Bakterielle Kapselpolysaccharide mit Antibiofilmaktivität haben gemeinsame biophysikalische und elektrokinetische Eigenschaften

Jul 13, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2553 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bakterielle Biofilme sind oberflächengebundene Gemeinschaften, die aufgrund einer hohen Toleranz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen schwer zu beseitigen sind. Die Verwendung nicht biozider oberflächenaktiver Verbindungen zur Verhinderung der anfänglichen Adhäsion und Aggregation bakterieller Krankheitserreger ist eine vielversprechende Alternative zu Antibiotika-Behandlungen. Es wurden mehrere Antibiofilm-Verbindungen identifiziert, darunter einige Kapselpolysaccharide, die von verschiedenen Bakterien freigesetzt werden. Allerdings schränkt der Mangel an chemischem und mechanistischem Verständnis der Aktivität dieser Polymere ihre Verwendung zur Kontrolle der Biofilmbildung ein. Hier untersuchen wir eine Sammlung von 31 gereinigten Kapselpolysacchariden und identifizieren zunächst sieben neue Verbindungen mit nicht biozider Aktivität gegen Escherichia coli- und/oder Staphylococcus aureus-Biofilme. Wir messen und interpretieren die elektrophoretische Mobilität einer Untergruppe von 21 Kapselpolysacchariden unter angelegten elektrischen Feldbedingungen theoretisch und zeigen, dass aktive und inaktive Polysaccharidpolymere unterschiedliche elektrokinetische Eigenschaften aufweisen und dass alle aktiven Makromoleküle Merkmale einer hohen intrinsischen Viskosität aufweisen. Trotz des Fehlens eines spezifischen molekularen Motivs, das mit Antibiofilm-Eigenschaften verbunden ist, können wir durch die Verwendung von Kriterien wie hoher Dichte elektrostatischer Ladungen und Durchlässigkeit für den Flüssigkeitsfluss zwei zusätzliche Kapselpolysaccharide mit Breitband-Antibiofilm-Aktivität identifizieren. Unsere Studie liefert daher Einblicke in wichtige biophysikalische Eigenschaften, die aktive von inaktiven Polysacchariden unterscheiden. Die Charakterisierung einer eindeutigen elektrokinetischen Signatur, die mit der Antibiofilmaktivität verbunden ist, eröffnet neue Perspektiven für die Identifizierung oder Entwicklung nicht biozider oberflächenaktiver Makromoleküle zur Kontrolle der Biofilmbildung in medizinischen und industriellen Umgebungen.

Bakterielle Biofilme sind weit verbreitete, an der Oberfläche haftende oder aggregierte Bakterien, die sich negativ auf menschliche Aktivitäten auswirken können, wenn sie sich auf medizinischen oder industriellen Oberflächen entwickeln1,2. Aufgrund ihrer hohen Antibiotikatoleranz sind Biofilme schwer zu beseitigen und die Prävention biofilmbedingter Infektionen ist ein großes gesundheitliches und wirtschaftliches Problem3,4. Strategien zur Verhinderung der Bildung von Biofilmen zielen häufig auf die ersten Schritte der Bakterienadhäsion ab, indem Oberflächen verwendet werden, die mit bioziden Wirkstoffen wie Breitbandantibiotika oder Schwermetallen beschichtet sind5. Diese bioziden Ansätze werden durch die schnelle Ansammlung abgestorbener Bakterien und organischer Ablagerungen begrenzt, wodurch die Aktivität der beschichteten Oberflächen gegenüber neuen ankommenden Zellen verringert wird. Darüber hinaus ist die Verwendung von Oberflächen, die Biozide wie Antibiotika freisetzen, mit einer besorgniserregenden Selektion von Antibiotikaresistenzen verbunden6.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass nicht-antibiotische Antiadhäsionsstrategien auch wirksam in die Bildung von bakteriellem Biofilm eingreifen können7,8,9,10,11,12,13,14. Das Design bioinspirierter Materialien mit Antihaft-Oberflächeneigenschaften soll eine wirksame Lösung zum Schutz von Patientenpflegegeräten vor der Besiedlung durch Krankheitserreger darstellen und somit wichtige Infektionsschritte verhindern, vom ersten Oberflächenkontakt bis hin zu nachfolgenden Bakterien-Bakterien-Interaktionen15,16 ,17. Auch nicht-biozide und biobasierte Strategien werden aktiv erforscht, einschließlich Ansätzen zur Verhinderung und/oder Zerstörung von Biofilmen mithilfe von Quorum-Sensing-Inhibitoren, die die bakterielle Kommunikation beeinträchtigen18. Bakterien sezernieren auch Biotenside, die die Oberflächeneigenschaften von Materialien wie Benetzbarkeit und Ladung verändern19,20. Diese oberflächenaktiven Verbindungen reduzieren Oberflächenkontakte und tragen zur Bakterienmotilität bei oder sind an konkurrierenden Wechselwirkungen zwischen Bakterien beteiligt12. Während viele dieser Moleküle kleinen Lipopeptiden entsprechen, haben neuere Studien gezeigt, dass von verschiedenen Bakterien freigesetzte Kapselpolysaccharide mit hohem Molekulargewicht die Adhäsion verhindern können, die zur anschließenden Zellaggregation und zur Bildung von Biofilmen durch ein breites Spektrum von Gram+- und Gram-Bakterien führt. Dazu gehören mehrere nosokomiale Krankheitserreger wie Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis und Enterococcus faecalis7,9,11,21,22,23,24.

