose zu verhindern1,10,11. In ähnlicher Weise stimulieren oder unterdrücken bakterielle Mitglieder sowohl der Blatt- als auch der Wurzelmikrobiota die PTI-assoziierte Genexpression50,51. In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass eine synthetische Gemeinschaft bestehend aus 48 kultivierbaren Arabidopsis-Phyllosphärenbakterien (SynComCol-0) ausreichte, um die Immunkompetenz in den Blättern von AX-Pflanzen auf einem Niveau wiederherzustellen, das dem einer natürlichen, aus dem Boden stammenden Mikrobengemeinschaft verliehen wird. Dies ist interessant, wenn man bedenkt, dass die meisten Mitglieder der Blattbakterien-Mikrobiota auf der Oberfläche leben und weniger als 5 % der Blattbakterien im Inneren der Blätter leben10. Die hier präsentierten Ergebnisse deuten entweder auf die Bedeutung endophytischer Blattbakterien für die Reifung von Immunantworten in Arabidopsis-Blättern oder auf das Vorhandensein mehrerer funktionell redundanter Untergemeinschaften einer bestimmten Mikrobiota hin, wobei jede Untergemeinschaft in der Lage ist, den Pflanzen unabhängig eine Immunreifung zu verleihen. In beiden Szenarien scheint es eine erhebliche Redundanz zwischen verschiedenen Phyllosphärenstämmen bei der Vermittlung von Immunkompetenz zu geben (Erweiterte Daten, Abb. 6).

Die Rolle der Mikrobiota bei der Modulation der Immunkompetenz scheint bei den verschiedenen in unserer Studie verwendeten Pflanzenwachstumsbedingungen robust zu sein. Als wir die Transkriptomprofile von mit SynComCol-0 besiedelten Pflanzen im Vergleich zu natürlichen Mikrobiota (HOMalaka oder HOMSU) im Vergleich zu den entsprechenden axenischen Pflanzen analysierten, wurde jedoch in beiden Fällen eine Anreicherung immunassoziierter Gene beobachtet (Extended Data Abb. 9). Pflanzen wurden unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, einschließlich verschiedener Wachstumssubstratmischungen und Photoperioden (siehe Methoden). Interessanterweise umfassen die in unserer Studie beobachteten angereicherten Immungene 20 sogenannte „General Non-Self-Response“ (GNSR)-Gene, die üblicherweise durch 13 einzelne Stämme aus der At-LSPHERE-Sammlung induziert werden52. Die GNSR-Gene machen 9 % der hochregulierten Gene (20/213) aus, die in dieser Studie häufig in Pflanzen angereichert werden, die mit natürlichen Mikrobiota und SynComCol-0 geimpft wurden. Insgesamt stimmt unsere Studie mit der Existenz einer breiteren Kern-Mikrobiota-assoziierten Transkriptom-Reaktion überein und unterstreicht die Bedeutung einer natürlichen oder eubiotischen Gemeinschaft für die Gestaltung der Transkriptom-Landschaft basaler Immunantworten in Pflanzen.

Eine weitere wichtige Schlussfolgerung aus den Ergebnissen dieser Studie ist, dass Arabidopsis-Pflanzen nicht nur eine Mikrobiota benötigen, um PTI richtig zu entwickeln, sondern auch, dass die Zusammensetzung der Mikrobiota wichtig ist. Wir fanden heraus, dass SynComCol-0, eine eubiotische Mikrobiota, die aus gesunden Arabidopsis-Blättern gewonnen wird, ausreicht, um die Immunkompetenz von AX-Pflanzen wiederherzustellen. Im Gegensatz dazu überstimulierte SynCommfec, eine dysbiotische Mikrobiota, die aus Blättern der Vierfachmutante Arabidopsis mfec stammt, die Immungenexpression (Abb. 6). Diese Beobachtung legt nahe, dass eine gesunde, eubiotische Mikrobiota notwendig ist, um das pflanzliche Immunsystem richtig zu steuern. Wir glauben, dass dies eine wichtige Beobachtung ist, da Dysbiose bei Mensch-Mikrobiom-Interaktionen mit Autoimmunerkrankungen wie entzündlichen Darmerkrankungen, Diabetes, Allergien und anderen Gesundheitsproblemen in Verbindung gebracht wird53,54. Daher scheint ein enges Zusammenspiel zwischen Immunität und Mikrobiota der Kern der Wirt-Mikrobiom-Interaktionen sowohl im Tier- als auch im Pflanzenreich zu sein. Abweichungen von einer eubiotischen Mikrobiota könnten zu einer Immunschwäche (wie im Fall von AX-Pflanzen) oder einer Immunüberstimulation (wie im Fall von mit SynCommfec inokulierten Pflanzen) führen. Somit spielt eine eubiotische Mikrobiota eine grundlegende Rolle bei der Steuerung der pflanzlichen Immunantwort während des Wachstums und der Entwicklung.

Die folgenden Genotypen von Arabidopsis thaliana wurden in dieser Studie verwendet: Col-0, bak1-5 bkk1-1 cerk1-Mutante (bbc) (Lit. 46). Konventionell angebaute Pflanzen wurden unter Verwendung von Blumenerde gezüchtet, die zu gleichen Teilen aus Suremix (Michigan Grower Products), mittlerem Vermiculit und Perlit bestand. Die resultierende Blumenerde wurde einmal autoklaviert, um Schädlinge zu beseitigen. Die Pflanzen wurden in einer Wachstumskammer mit Luftzirkulation unter den folgenden Bedingungen gezüchtet: 60 % relative Luftfeuchtigkeit, 22 °C, 12 Stunden Tag/12 Stunden Nacht-Photoperiodenzyklus, tagsüber Photonenfluss von ~90–100 μmol m−2 s−1 und Ergänzung mit 0,5x Hoagland-Nährlösung55 nach Bedarf.

Für Experimente mit torfbasierten gnotobiotischen Systemen43 wurden Pflanzen in FlowPots oder GnotoPots gezüchtet. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Nährstoffe mit gepuffertem 0,5x LS-Flüssigmedium (pH 5,7) (Caisson Labs) ergänzt. LS in voller Stärke enthält 1.900 mg l-1 KNO3, 1.650 mg l-1 NH4NO3, 332,2 mg l-1 CaCl2, 200 mg l-1 MES-Puffer, 180,7 mg l-1 MgSO4, 170 mg l-1 KH2PO4, 100 mg l −1 myo-Inositol, 98 mg l−1 KHCO3, 37,26 mg l−1 EDTA, 27,8 mg l−1 FeSO4 ⋅ 7H2O, 16,9 mg l−1 MnSO4 ⋅ H2O, 8,6 mg l−1 ZnSO4 ⋅ 7H2O, 6,2 mg l −1 H3BO3, 0,83 mg l−1 KI, 0,4 mg l−1 Thiamin HCl, 0,25 mg l−1 Na2MoO4 ⋅ 2H2O, 0,025 mg l−1 CoCl2 ⋅ 6H2O und 0,025 mg l−1 CuSO4 ⋅ 5H2O. Der Boden für die Inokulation natürlicher Mikrobiota wurde auf einem Miscanthus-Grundstück an der Michigan State University (42,716989° N, 84,462711° W; „MSU“-Mikrobiota-Eingabe) gesammelt. Für das Transkriptom-Experiment unter Verwendung von HO-Gemeinschaften wurde ein zweiter natürlicher Mikrobiota-Input aus Boden gewonnen, der von einem ungestörten Grasland in Malaka Township, Iowa (41,836100° N, 93,007800° W; „Malaka“-Mikrobiota-Input) gesammelt wurde. Für Experimente mit natürlicher gemeinschaftlicher Mikrobiota wurden AX-Pflanzen mit einer autoklavierten Bodenaufschlämmung (50 g Erde pro Liter Wasser) scheingeimpft und HO-Pflanzen wurden mit der gleichen nicht autoklavierten Bodenaufschlämmung inokuliert. Für Experimente mit synthetischen Gemeinschaften wurden Pflanzen wie zuvor beschrieben inokuliert10. Kurz gesagt, einzelne Mikrobiota-Mitglieder wurden einzeln auf einzelnen R2A-Platten (Sigma, 17209) kultiviert, bevor sie in gleichen Verhältnissen (optische Dichte (OD) 600) in 10 mM MgCl2 gepoolt wurden. Für GnotoPot-Tests wurden Bakteriensuspensionen auf eine endgültige OD600 = 0,04 (~2 × 107 koloniebildende Einheiten (KBE) ml−1) eingestellt und 1 ml wurde zum Beimpfen jedes GnotoPot verwendet. Für plattenbasierte Tests wurden 2 μl Bakteriensuspension mit einer End-OD600 = 0,01 (~5 × 106 KBE ml−1) direkt auf die Samen getupft. AX-Pflanzen für synthetische Gemeinschaftsexperimente wurden mit einem gleichen Volumen von 10 mM MgCl2 scheingeimpft.

Für flg22-Schutztests mit herkömmlicher, in Blumenerde gewachsener Arabidopsis wurden Pflanzen des angegebenen Alters mit einer stumpfen Spritze von Hand mit 500 nM flg22 infiltriert und trocknen gelassen, bis sie nicht mehr wasserdurchtränkt aussahen. 16–24 Stunden nach der Vorbehandlung mit flg22 wurden die Blätter mit 5 × 107 cfu ml−1 Pst DC3000 unter Verwendung einer Spritze mit stumpfem Ende infiltriert. Infizierte Pflanzen wurden teilweise mit einer durchsichtigen Plastikkuppel abgedeckt, um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen. Die Bakterienpopulationen wurden 24 Stunden nach der Infiltration bestimmt.

Für flg22-Schutztests in gnotobiotischem Arabidopsis wurden Pflanzen in FlowPots mit 0,5x LS gezüchtet. Das Aussaatdatum wurde gestaffelt und Pflanzen des angegebenen Alters wurden gleichzeitig behandelt, um einen direkten Vergleich zu ermöglichen. Die Pflanzen wurden mit einer stumpfen Spritze mit 100 nM flg22 vorbehandelt und trocknen gelassen, bis sie nicht mehr wasserdurchtränkt aussahen. Kontroll- und flg22-behandelte Pflanzen wurden über Nacht in Mikroboxen mit geschlossenem Deckel aufbewahrt. 24 Stunden nach der flg22-Vorbehandlung wurden die Pflanzen mit einer Spritze mit Pst DC3000 in einer Menge von 1 × 106 KBE ml-1 infiltriert. Infizierte Pflanzen ließ man trocknen, bis sie nicht mehr durchnässt aussahen, und deckte sie dann mit einer durchsichtigen Plastikkuppel ab, um eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Die Bakterienpopulationen wurden 24 Stunden nach der Infiltration bestimmt.

Für Krankheitstests (ohne flg22-Vorbehandlung) bei gnotobiotischer Arabidopsis wurden Pflanzen in FlowPots oder GnotoPots mit 0,5x LS gezüchtet und mit Pst DC3000 bei 1 × 105 KBE ml-1 von Hand infiltriert. Infizierte Pflanzen ließ man trocknen und hielt sie dann bei hoher Luftfeuchtigkeit (>95 % relative Luftfeuchtigkeit). Die Bakterienpopulationen wurden 3 Tage nach der Infiltration bestimmt. Für die Inokulation mit B. cinerea wurden die Sporen in 1 %iger Sabouraud-Maltose-Bouillon (BD, 242910) auf eine Endkonzentration von 1 × 105 Sporen pro ml verdünnt. Pro Blatt wurden zwei 2-μl-Tröpfchen auf drei Blätter pro Pflanze getupft. Infizierte Pflanzen wurden bei hoher Luftfeuchtigkeit (>95 % relative Luftfeuchtigkeit) gehalten. Die Läsionen wurden 5 Tage nach der Inokulation abgebildet und mit ImageJ v.1.51 quantifiziert.

Für Transkriptomexperimente mit natürlichen Gemeinschaftseinträgen wurde Gesamt-RNA aus ganzen Rosetten von in FlowPot gezüchteten Arabidopsis extrahiert, die mit aus dem Boden stammenden „MSU“- oder „Malaka“-Eingabemikrobiota inokuliert wurden, oder im Fall von AX-Pflanzen mit einer entsprechenden Eingabe scheingeimpft wurden Mikrobiota, die autoklaviert wurde. Ein biologisches Replikat ist definiert als ein Pool von acht Rosetten, die aus vier FlowPots in derselben Mikrobox gesammelt wurden. Pro Zustand wurden drei biologische Replikate gesammelt, insgesamt sechs holoxenische und sechs axenische Replikate. Die RNA wurde mit dem RNeasy Plant Mini-Kit (Qiagen, 74904) gemäß dem Herstellerprotokoll extrahiert, optional mit DNase-Verdau auf der Säule. Gereinigte RNA wurde in TE-Puffer (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) eluiert. Die RNA-Konzentrationen wurden mit einem ND-1000 NanoDrop-Spektrophotometer (Thermo Scientific) oder mit dem fluorometrischen Qubit RNA HS-Assay (Thermo Fisher, Q32855) bestimmt. Gesamt-RNA-Proben wurden in 2,0-ml-Nukleinsäure-LoBind-Röhrchen (Eppendorf, 022431048) gesammelt und bei –80 °C gelagert. Die Qualität der RNA wurde mit einem Bioanalyzer 2100 (Agilent) überprüft und es wurde festgestellt, dass alle Proben einen RNA-Integritätswert von sechs oder mehr aufwiesen. Gestrandete Sequenzierungsbibliotheken wurden unter Verwendung des NuGEN Ovation RNA-SEQ-Systems für Modellorganismen (Arabidopsis) gemäß dem Herstellerprotokoll (NuGEN) erstellt. Die Vorbereitung und Sequenzierung der Bibliothek wurde von der Michigan State University Research Technology Service Facility (RTSF) durchgeführt. Die Sequenzierung wurde auf dem HiSeq 2500 (Illumina) mit einem 1 × 50-bp-Single-Read-Strangformat unter Verwendung von Illumina HiSeq SBS-Reagenzien (v.4) durchgeführt. Der Basisaufruf wurde mit Illumina Real Time Analysis (RTA) v.1.18.64 durchgeführt.

Für Transkriptomexperimente mit SynComs wurden Pflanzen in GnotoPots unter Langtagbedingungen (16 Stunden Tag/8 Stunden Nacht) gezüchtet und am 26. Tag nach der Keimung Proben entnommen. Bei der Ernte wurden pro Probe zwei Blätter einer einzelnen Pflanze gepoolt und insgesamt drei biologisch unabhängige Pflanzenproben pro Zustand gesammelt. Die RNA-Extraktion wurde wie oben beschrieben durchgeführt, die Proben wurden jedoch in RNase/DNase-freiem Wasser eluiert. RNA-Qualitätskontrollen wurden mit Qubit (Thermo Fisher) und TapeStation (Agilent) durchgeführt. Gestrandete RNA-seq-Bibliotheken wurden gepoolt und auf dem Illumina NovaSeq 6000 S1 sequenziert, um 50-bp-Paired-End-Reads zu erhalten. Das Base-Calling wurde mit Illumina RTA 3 durchgeführt. Die Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung wurde vom Sequencing and Genomic Technologies Core am Center for Genomic and Computational Biology der Duke University durchgeführt.