Im Gegensatz zu sekretierten bakteriellen antagonistischen Makromolekülen wie Colicinen, Toxinen, Phagen und einigen toxischen oberflächenaktiven Verbindungen25,26 sind diese Antibiofilm-Polysaccharide nicht biozid11. Sie beeinträchtigen die Wechselwirkungen zwischen Bakterien und biotischer/abiotischer Oberfläche, die durch Adhäsionsfaktoren wie Pili, Adhäsine oder extrazelluläre Matrixpolymere vermittelt werden, indem sie die Benetzbarkeit, Ladung und die gesamten Kontakteigenschaften zwischen Bakterien und Oberfläche modifizieren7,12,18. Die Verwendung dieser nicht bioziden Antibiofilm-Makromoleküle wurde als vielversprechender Ansatz ohne Resistenz zur Reduzierung pathogener Biofilme und biofilmassoziierter bakterieller Infektionen vorgeschlagen und gleichzeitig die durch Breitbandbiozide verursachten Nebenwirkungen vermieden11,23,27. Allerdings behindert die begrenzte Beschreibung der chemischen und strukturellen Grundlagen der Aktivität dieser Antibiofilm-Makromoleküle ihre prophylaktische Verwendung zur bakteriellen Biofilmkontrolle erheblich.

Hier untersuchen wir die Antibiofilmaktivität einer Gruppe von 31 gereinigten Gram+- oder Gram-bakteriellen Kapselpolysacchariden bekannter Zusammensetzung und Struktur. Darunter fanden wir neun neue nicht-biozide Polysaccharide, die die Biofilmbildung durch prototypische nosokomiale Krankheitserreger, darunter E. coli und S. aureus, hemmen. Dies ermöglichte es uns, einen Struktur-Funktions-Vergleich ausreichend aktiver und inaktiver Polysaccharide durchzuführen und zu zeigen, dass Antibiofilm-Kapselpolysaccharide durch eine hohe intrinsische Viskosität und eine spezifische elektrokinetische Signatur gekennzeichnet sind. Unsere Studie identifiziert daher wichtige chemische und biophysikalische Eigenschaften bakterieller Antibiofilm-Polysaccharide und liefert so Erkenntnisse, die den Weg für die Entwicklung neuer und genau definierter nicht biozider oberflächenaktiver Makromoleküle zur Kontrolle der Biofilmbildung in medizinischen und industriellen Umgebungen ebnen.