Rohe Transkriptom-Lesevorgänge für beide Transkriptom-Experimente wurden auf dem Duke Compute Cluster wie folgt verarbeitet: Die Lesequalitätskontrolle wurde mit FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)56, Adaptertrimmen und Sequenzierung durchgeführt Die Kartierung wurde mit Trimmomatic57 und STAR (v.9.3.0) durchgeführt (Ref. 58). Die Genexpression wurde mithilfe des R-Pakets Rsubreads (v.2.8.2) (Lit. 59) quantifiziert. DEGs wurden mithilfe des R-Pakets DESeq2 (Lit. 60) identifiziert. Lesetransformation und Normalisierung für PCoA und Clustering wurden mit dem EdgeR-Paket auf der iDEP-Plattform (v.1.0) durchgeführt (Ref. 61). Gene mit unterschiedlicher Expression wurden mit |log2FC| ausgewählt > 1 und FDR < 0,05 (berechnet unter Verwendung der standardmäßigen DESeq2-Einstellungen basierend auf dem Benjamini-Hochberg-korrigierten Wald-Test) als Auswahlkriterien, und die GO-Analyse wurde mit ShinyGO (v.0.76.2) (Ref. 62) mit einem FDR-Schnitt durchgeführt. aus 0,05 und 4 Genen pro Gruppenauswahlkriterium.

Blattscheiben (4 mm Durchmesser) wurden aus der Mitte der Blätter von Pflanzen unterschiedlichen Alters entnommen und mit der abaxialen Seite nach unten in Vertiefungen einer weißen Platte mit 96 Vertiefungen, die in jeder Vertiefung 200 μl steriles Wasser enthielt, geschwommen. Die Platten wurden mit Folie abgedeckt und die Blattscheiben über Nacht in sterilem Wasser aufbewahrt, um die Verletzungsreaktion abzuschwächen. Nach 24 Stunden wurde das Wasser aus den Vertiefungen entfernt und durch 100 μl einer immunauslösenden Lösung ersetzt, die 34 μg ml–1 Luminol (Sigma, A8511), 20 μg ml–1 Meerrettichperoxidase (Sigma, P6782) und 100–250 nM enthielt des angegebenen PAMP/DAMP. Lumineszenzmessungen wurden über 40 Minuten unmittelbar nach der Zugabe der immunauslösenden Lösung unter Verwendung eines SpectraMax L-Mikroplattenlesegeräts mit SoftMax Pro v.7.0.3 (Molecular Devices) gesammelt (Gesamtphotonenzählung). Der Gesamt-ROS wurde für jede Probe in Prism v.10.0.0 (GraphPad) mithilfe der „Area under Curve“-Analyse berechnet.

Für die RT-qPCR-Analyse der Elizitor-induzierten Genexpression wurden ganze Pflanzen mit einer Elizitorlösung besprüht oder Blattscheiben darauf schwimmen gelassen. Zur Sprühauslösung (Abb. 1d, e und 3f) wurden Pflanzen des angegebenen Alters mit einem Blattspray einer Auslöserlösung bestehend aus 100 nM flg22, 0,1 % Dimethylsulfoxid und 0,025 % Silwet-L77 (Bioworld, 30630216) oder a behandelt Scheinlösung, der flg22 fehlte. Es wurden Blattsprays aufgetragen, um sicherzustellen, dass die Behandlungslösung sowohl mit der adaxialen als auch der abaxialen Seite der Blätter in Kontakt kam. Zur weiteren Verarbeitung wurde oberirdisches Gewebe geerntet. Zur Auslösung der Blattscheiben (Abb. 3b und 4c sowie erweiterte Daten, Abb. 7d) wurden 4 mm große Blattscheiben von 4,5–6 Wochen alten Pflanzen entnommen und über Nacht auf sterilem Wasser geschwommen. Am nächsten Tag wurde das Wasser entfernt und durch eine Auslöserlösung ersetzt, die 250 nM des angegebenen PAMP/DAMP enthielt. Für die basale Genexpressionsanalyse von auf Platten gewachsenen Pflanzen (Abb. 6a – c) wurden volle Rosetten von 16 Tage alten Sämlingen abgeschnitten und in 2-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss überführt, bevor sie in flüssigem N2 eingefroren und bei –80 ° gelagert wurden C bis zur weiteren Verarbeitung. Das oberirdische Gewebe von 5 Pflanzen aus einer einzigen Platte wurde gepoolt, um ein biologisches Replikat zu bilden. Zur Transkriptionsanalyse der SynCom-Blattinfiltration (Supplementary Data 6) wurden 4,5–5 Wochen alte Pflanzen mit jedem Stamm bei einer OD600 von 0,2 von Hand infiltriert und nach 24 Stunden wurden drei biologische Replikate zur RNA-Extraktion geerntet.

Die Gesamt-RNA wurde aus Blattgeweben entweder mit Trizol (Thermo Fisher, 15596026) und einem Direct-zol-RNA-Extraktionskit (Zymo Research, R2055) oder einem RNeasy Plant Mini-Kit (Qiagen, 74904) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung des optionalen On-Demand-Kits extrahiert. Säulen-DNase-Behandlung. Die komplementäre (c)DNA-Synthese wurde in 10-μl-Volumina mit SuperScript IV VILO-Mastermix (Thermo Fisher, 11766500) oder M-MLV Reverse Transkriptase (Thermo Fisher, 28025013) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 640–1.000 ng Gesamt-RNA als Input durchgeführt. Nach der Synthese wurde die cDNA 10-fach verdünnt und die qPCR wurde im Duplikat an mindestens drei biologischen Replikaten in Reaktionsvolumina von 10 μl durchgeführt, die 5 μl SYBR Green PCR-Mastermix (Applied Biosystems, 4309155), 0,25 μl jedes Primers und 2 μl enthielten von Template-cDNA. qPCR wurde auf einem ABI 7500 Fast (Applied Biosystems) oder einem QuantStudio 5 RT–qPCR-System (Applied Biosystems) durchgeführt und mit der Software SDS v.2.0 (Applied Biosystems) oder der Software Design and Analysis v.1.5.2 (Applied Biosystems) analysiert. bzw. unter Verwendung der Standardeinstellungen. Zur Normalisierung wurde PP2AA3 verwendet. Die zur Quantifizierung der Genexpression in dieser Studie verwendeten Primersätze sind in den Zusatzdaten 9 aufgeführt.

Die Pflanzenhormone SA und SAG wurden wie zuvor beschrieben extrahiert63. Kurz gesagt, 2–3 Blätter, die von 4,5 Wochen alten Pflanzen geerntet wurden, die in FlowPots gezüchtet wurden, wurden gepoolt, gewogen, eingefroren und dann mit einem TissueLyser (Qiagen) zu feinen Pulvern gemahlen. Gefrorene Pulver wurden in 1 ml Extraktionspuffer resuspendiert, der 80 % Methanol, 0,1 % Ameisensäure, 0,1 mg ml-1 Butylhydroxytoluol und 100 nM deuterierte Abscisinsäure (ABA-2H6) in Wasser enthielt. Die Proben wurden über Nacht bei 4 °C unter leichtem Rühren extrahiert. Am nächsten Tag wurden die Proben durch 10-minütige Zentrifugation bei 12.000 × g geklärt, durch eine 0,2 μm PTFE-Membran (Millipore, UFC30LG25) filtriert und in Autosamplerfläschchen überführt. Injektionen (10 μl) der vorbereiteten Extrakte wurden unter Verwendung einer Ascentis Express-C18-Säule mit verschmolzenem Kern (2,1 × 50 m, 2,7 μm) aufgetrennt, die auf einem Acquity-Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographiesystem (Waters Corporation) auf 50 °C erhitzt wurde. Ein Gradient von 0,15 % Ameisensäure in Wasser (Lösungsmittel A) und Methanol (Lösungsmittel B) wurde über 2,5 Minuten mit einer Durchflussrate von 0,4 ml/min angelegt. Die Trennung bestand aus einem linearen Anstieg von A:B (49:1) auf 100 % B. Übergänge von deprotonierten Molekülen zu charakteristischen Produktionen wurden für ABA-2H6 (m/z 269,1 > 159,1), SA (m/z 137,0 >) überwacht 93,0) und SAG (m/z 299,1 > 137,0) auf einem Quattro Premier Tandem-Massenspektrometer (Waters Corporation) im Negativionenmodus. Die Kapillarspannung, die Kegelspannung und die Extraktorspannung betrugen 3.500 V, 25 V bzw. 5 V. Die Durchflussraten betrugen 50 l·h−1 für das Kegelgas (N2) und 600 l·h−1 für das Desolvatisierungsgas (N2). ABA-2H6 diente als interner Standard für die Hormonquantifizierung. Für die Datenerfassung und -verarbeitung wurde MassLynx v.4.1 (Waters) verwendet. Kollisionsenergien und Quellkegelpotentiale wurden mit dem MassLynx v.4.1 QuanOptimize-Paket (Waters) optimiert. Die Peaks wurden integriert und die Analyten anhand von auf den internen Standard normalisierten Standardkurven quantifiziert.

Protein wurde wie zuvor beschrieben19 mit geringfügigen Modifikationen aus Blättern extrahiert. Zunächst wurden gefrorene Blattgewebe mit einem TissueLyser (Qiagen) unter Verwendung von zwei 45-s-Zyklen bei 28 Hz zu feinen Pulvern gemahlen. Die Pulver wurden in einen Proteinextraktionspuffer aufgenommen, der 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 % (v/v) Glycerin, 1 % (v/v) IGEPAL CA-630 (NP-40) enthielt ( Sigma, I3021), 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumdesoxycholat und 1x komplette EDTA-freie Protease-Inhibitor-Tablette (Roche, 11836170001) und 15 Minuten lang auf Eis mit periodischem Umdrehen inkubiert. Blattlysate wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 10.000 × g gereinigt und das Gesamtprotein mittels Bradford-Assay (Biorad, 5000006) normalisiert. Die Extrakte wurden für die SDS-PAGE mit einem 5-fachen Ladepuffer, der 10 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat, 20 % Glycerin, 0,2 M Tris-HCl (pH 6,8) und 0,05 % Bromphenolblau enthielt, vorbereitet und auf einem Thermocycler schrittweise denaturiert folgende Reihenfolge: 37 °C für 20 Min., 50 °C für 15 Min., 70 °C für 8 Min. und 95 °C für 5 Min. Anschließend wurde das Protein auf NuPAGE 4–12 % Bis-Tris-Gelen (Thermo Fisher, NP0321) 2,5 Stunden lang unter Verwendung von 100 V aufgetrennt. Anschließend wurden die Proteine ​​unter Verwendung eines iBlot 2-Trockenblotsystems (Thermo Fisher) auf eine Polyvinylidenfluoridmembran übertragen und blockiert 3 % Milch + 2 % BSA und über Nacht bei 4 °C immungeblottet mit Antikörpern, die spezifisch für Arabidopsis FLS2 (Agrisera, AS12 1857; 1:5.000 Verdünnung), BAK1 (Agrisera, AS12 1858; 1:5.000 Verdünnung), MPK3 (Sigma, M8318) sind ; 1:500 Verdünnung) oder MPK6 (Sigma, A7104; 1:2.000 Verdünnung) in den angegebenen Verdünnungen. Blots zum Nachweis von phosphoryliertem MAPK wurden in 5 % BSA blockiert und mit einem Phosphor-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)-Antikörper (Cell Signaling, 9101; 1:1.000 Verdünnung) immungeblottet. Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper, hergestellt in Ziege (Agrisera, AS09 602; 1:40.000), wurde als sekundärer Antikörper verwendet und die resultierenden Proteine ​​von Interesse wurden mit dem Chemilumineszenzsubstrat SuperSignal West (Thermo Fisher) in einem iBright 1500-System sichtbar gemacht ( Invitrogen). Um die gleichmäßige Beladung zu überprüfen, wurde eine Ponceau S- oder Amido Black-Färbung durchgeführt. Die Banden wurden mit ImageJ v.1.51 quantifiziert.

Zur Quantifizierung der Bakteriengemeinschaften in der Phyllosphäre wurde ein kulturbasierter Ansatz verwendet, wie zuvor beschrieben10. Kurz gesagt, die Blätter wurden zweimal in sterilem Wasser gespült und an der Luft getrocknet, um restliches Oberflächenwasser zu entfernen. Die Blätter wurden dann gewogen und in 10 mM MgCl2 gemahlen und eine Reihenverdünnung wurde auf R2A (Sigma, 17209), ergänzt mit 50 μg ml–1 Cycloheximid, ausplattiert. Die Platten wurden 2 Tage lang bei Raumtemperatur, dann 4 Tage lang bei 4 °C inkubiert und die Kolonien gezählt.

Die 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung wurde verwendet, um die relative Häufigkeit bakterieller Taxa abzuschätzen. Die Gesamt-DNA wurde aus der Phyllosphäre und den Input-Gemeinschaften mit dem DNeasy PowerSoil Pro-Kit (Qiagen, 47014) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Für Phyllosphärenproben wurden 2–3 Blätter einer einzelnen Pflanze pro biologischer Probe gepoolt (n = 12). Für Eingangsproben wurden während der Inokulation 500 μl Bodenaufschlämmung eingespart (n = 5). Die PCR wurde mit AccuPrime High-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase (Thermo Fisher, 12346086) unter Verwendung von Barcode-Primern mit Heterogenitätsadaptern durchgeführt, die auf die v5/v6-Region des 16S-rRNA-Gens abzielten (799F und 1193R, Primersequenzen siehe Supplementary Data 9). Primäre Amplifikate wurden mittels Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarosegel aufgetrennt. DNA in der ~400-bp-Bande wurde mit dem Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, D4008) gewonnen. Die Konzentration der gewonnenen DNA wurde mit einem PicoGreen dsDNA-Assay-Kit (Invitrogen, P7589) gemessen und auf 1–10 ng μl−1 normalisiert. Die Proben wurden zur Bibliotheksvorbereitung und 16S-rRNA-Gensequenzierung an den RTSF Genomics Core der Michigan State University geschickt.