Um die möglichen Beziehungen zwischen Zusammensetzung, Struktur, Größe und Aktivität nicht-biozider bakterieller Antibiofilm-Polysaccharide zu untersuchen, haben wir zunächst die Struktur der Gruppe-2-Kapsel (G2cps) bestimmt, einem zuvor identifizierten hydrophilen und negativ geladenen Antiadhäsionspolysaccharid, das sowohl auf Gram+ als auch auf Gram aktiv ist - Bakterien, die auf natürliche Weise produziert und freigesetzt werden, insbesondere durch uropathogene E. coli-Stämme7. G2cps wurde durch Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie – gepulste amperometrische Detektion (HPAEC-PAD), Hochleistungs-Größenausschlusschromatographie gekoppelt mit statischer Lichtstreuung (HPSEC-LS) und durch 1H-, 31P- und 13C-Kernspinresonanz (NMR) analysiert. Studien. Diese Analysen zeigten, dass das G2cps-Polysaccharid aus sich wiederholenden Einheiten besteht, die aus O-acetylierten und Glycerinphosphatresten mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 800 kDa bestehen, wie in Abb. 1A dargestellt. Diese Struktur ähnelt der der E. coli-Polysaccharide K2 und K62 (auch K2ab genannt)28. Anschließend reduzierten wir schrittweise die Größe des G2cps-Polysaccharids und bewahrten gleichzeitig seine strukturelle Integrität durch radikalische Oxidationshydrolyse (ergänzende Abbildung 1). Die Bestimmung der Antibiofilmaktivität von G2cps in voller Länge und fragmentiertem G2cps zeigte, dass selbst eine geringfügige Verringerung der Polysaccharidgröße zu einem Verlust der G2cps-Aktivität führte (Abb. 1B), was darauf hinweist, dass die Beibehaltung der Größe des G2cps-Polymers für seine Antiadhäsionseigenschaften entscheidend ist.

A Struktur und Zusammensetzung des G2cps-Polysaccharids. B Biofilm-Hemmungsaktivität gegen E. coli- und S. aureus-Biofilm von nativem und fragmentiertem G2cps-Polysaccharid. Biofilmtests wurden in Gegenwart von 50 μg/ml Polysaccharid durchgeführt. Jedes Experiment entspricht n = 3 unabhängigen Experimenten. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Statistische Analysen entsprechen einem zweiseitigen ungepaarten t-Test mit Welch-Korrektur. **p < 0,01; ***p < 0,001. Fehlerbalken stellen SD dar.

Um weitere Struktur- oder Zusammensetzungsmerkmale von G2cps zu identifizieren, die mit seiner Aktivität verbunden sind, haben wir eine Sammlung von 29 verschiedenen bakteriellen Polysacchariden mit hohem Molekulargewicht untersucht, um Makromoleküle mit G2cps-ähnlichen Antibiofilmeigenschaften zu erkennen. Bei den meisten davon handelt es sich um Kapselpolysaccharide bekannter Herkunft, Zusammensetzung und Struktur, die aus verschiedenen Stämmen von Streptococcus pneumoniae, Salmonella enterica Serovar Typhi, Haemophilus influenzae und Neisseria meningitidis hergestellt und gereinigt werden und als Antigene in mehreren Polysaccharid- und Glykokonjugat-Humanimpfstoffen verwendet werden (Ergänzungstabelle 1). ). Mithilfe eines statischen Mikrotiterplatten-Biofilmtests und anschließender Kristallviolettfärbung konnten wir zeigen, dass die Polysaccharide Vi, MenA und MenC bei äquivalenter Konzentration (100 µg/ml) bei der Hemmung der Bildung von E. coli-Biofilmen genauso aktiv waren wie G2cps, jedoch weniger aktiv waren S. aureus-Biofilme (Abb. 2A, B). Während PRP und PnPS3 auf beide Bakterien aktiv waren, war die Aktivität von PnPS12F auf E. coli und die von PnPS18C auf S. aureus beschränkt (Abb. 2A, B). Der Vergleich der Aktivität von Vi, PRP, PnPS3, MenA und MenC zeigte, dass Vi das aktivste Polysaccharid ist und alle 5 Polysaccharide nicht biozid sind (Ergänzende Abbildungen 2 und 3). Wir bestätigten diese Ergebnisse mit einem dynamischen Assay unter Verwendung von Biofilm-Mikrofermentern mit kontinuierlichem Durchfluss und zeigten, dass Vi auch die Bildung von E. coli- und S. aureus-Biofilmen stark hemmte, während diese Hemmung bei der Behandlung mit dem inaktiven Polysaccharid PnPS8 nicht beobachtet wurde (Abb. 3). Diese Analyse bestätigte auch die Schmalspektrumaktivität des PnPS18C-Polysaccharids (aktiv bei S. aureus, aber inaktiv bei E. coli) und von PnPS12F (inaktiv bei S. aureus, aber aktiv bei E. coli) (Abb. 3).

Biofilmbildungstest für E. coli (Panel A) oder S. aureus (Panel B) in Gegenwart gereinigter bakterieller Polysaccharide. G2cps wurde als Positivkontrolle aktiver Makromoleküle einbezogen und Wasser wurde als Negativkontrolle verwendet. Rot: aktive Polysaccharide mit Vi, MenA, MenC, G2cps, PRP und PnPS3 mit breitem Wirkungsspektrum, während PnPS18C nur gegen Gram+-Bakterien und PnPS12F gegen Gram-Bakterien aktiv ist. Jedes Experiment entspricht n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten in Gegenwart von 100 μg/ml jedes Makromoleküls, mit Ausnahme der Kontrolle (n = 4). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Statistische Analysen entsprechen einem zweiseitigen ungepaarten t-Test mit Welch-Korrektur. Fehlerbalken stellen SD dar. **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

Eine Quantifizierung des in Mikrofermentern durch den E. coli-Stamm gebildeten Biofilms in M63B1glu-Medium, ergänzt oder nicht mit 100 μg/ml Vi, PnPS8, PnPS18C oder PnPS12F, und Bilder repräsentativer entsprechender Spatel nach 24 Stunden kontinuierlichem Wachstum. Jedes Experiment entspricht n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten, mit Ausnahme der Kontrolle (n = 4). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Statistische Analysen entsprechen einem zweiseitigen ungepaarten t-Test mit Welch-Korrektur. Fehlerbalken stellen SD dar. B Quantifizierung des in Mikrofermentern durch den S. aureus-Stamm gebildeten Biofilms in TSB-Medium, ergänzt oder nicht mit 100 μg/ml Vi, PnPS8, PnPS18C oder PnPS12F, und Bilder repräsentativer entsprechender Spatel nach 24 Stunden kontinuierlichem Wachstum. Jedes Experiment entspricht n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten, mit Ausnahme der Kontrolle (n = 4). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Statistische Analysen entsprechen einem zweiseitigen ungepaarten t-Test mit Welch-Korrektur. ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Fehlerbalken stellen SD dar.

Schließlich bestätigten wir die Aktivität von Vi, MenA, MenC, PRP und PnPS3 auf einer Reihe biofilmbildender Gram+- oder Gram-Bakterien, darunter ein biofilmbildender E. coli K-12 MG1655, der ein F-konjugatives Plasmid trägt, Enterobacter cloacae 1092, K. pneumoniae Kp21, S. aureus 15981 und S. epidermidis O47 (Ergänzende Abbildung 4).