Der RTSF Genomics Core führte eine sekundäre PCR mit doppelt indizierten, Illumina-kompatiblen Primern durch, die auf die Fluidigm CS1/CS2-Oligomere an den Enden der primären PCR-Produkte abzielen. Die Amplikons wurden unter Verwendung von SequalPrep-DNA-Normalisierungsplatten (Invitrogen, A1051001) ansatzweise normalisiert und das gewonnene Produkt gepoolt. Die Pools wurden mit einer Kombination aus Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher, Q32855), 4200 TapeStation HS DNA1000 (Agilent) und Collibri Library Quantification qPCR (Invitrogen, A38524100) qualitätskontrolliert und quantifiziert. Der Bibliothekspool wurde auf eine MiSeq v2-Durchflusszelle geladen und die Sequenzierung in einem 2 × 250-bp-Paired-End-Format unter Verwendung einer MiSeq v.2 500-Zyklen-Reagenzienkartusche durchgeführt. Benutzerdefinierte Sequenzierungs- und Indexprimer, die zu den Fluidigm CS1- und CS2-Oligomeren komplementär sind, wurden in die entsprechenden Vertiefungen der Reagenzienkartusche gegeben. Der Basisaufruf wurde von Illumina RTA v.1.18.54 durchgeführt und die Ausgabe von RTA wurde demultiplext und mit Illumina Bcl2fastq v.2.20.0 in das FastQ-Format konvertiert.

Rohe Fastq-Dateien vom MiSeq-Instrument wurden demultiplext und mit der QIIME 2 Core 2022.2-Distribution64 verarbeitet. Kurz gesagt, Primer und Heterogenitätsspacer wurden mit Cutadapt65 entfernt und DADA2 (Lit. 66) wurde verwendet, um Sequenzen zu trimmen, zu filtern und zu entrauschen, chimäre Sequenzen zu entfernen und Amplikonsequenzvarianten zu erhalten. Die taxonomische Zuordnung jeder Amplikonsequenzvariante wurde unter Verwendung eines Naive-Bayes-Klassifikators67 durchgeführt, der vorab auf der SILVA 16S rRNA-Genreferenzdatenbank (Release 138) (Ref. 68) trainiert und für QIIME mit dem RESCRIPt69-Plugin formatiert wurde. Nicht zugeordnete Sequenzen oder Sequenzen, die als pflanzliche Chloroplasten oder Mitochondrien identifiziert wurden, wurden entfernt. Diversitätsanalysen wurden im Rahmen von QIIME 2 durchgeführt. Die Proben wurden auf 5.765 Lesevorgänge reduziert, um Diversitätsmetriken zu berechnen.

Der GUS-Assay wurde wie zuvor beschrieben70 mit geringfügigen Änderungen durchgeführt. Kurz gesagt, die Sämlinge wurden in Platten mit 24 Vertiefungen, die flüssiges LS-Medium, ergänzt mit 0,5 % Saccharose, enthielten, in einem Tag-/Nachtzyklus von 16 Stunden/8 Stunden in einer Percival-Pflanzenwachstumskammer bei 22 °C und einer Lichtintensität von 50 μmol m-2 s gezüchtet −1. Die Pflanzen wurden am 12. Tag mit Bakterienstämmen inokuliert. Bakterienstämme wurden 3 Tage lang bei 22 °C auf R2A-Platten gezüchtet, in 10 mM MgCl2 resuspendiert und den Sämlingen in LS-Medium ohne Saccharose bei einer OD600 von 0,002 zugesetzt. Nach 5-stündiger Behandlung mit SynCom-Stämmen wurden die Sämlinge mit 0,5 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7) gespült und in 0,5 ml GUS-Färbelösung (50 mM Natriumphosphat (pH 7), 0,5 mM K4[Fe(CN)) getaucht. 6], 0,5 mM K3[Fe(CN)6], 1 mM X-Gluc (GoldBio, G1281C) und 0,01 % Silwet-L77 (Bioworld, 30630216)). Nach 10-minütiger Vakuuminfiltration wurden die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Pflanzen wurden mit einer 3:1 Ethanol:Essigsäure-Lösung 1 Tag bei 4 °C fixiert und anschließend in 95 % Ethanol überführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die RNA-seq-Rohsequenzierung und die analysierten Daten wurden in der NCBI Gene Expression Omnibus-Datenbank unter den Zugangsdaten GSE218961 und GSE218962 hinterlegt. Rohe 16S-rRNA-Gensequenzen aus diesem Projekt sind in der Sequence Read Archive-Datenbank unter BioProject PRJNA977816, Zugangsnummern SAMN35534885 bis SAMN35534914, verfügbar. QIIME-kompatible SILVA 16S rRNA-Genreferenzsequenzen und Taxonomie (Version 138) können unter https://docs.qiime2.org/2022.2/data-resources/ heruntergeladen werden. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der für die RNA-seq-Rohdatenanalyse verwendete Code ist unter https://github.com/rsohrabi/MIP_ms zu finden. Der gesamte Sequenzanalyse-Workflow für die 16S-Amplikon-Analyse ist unter https://github.com/BradCP/A-critical-role-of-a-eubiotic-microbiota-in-gating-proper-immunocompetence-in-Arabidopsis verfügbar.

Paasch, BC & He, SY Auf dem Weg zum Verständnis der Mikrobiota-Homöostase im Pflanzenreich. PLoS Pathog. 17, e1009472 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sohrabi, R., Paasch, BC, Liber, J. & He, SY Phyllosphären-Mikrobiom. Annu. Rev. Plant Biol. 74, 539–568 (2023).

Artikel PubMed Google Scholar

Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., van Themaat, EVL & Schulze-Lefert, P. Struktur und Funktionen der bakteriellen Mikrobiota von Pflanzen. Annu. Rev. Plant Biol. 64, 807–838 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lundberg, DS et al. Definition des Kernmikrobioms der Arabidopsis thaliana-Wurzel. Natur 488, 86–90 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Müller, DB, Vogel, C., Bai, Y. & Vorholt, JA Die pflanzliche Mikrobiota: Einblicke und Perspektiven auf Systemebene. Annu. Rev. Genet. 50, 211–234 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Regalado, J. et al. Kombination von Shotgun-Sequenzierung des gesamten Genoms und rRNA-Gen-Amplikon-Analysen zur Verbesserung der Erkennung von Mikroben-Mikroben-Interaktionsnetzwerken in Pflanzenblättern. ISME J. 14, 2116–2130 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindow, SE & Brandl, MT Mikrobiologie der Phyllosphäre. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 69, 1875–1883 ​​(2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bai, Y. et al. Funktionelle Überlappung der Blatt- und Wurzelmikrobiota von Arabidopsis. Natur 528, 364–369 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fitzpatrick, CR et al. Das pflanzliche Mikrobiom: von der Ökologie zum Reduktionismus und darüber hinaus. Annu. Rev. Microbiol. 74, 81–100 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, T. et al. Ein pflanzengenetisches Netzwerk zur Vorbeugung von Dysbiose in der Phyllosphäre. Natur 580, 653–657 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pfeilmeier, S. et al. Die pflanzliche NADPH-Oxidase RBOHD ist für die Homöostase der Mikrobiota in Blättern erforderlich. Nat. Mikrobiol. 6, 852–864 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pfeilmeier, S. et al. Eine Dysbiose eines Blattmikrobioms wird durch die Enzymsekretion opportunistischer Xanthomonas-Stämme verursacht. Vorabdruck bei bioRxiv https://doi.org/10.1101/2023.05.09.539948 (2023).

Entila, F., Han, X., Mine, A., Schulze-Lefert, P. & Tsuda, K. Kommensaler Lebensstil, reguliert durch eine negative Rückkopplungsschleife zwischen Arabidopsis ROS und dem bakteriellen T2SS. Vorabdruck bei bioRxiv https://doi.org/10.1101/2023.05.09.539802 (2023).

Berendsen, RL, Pieterse, CM & Bakker, PA Das Rhizosphären-Mikrobiom und die Pflanzengesundheit. Trends Pflanzenwissenschaft. 17, 478–486 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Trivedi, P., Leach, JE, Tringe, SG, Sa, T. & Singh, BK Pflanze-Mikrobiom-Interaktionen: von der Gemeindeversammlung bis zur Pflanzengesundheit. Nat. Rev. Microbiol. 18, 607–621 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mendes, R., Garbeva, P. & Raaijmakers, JM Das Rhizosphären-Mikrobiom: Bedeutung pflanzennützlicher, pflanzenpathogener und humanpathogener Mikroorganismen. FEMS Mikrobiol. Rev. 37, 634–663 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zipfel, C. Pflanzenmustererkennungsrezeptoren. Trends Immunol. 35, 345–351 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chinchilla, D., Bauer, Z., Regenass, M., Boller, T. & Felix, G. Die Arabidopsis-Rezeptorkinase FLS2 bindet flg22 und bestimmt die Spezifität der Flagellin-Wahrnehmung. Pflanzenzelle 18, 465–476 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chinchilla, D. et al. Ein Flagellin-induzierter Komplex aus den Rezeptoren FLS2 und BAK1 initiiert die pflanzliche Abwehr. Natur 448, 497–500 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, J. & Zhou, J.-M. Pflanzenimmunität, ausgelöst durch mikrobielle molekulare Signaturen. Mol. Werk 3, 783–793 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Macho, AP & Zipfel, C. Pflanzen-PRRs und die Aktivierung angeborener Immunsignale. Mol. Zelle 54, 263–272 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Couto, D. & Zipfel, C. Regulierung der Signalübertragung von Mustererkennungsrezeptoren in Pflanzen. Nat. Rev. Immunol. 16, 537–552 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, B., Meng, X., Shan, L. & He, P. Transkriptionelle Regulierung der mustergesteuerten Immunität in Pflanzen. Cell Host Microbe 19, 641–650 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meng, X. & Zhang, S. MAPK-Kaskaden bei der Signalübertragung von Pflanzenkrankheitsresistenz. Annu. Rev. Phytopathol. 51, 245–266 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bigeard, J., Colcombet, J. & Hirt, H. Signalmechanismen bei der mustergesteuerten Immunität (PTI). Mol. Werk 8, 521–539 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zipfel, C. et al. Bakterielle Krankheitsresistenz bei Arabidopsis durch Flagellin-Wahrnehmung. Natur 428, 764–767 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Crabill, E., Joe, A., Block, A., van Rooyen, JM & Alfano, JR Pflanzenimmunität schränkt direkt oder indirekt die Injektion von Typ-III-Effektoren durch das Sekretionssystem von Pseudomonas syringae Typ III ein. Pflanzenphysiologie. 154, 233–244 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Develey-Rivière, MP & Galiana, E. Resistenz gegen Krankheitserreger und Wirtsentwicklungsstadium: eine vielschichtige Beziehung innerhalb des Pflanzenreichs. Neues Phytol. 175, 405–416 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Kus, JV, Zaton, K., Sarkar, R. & Cameron, RK Die altersbedingte Resistenz bei Arabidopsis ist eine entwicklungsbedingt regulierte Abwehrreaktion gegen Pseudomonas syringae. Plant Cell 14, 479–490 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Panter, SN & Jones, DA Altersbedingte Resistenz gegen Pflanzenpathogene. Adv. Bot. Res. 38, 251–280 (2002).

Artikel Google Scholar

Rusterucci, C. et al. Altersbedingte Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate wird mit dem Übergang zur Blüte bei Arabidopsis in Verbindung gebracht und ist wirksam gegen Peronospora parasitica. Physiol. Mol. Pflanzenpathol. 66, 222–231 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Huot, B. et al. Doppelter Einfluss erhöhter Temperatur auf die Pflanzenabwehr und die bakterielle Virulenz bei Arabidopsis. Nat. Komm. 8, 1808 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

He, Z., Webster, S. & He, SY Wachstums-Verteidigungs-Kompromisse bei Pflanzen. Curr. Biol. 32, R634–R639 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, D., Pajerowska-Mukhtar, K., Culler, AH & Dong, X. Salicylsäure hemmt das Wachstum von Krankheitserregern in Pflanzen durch Unterdrückung des Auxin-Signalwegs. Curr. Biol. 17, 1784–1790 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang, D.-L. et al. Das Pflanzenhormon Jasmonat gibt der Verteidigung Vorrang vor dem Wachstum, indem es die Gibberellin-Signalkaskade stört. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 109, E1192–E1200 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lozano-Durán, R. et al. Der Transkriptionsregulator BZR1 vermittelt den Kompromiss zwischen angeborener Immunität der Pflanze und Wachstum. eLife 2, e00983 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, D.-H., Hettenhausen, C., Baldwin, IT & Wu, J. Die vielfältige Funktion von BAK1/SERK3: pflanzliche Immunität gegen Krankheitserreger und Reaktionen 1 auf pflanzenfressende Insekten. Pflanzensignal. Verhalten. 6, 1322–1324 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hooper, LV, Littman, DR & Macpherson, AJ Wechselwirkungen zwischen der Mikrobiota und dem Immunsystem. Science 336, 1268–1273 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fulde, M. & Hornef, MW Reifung des angeborenen Immunsystems der Darmschleimhaut während der postnatalen Phase. Immunol. Rev. 260, 21–34 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Levy, M., Kolodziejczyk, AA, Thaiss, CA & Elinav, E. Dysbiose und das Immunsystem. Nat. Rev. Immunol. 17, 219–232 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wolinska, KW et al. Der Tryptophanstoffwechsel und bakterielle Kommensalen verhindern eine Pilzdysbiose in Arabidopsis-Wurzeln. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 118, e2111521118 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Runge, P., Ventura, F., Kemen, E. & Stam, R. Ausgeprägtes Phyllosphären-Mikrobiom wilder Tomatenarten in Zentralperu bei Dysbiose. Mikrob. Ökologisch. 85, 168–183 (2023).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kremer, JM et al. Torfbasierte gnotobiotische Pflanzenwachstumssysteme für die Arabidopsis-Mikrobiomforschung. Nat. Protokoll. 16, 2450–2470 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zou, Y., Wang, S. & Lu, D. Das MiR172b-TOE1/2-Modul reguliert die angeborene Immunität von Pflanzen altersabhängig. Biochem. Biophys. Res. Komm. 531, 503–507 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Carella, P., Wilson, DC & Cameron, RK Manche Dinge werden mit zunehmendem Alter besser: Unterschiede in der Salicylsäureakkumulation und der Abwehrsignalisierung bei jungen und erwachsenen Arabidopsis-Pflanzen. Vorderseite. Pflanzenwissenschaft. 5, 775 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Xin, X.-F. et al. Bakterien schaffen in Pflanzen einen wässrigen Lebensraum, der für die Virulenz entscheidend ist. Natur 539, 524–529 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Linsmaier, E. & Skoog, F. Anforderungen an organische Wachstumsfaktoren von Tabakgewebekulturen. Physiol. Anlage. 18, 100–127 (1965).

Artikel CAS Google Scholar

Zou, Y. et al. Die Transkriptionsregulation des Immunrezeptors FLS2 steuert die Ontogenese der angeborenen Immunität von Pflanzen. Plant Cell 30, 2779–2794 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ding, S. et al. Stickstoffformen und -stoffwechsel beeinflussen die Pflanzenabwehr gegen Blatt- und Wurzelpathogene in Tomaten. Pflanzenzellumgebung. 44, 1596–1610 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ma, K.-W. et al. Koordination der Mikroben-Wirt-Homöostase durch Übersprechen mit der angeborenen Immunität der Pflanze. Nat. Pflanzen 7, 814–825 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Teixeira, PJ et al. Spezifische Modulation des Wurzelimmunsystems durch eine Gemeinschaft kommensaler Bakterien. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 118, e2100678118 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Maier, BA et al. Eine allgemeine Nicht-Selbst-Reaktion als Teil der Pflanzenimmunität. Nat. Pflanzen 7, 696–705 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blum, HE Das menschliche Mikrobiom. Adv. Med. Wissenschaft. 62, 414–420 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

de Oliveira, GLV, Leite, AZ, Higuchi, BS, Gonzaga, MI & Mariano, VS Darmdysbiose und probiotische Anwendungen bei Autoimmunerkrankungen. Immunologie 152, 1–12 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoagland, DR & Arnon, DI Die Wasserkulturmethode für den Pflanzenanbau ohne Erde Rundschreiben 347 (Univ. of California College of Agriculture, 1950).