Um die strukturellen und biophysikalischen Eigenschaften zu identifizieren, die möglicherweise mit der Antibiofilmaktivität von Polysacchariden korrelieren, verwendeten wir HPSEC, um das Molekulargewicht (Mw) und die intrinsische Viskosität ([η]) der 8 identifizierten aktiven Polysaccharide (G2cps, Vi, MenA, MenC, PnPS3, PRP, PnPS12F, PnPS18C) und 21 inaktive Polysaccharide (Tabelle 1). Die intrinsische Viskosität [η] eines gegebenen Polysaccharids spiegelt seinen Beitrag zur Viskosität η der gesamten Lösung wider, d steht für den Volumenanteil der Polysaccharide in Lösung. Dementsprechend hängt [η] von der Konformation ab, die die Polysaccharide in der Lösung einnehmen. Diese Konformation selbst wird durch mehrere physikalisch-chemische Parameter vermittelt, darunter die vom Polysaccharid getragenen elektrostatischen Ladungen und die Ladungsverteilung innerhalb des makromolekularen Körpers. Die Kombination der Mw- und [η]-Parameter gibt Aufschluss über das Volumen (pro Masseneinheit), das von den Polysacchariden in der Lösung eingenommen wird. Diese Analyse ergab eine bemerkenswerte Korrelation zwischen der Grenzviskosität und der Breitband-Antibiofilmaktivität. Tatsächlich weisen alle inaktiven Makromoleküle systematisch die niedrigsten Werte von [η] auf, wohingegen aktive Polysaccharide durch eine hohe (> 7 dl/g) Grenzviskosität gekennzeichnet sind (ergänzende Abbildung 5). Darüber hinaus decken das Molekulargewicht Mw und die intrinsische Viskosität [η] von Polysacchariden mit mittlerer Aktivität mit schmalem Spektrum (PnPS18C und PnPS12F) einen Wertebereich ab, der sowohl für aktive als auch für nicht aktive Makromoleküle mit breitem Spektrum gemessen wird. Um festzustellen, ob eine hohe intrinsische Viskosität ein Hinweis auf eine mögliche Antibiofilmaktivität sein könnte, haben wir weitere gereinigte bakterielle Kapselpolysaccharide aus unserer Sammlung untersucht und zwei solcher nicht-bioziden Polysaccharide, MenY und MenW135 (ergänzende Abbildung 3), identifiziert, die eine hohe intrinsische Viskosität aufweisen (Tabelle 1 und ergänzende Abb. 5). Obwohl sich MenY und MenW135 in ihrer Primärzusammensetzung von Vi, MenA, MenC und G2cps unterscheiden, zeigten beide eine ähnliche Breitband-Antibiofilmaktivität (Abb. 4 und ergänzende Abb. 6). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine spezifische Polysaccharidkonformation, die sich in einer hohen intrinsischen Viskosität widerspiegelt,29 ein entscheidender Faktor für die Antibiofilmaktivität sein könnte.

A Chemische Zusammensetzung und saures/hydrophobes Gruppenverhältnis der N. meningitidis-Polysaccharide MenY und MenW135. Antibiofilmaktivität gegen E. coli (B) und S. aureus (C) mit MenY und MenW135 im Vergleich zu zuvor identifizierten aktiven Makromolekülen Vi und MenA. Tests zur Biofilmhemmung wurden in Gegenwart von 50 μg/ml Polysaccharid durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde destilliertes Wasser verwendet. Jedes Experiment entspricht n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten, mit Ausnahme der Kontrolle (n = 8). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Statistische Analysen entsprechen einem zweiseitigen ungepaarten t-Test mit Welch-Korrektur. **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Fehlerbalken stellen SD dar.

Um die molekularen Grundlagen der biophysikalischen Eigenschaften aktiver Polysaccharide weiter zu identifizieren, verglichen wir zunächst die Zusammensetzung der Breitspektrum-Polysaccharide (Vi, MenA, MenW135, MenY, MenC, G2cps, PRP, PnPS3), konnten jedoch kein chemisches Merkmal identifizieren allen aktiven Molekülen gemeinsam. Alternativ haben wir getestet, ob eine erhöhte Oberflächenhydrophilie, die zuvor mit den Eigenschaften des G2cps-Polysaccharids7,9 in Verbindung gebracht wurde, mit der Antibiofilmaktivität der neu identifizierten aktiven Polysaccharide korrelieren könnte. Die Bestimmung des Oberflächenkontaktwinkels eines Wassertropfens auf hydrophilen Glas- und hydrophoben Kunststoffoberflächen, die entweder mit destilliertem entionisiertem Wasser oder aktiven und inaktiven Polysacchariden behandelt wurden, ergab jedoch keinen Zusammenhang zwischen dem Hydrophilie-/Hydrophobie-Gleichgewicht der Oberfläche und der Antibiofilmaktivität (ergänzende Abbildung). 7). Als zusätzliche Unterstützung für diesen Befund ergab die Charakterisierung von Polysaccharid-beschichteten Oberflächen mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM), die im Kraftspektroskopiemodus unter Verwendung von CH3-funktionalisierten nanometrischen Spitzen durchgeführt wurde, keine Korrelation zwischen der Antibiofilmaktivität, den strukturellen Oberflächenmustern adsorbierter Polysaccharide und der Oberflächenhydrophobie /Hydrophilie (Ergänzende Abbildung 8). Wir haben auch die makromolekulare Ladung bewertet, definiert durch einen Ladungsindex i, der dem Verhältnis zwischen der Anzahl der Säuregruppen (getragen von Uronsäure- und Neuraminsäuregruppen oder von Phosphatgruppen) und der Anzahl der Monosaccharidreste in einer Wiederholungseinheit entspricht (Tabelle 1). . Die Bestimmung dieses Ladungsindex zeigte, dass alle aktiven Polysaccharide (Vi, MenA, MenW135, MenY, MenC, G2cps, PRP, PnPS3) höchsten i-Werten mit i = 0,5 oder 1 entsprechen. Im Gegensatz dazu entsprechen Makromoleküle ohne Antibiofilmaktivität und mit Die Aktivität mit schmalem Spektrum konnte nicht anhand ihrer jeweiligen i-Werte unterschieden werden. Beispielsweise hat PnPS18C (geringe Aktivität) einen ähnlichen Wert von i (=0,2) wie PnPS9V und PnPS22F (keine Aktivität). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Dichte der von den Polysacchariden getragenen negativen Ladungen ein entscheidender Faktor für die biophysikalischen Eigenschaften sein könnte, die mit der Breitband-Antibiofilmaktivität verbunden sind.