Conesa, A. et al. Eine Übersicht über Best Practices für die RNA-seq-Datenanalyse. Genombiol. 17, 13 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Bolger, AM, Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: ein flexibler Trimmer für Illumina-Sequenzdaten. Bioinformatik 30, 2114–2120 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dobin, A. et al. STAR: ultraschneller universeller RNA-seq-Aligner. Bioinformatik 29, 15–21 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liao, Y., Smyth, GK & Shi, W. Das R-Paket Rsubread ist einfacher, schneller, billiger und besser für die Ausrichtung und Quantifizierung von RNA-Sequenzierungs-Reads. Nukleinsäuren Res. 47, e47 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Moderierte Schätzung der Faltungsänderung und Streuung für RNA-seq-Daten mit DESeq2. Genombiol. 15, 550 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ge, SX, Son, EW & Yao, R. iDEP: eine integrierte Webanwendung für die differenzielle Expression und Signalweganalyse von RNA-Seq-Daten. BMC Bioinformatics 19, 534 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ge, SX, Jung, D. & Yao, R. ShinyGO: ein grafisches Tool zur Anreicherung von Gensätzen für Tiere und Pflanzen. Bioinformatik 36, 2628–2629 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zeng, W. et al. Ein genetisches Screening zeigt stomatale und/oder apoplastische Abwehrkräfte von Arabidopsis gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000. PLoS Pathog. 7, e1002291 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bolyen, E. et al. Reproduzierbare, interaktive, skalierbare und erweiterbare Mikrobiom-Datenwissenschaft mit QIIME 2. Nat. Biotechnologie. 37, 852–857 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martin, M. Cutadapt entfernt Adaptersequenzen aus Sequenzierungslesevorgängen mit hohem Durchsatz. EMBnet J. 17, 10–12 (2011).

Artikel Google Scholar

Callahan, BJ et al. DADA2: hochauflösende Probeninferenz aus Illumina-Amplikondaten. Nat. Methoden 13, 581–583 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bokulich, NA et al. Optimierung der taxonomischen Klassifizierung von Markergen-Amplikonsequenzen mit dem q2-feature-classifier-Plugin von QIIME 2. Mikrobiom 6, 90 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Quast, C. et al. Das SILVA-Ribosomal-RNA-Gendatenbankprojekt: verbesserte Datenverarbeitung und webbasierte Tools. Nukleinsäuren Res. 41, D590–D596 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Robeson, MS II et al. RESCRIPt: Reproduzierbare Sequenztaxonomie-Referenzdatenbankverwaltung. PLoS Comput. Biol. 17, e1009581 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Cheng, Z. et al. Von Krankheitserregern sezernierte Proteasen aktivieren einen neuartigen pflanzlichen Immunweg. Natur 521, 213–216 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken den Studenten C. Griffin, T. Ulrich, F. Dion und T. Johnson sowie dem Labortechniker D. Rhodes für ihre Unterstützung bei der Gestaltung und Konstruktion gnotobiotischer Systeme und für die Durchführung kritischer Experimente, die zu diesen veröffentlichten Ergebnissen führten; H. Jin für die Weitergabe von B. cinerea; F. Ausubel für die Weitergabe der Samen der CYP71A12Pro:GUS-Linie; und Mitgliedern des He-Labors für die kritische Lektüre des Manuskripts. YTC wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Bradley C. Paasch, Reza Sohrabi, James M. Kremer.

Abteilung für Biologie, Duke University, Durham, NC, USA

Bradley C. Paasch, Reza Sohrabi, Kinya Nomura, Yu Ti Cheng und Sheng Yang He

Howard Hughes Medical Institute, Duke University, Durham, NC, USA

Bradley C. Paasch, Reza Sohrabi, Kinya Nomura, Yu Ti Cheng und Sheng Yang He

Department of Energy Plant Research Laboratory, Michigan State University, East Lansing, MI, USA

James M. Kremer & Jennifer Martz

Abteilung für Pflanzenpathologie, University of Georgia, Athens, GA, USA

Brian Kvitko

Abteilung für Mikrobiologie und Molekulargenetik, Michigan State University, East Lansing, MI, USA

James M. Tiedje

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

JMK, JMT und SYH konzipierten das ursprüngliche Projekt. BCP, RS, JMK, JMT und SYH haben die Studie entworfen und die Daten analysiert. BCP führte gnotobiotische Pflanzentests und 16S-Analysen durch. RS führte gnotobiotische Pflanzentests und RNA-Seq-Analysen durch. JMK führte RNA-Seq in FlowPots und vorläufige gnotobiotische Pflanzentests durch. KN führte zeitliche Tests in konventionellen und gnotobiotischen Pflanzen durch. YTC entwarf 16S-PCR-Primer mit Heterogenitätsspacern und generierte primäre Amplifikate. JM half bei gnotobiotischen Nährstofftests. BK führte temporäre flg22-Schutztests in konventionell angebauten Pflanzen durch. BCP, RS und SYH haben das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Sheng Yang He.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Plants dankt Yang Bai, Steven Lindow und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

H 4 Wochen alte Wildtyp- (Col-0) und bbc-mutierte HO-Pflanzen wurden 24 Stunden vor der Inokulation mit Pst DC3000 (OD600 = 0,002) entweder mit einer Wasserlösung (Scheinlösung) oder einer 100 nM flg22-Lösung behandelt. Jede Spalte stellt den mittleren Bakterientiter 24 Stunden nach der Inokulation als logarithmisch transformierte KBE/cm2 dar (n = 3 Pflanzen). Fehlerbalken zeigen SD an. (Spalte 0: p = 7,74 × 10-9, BBC: nicht signifikant; Zwei-Wege-ANOVA mit Šidáks Mehrfachvergleichstest). Dieses Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die genauen p-Werte für alle Vergleiche sind in den Quelldaten aufgeführt.

Quelldaten

Gesamte ROS-Produktion, induziert durch 250 nM flg22, elf18 und Pep1 in AX- und HO-Pflanzen in GnotoPots. Ergebnisse berechnet aus den in Abb. 2a dargestellten Daten durch Bestimmung der mittleren Fläche unter der Kurve (n = 8 Pflanzen). Fehlerbalken zeigen SD an (flg22: p = 6,07 × 10-5, elf18: p = 3,77 × 10-5, Pep1: p = 0,03; Zwei-Wege-ANOVA mit Fisher-LSD-Test). Dieses Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Quelldaten

Gesamtes FLS2-Protein im Lysat des gesamten Blattgewebes von vier gepoolten Pflanzen nachgewiesen. Zwei experimentelle Wiederholungen zeigen Variabilität in der relativen Häufigkeit von FLS2. Die Ponceau-S-Färbung aller Blots zeigt die gleiche Beladung. Dieses Experiment wurde fünfmal mit unterschiedlichen Ergebnissen wiederholt. Abgebildet sind Blots aus zwei repräsentativen Experimenten. Informationen zum Zuschneiden von Bildern finden Sie unter Quelldaten.