Frühere Berichte dokumentierten den Zusammenhang zwischen Struktur, Oberflächenladungsorganisation und elektrokinetischen Eigenschaften von Makromolekülen30,31,32, wie sie aus der Elektrophorese abgeleitet wurden. Bakterielle Polysaccharide sind Musterbeispiele für „weiche“ Makromoleküle, dh polyelektrolytische Anordnungen, die durch eine dreidimensionale Ladungsverteilung definiert sind und für Ionen aus der Hintergrundelektrolytlösung und für den unter Elektrophorese-Messbedingungen entwickelten elektroosmotischen Fluss durchlässig sind30,31,32.

Um festzustellen, ob die elektrokinetischen Eigenschaften von Polysacchariden (die sowohl Ladungsdichte- als auch Flusspermeabilitätsmerkmale umfassen) mit ihrer Antibiofilmaktivität zusammenhängen oder nicht, führten wir Blindmessungen der elektrophoretischen Mobilität (μ) als Funktion der NaNO3-Elektrolytkonzentration in Lösung durch (1). mM bis 100 mM-Bereich) für alle 8 Breitspektrum-Polysaccharide (Vi, MenA, MenC, MenY, MenW135, G2cps, PRP, PnPS3) und 2 Schmalspektrum-Polysaccharide (PnPS18C und PnPS12F).

Die elektrophoretische Mobilität dieser aktiven Polysaccharide wurde dann mit der von 11 inaktiven Polysacchariden (PnPS1, PnPS4, PnPS9V, PnPS8, PnPS19A, PnPS20, PNPS10A, PnPS15B, PnPS7F, PnPS22F und PnPS14) verglichen (Abb. 5). Alle getesteten Polysaccharide zeigten die charakteristische elektrophoretische Signatur, die für weiche Makromoleküle erwartet wird, wobei die elektrophoretische Mobilität bei ausreichend hohen Salzkonzentrationen (>30 mM) zu einem konstanten Mobilitätsplateauwert ungleich Null (unten als μ* angegeben) tendiert. Diese Eigenschaft ist die direkte Folge des Eindringens des elektroosmotischen Flusses in die geladene kugelförmige Polysaccharidstruktur33. Eine weitere qualitative Untersuchung der für die interessierenden Polysaccharide gesammelten elektrokinetischen Datensätze ergab zwei elektrokinetische Hauptmuster. Das erste entsprach den 11 getesteten inaktiven Makromolekülen, deren elektrophoretische Mobilität systematisch zu einem Wert von μ* tendiert, der 0,5 < │μ*│ <1,5 × 10−8 m2 V−1 s−1 erfüllt. Bei diesen Makromolekülen nimmt der absolute Wert der elektrophoretischen Mobilität mit zunehmender Elektrolytkonzentration aufgrund der Abschirmung der Polysaccharidladungen durch die Elektrolytionen ab. Dieses Merkmal wird auch von den aktiven Makromolekülen (PnPS3, PRP und G2cps) geteilt, mit dem bemerkenswerten Unterschied, dass ihr asymptotischer Mobilitätswert │μ*│ deutlich größer ist, wobei μ* nun die Ungleichung │μ*│ >2 × 10−8 m2 erfüllt V−1 s−1 (Abb. 5A). Das zweite beobachtete elektrokinetische Muster gilt für Makromoleküle mit Aktivitäten mit engem (PnPS18C und PnPS12F) oder breitem Spektrum (Vi, MenA, MenC, MenY und MenW135), bei denen die elektrophoretische Mobilität μ mäßig oder schlecht von der Hintergrundelektrolytkonzentration abhängt. Bemerkenswerterweise zeichnen sich aktive Makromoleküle mit Schmalspektrum-Antibiofilmaktivität durch elektrophoretische Mobilitäten (│μ*│ <0,5 × 10−8 m2 V−1 s−1) aus, die im Vergleich zu denen, die für Breitspektrum-Antibiofilmpolysaccharide gemessen werden, viel geringer sind (Vi, MenA, MenC, MenY und MenW135, │μ*│ >1,5 × 10−8 m2 V−1 s−1) (Abb. 5B). Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass aktive Kapselpolysaccharide durch eine spezifische elektrokinetische Signatur gekennzeichnet sind.

Punkte: experimentelle Daten. Gestrichelte Linien: Theorie (Gl. 1). Ein Polysaccharid, dessen elektrophoretische Mobilität wesentlich von der Ionenstärke der Lösung abhängt (festgelegt durch die NaNO3-Elektrolytkonzentration). B Bakterielle Polysaccharide, deren elektrokinetische Eigenschaften kaum bis mäßig von der Elektrolytkonzentration abhängen. Polysaccharide mit roten Namen weisen eine Breitband-Antibiofilmaktivität auf. PnPS12F und PnPS18C zeigen eine Antibiofilmaktivität mit schmalem Spektrum (Tabelle S1). Jedes Experiment entspricht n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen SD dar. In Tafel B umfasst die durch blaue gepunktete Linien begrenzte blaue Zone die von der Quasielektrolytkonzentration unabhängigen elektrophoretischen Mobilitätswerte, die für die Polysaccharide mit schmalbandiger Aktivität gemessen wurden. Die durch rote gepunktete Linien begrenzte rote Zone umfasst die von der Quasielektrolytkonzentration unabhängigen elektrophoretischen Mobilitätswerte, die für die Polysaccharide mit breitem Aktivitätsspektrum gemessen wurden. Jeder Datenpunkt entspricht n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Fehlerbalken stellen SD dar. Wenn sie nicht sichtbar sind, werden Fehlerbalken innerhalb ihres entsprechenden Datenpunkts ausgeblendet.

Um die elektrokinetischen Eigenschaften aktiver Kapselpolysaccharide weiter zu untersuchen, haben wir die Abhängigkeit der elektrophoretischen Mobilität (μ) der getesteten Makromoleküle von der NaNO3-Elektrolytkonzentration mithilfe der elektrokinetischen Theorie weicher Oberflächen quantitativ interpretiert. Diese Theorie wurde von Ohshima für die Elektrophorese weicher Kolloide33 im Hermans-Fujita-Limit entwickelt, das auf weiche Polyelektrolyte anwendbar ist34 (Gleichung 1 im Abschnitt Materialien und Methode). Zu diesem Zweck wurden die erforderlichen hydrodynamischen Radien der interessierenden Makromoleküle durch dynamische Lichtstreuung (DLS) nach Umrechnung der gemessenen Diffusionskoeffizienten mittels der Stokes-Einstein-Gleichung bestimmt (siehe Methoden und Ergänzungstabelle 2). Diese quantitative Analyse zeigte eine korrekte theoretische Rekonstruktion der für alle getesteten Makromoleküle gemessenen Elektrophoresedaten (Abb. 5) und, was am wichtigsten ist, eine bemerkenswerte Klassifizierung ihrer Aktivität (Abb. 6) nach ihren elektrostatischen und Flusspermeabilitätseigenschaften.

Die Ladungsdichte ρo (in C m−3) wird