Quelldaten

a,b, Gesamtgehalt an Salicylsäure (SA) (a) und glucosylierter SA (b) in AX- und HO-Pflanzen. Jeder Balken stellt die Mittelwerte dar (n = 6 biologisch unabhängige Pflanzenproben). Fehlerbalken stellen SD dar (SA: p = 0,003, SAG: p = 0,002; zweiseitiger ungepaarter t-Test). Dieses Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Quelldaten

a, Gesamt-ROS-Produktion, induziert durch 100 nM flg22 in Pflanzen, die mit HO oder SynComCol-0 besiedelt wurden. Ergebnisse berechnet aus den in Abb. 3a dargestellten Daten durch Bestimmung der mittleren Fläche unter der Kurve ± SD (n = 12 Pflanzen). Unterschiedliche Buchstaben stellen einen signifikanten Unterschied dar (p < 0,05, einfaktorielle ANOVA mit Tukeys HSD-Post-hoc-Test). Die genauen p-Werte für alle Vergleiche sind in den Quelldaten aufgeführt. b: Gesamtes BAK1-Protein, nachgewiesen in Blattlysaten von 6 Wochen alten Pflanzen, die mit 10 mM MgCl2 scheininokuliert wurden, und Pflanzen, die mit SynComCol-0 besiedelt wurden. Die Zahlen unter dem Blot geben die Bandenintensität im Verhältnis zu der von Ponceau S an, normalisiert auf HO = 1,00. Informationen zum Zuschneiden von Bildern finden Sie unter Quelldaten. a,b, Experimente wurden zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Quelldaten

a, ROS-Burst-Kinetik nach Induktion durch 250 nM flg22 in Pflanzen, die mit SynComCol-mix19, SynComCol-mix3 oder scheingeimpft mit 10 mM MgCl2 als Kontrolle in GnotoPots besiedelt wurden. Die Ergebnisse stellen die Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 8 Pflanzen) dar. b, Gesamt-ROS-Produktion, berechnet durch Bestimmung der Fläche unter jeder in Tafel a angezeigten Kurve. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 8 Pflanzen). Unterschiedliche Buchstaben stellen einen signifikanten Unterschied dar (p < 0,05, einfaktorielle ANOVA mit Tukeys HSD-Post-hoc-Test). Die genauen p-Werte für alle Vergleiche sind in den Quelldaten aufgeführt. Dieses Experiment wurde zwei unabhängige Male mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Quelldaten

a, Gesamt-ROS-Produktion, induziert durch 100 nM flg22 in AX- und HO-Pflanzen, die in GnotoPots gezüchtet wurden, die mit 0,1-fachen, 0,5-fachen oder 1-fachen LS-Nährlösungskonzentrationen versorgt wurden. Ergebnisse berechnet aus den in Abb. 5a dargestellten Daten durch Bestimmung der mittleren Fläche unter der Kurve ± SD (n = 6 Pflanzen). Unterschiedliche Buchstaben stellen einen signifikanten Unterschied dar (p < 0,05, zweifaktorielle ANOVA mit Fisher-LSD-Test). Dieses Experiment wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. b: ROS-Burst-Dynamik, induziert durch 250 nM flg22 in HO-Pflanzen, die in GnotoPots gezüchtet wurden, die mit 0,5x LS, 0,5x LS, ergänzt mit zusätzlichen Komponenten von LS bis zu 1x, und 1x LS versorgt wurden. Als Kontrolle wurden AXE-Pflanzen einbezogen. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (n = 8 Pflanzen). c, Gesamt-ROS-Produktion, berechnet durch Bestimmung der Fläche unter jeder Kurve in Tafel b. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert dar (n = 8 Pflanzen). Fehlerbalken stellen SD dar (im Vergleich zu 0,5x LS: p = 0,0051 ( + N), p = 0,0009 (1x LS), q = 0,0184 (AX), alle anderen ns; einfache ANOVA mit Dunnett-Test). d, FRK1-Genexpression in AX- und HO-Pflanzen, induziert durch 250 nM flg22. Die Gesamt-RNA wurde 1,5 Stunden nach der Behandlung aus den Blattscheiben extrahiert. Zur Normalisierung wurde PP2AA3 verwendet. Balken stellen den Mittelwert dar (n = 8 Pflanzen). Fehlerbalken zeigen SD an (im Vergleich zu 0,5x LS: p = 0,0180 ( + N), p = 0,0169 (1x LS), p = 0,0234 (AX), alle anderen ns; einfache ANOVA mit Dunnett-Test). ad: Die Experimente wurden mindestens zwei unabhängige Male mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. a,c,d, Genaue p-Werte für alle Vergleiche sind in den Quelldaten aufgeführt.

Quelldaten

Die histochemische GUS-Färbung wurde nach Behandlung eines 12 Tage alten Sämlings der CYP71A12pro:GUS-Reporterlinie mit einzelnen SynCom-Stämmen durchgeführt. Hier sind repräsentative Bilder von Pflanzen nach dem GUS-Assay dargestellt. Dieses Experiment wurde zwei unabhängige Male mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

A. Das Venn-Diagramm hochregulierter DEGs zeigte 213 häufig vorkommende Arabidopsis-Gene als Reaktion auf natürliche Mikrobiota und SynComCol-0-Kolonisierung. Signifikante DEGs wurden mithilfe von DESEq2 mit |log2FC | identifiziert > 1 und FDR < 0,05 (Benjamini-Hochberg-korrigierter Wald-Test) Kriterien in einem Vergleich von HO-Pflanzen (kolonisiert durch mikrobielle Gemeinschaften von zwei verschiedenen Standorten/Bodentypen „MSU“ und „Malaka“) und SynComCol-0-kolonisierten Pflanzen mit ihren entsprechenden AX-Steuerung. b: Dargestellt ist eine Untergruppe der unterschiedlich regulierten Gene in HO- und SynComCol-0-Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden AX-Pflanzen. Die Wärmekarte der DEGs wurde mithilfe hierarchischer Clusterbildung mit euklidischem Abstand und vollständiger Verknüpfung erstellt. ce, Gene Ontology (GO)-Begriffsanreicherungsanalyse (GO:BP biologischer Prozess) an 213 häufig angereicherten DEGs sowohl in HO als auch in SynComCol-0, nur in HO oder nur in SynComCol-0-Pflanzen, im Vergleich zu ihren jeweiligen AX-Kontrollpflanzen. Die am häufigsten angereicherten GO-Begriffe werden angezeigt, sortiert nach Signifikanz (FDR < 0,05 Cutoff). Die 213 angereicherten DEGs, die sowohl in HO als auch in SynComCol-0 vorkommen (Panel c), zeigten die höchste Anreicherung für immunitätsassoziierte GO-Terme. GNSR-Gene, die in der Untergruppe von 213 DEGs vorhanden sind, die sowohl in HO als auch in SynComCol-0 vorkommen, sind in Panel b rot markiert. ae, n = 3 biologisch unabhängige Pflanzenproben pro Bedingung.

Ergänzende Daten 1–10.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Unverarbeitete Western Blots.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Unverarbeitete Western Blots.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Unverarbeitete Western Blots.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Paasch, BC, Sohrabi, R., Kremer, JM et al. Eine entscheidende Rolle einer eubiotischen Mikrobiota bei der Gewährleistung der richtigen Immunkompetenz bei Arabidopsis. Nat. Pflanzen (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01501-1

Zitat herunterladen

Eingegangen: 30. November 2022

Angenommen: 27. Juli 2023

Veröffentlicht: 17. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01501-1

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt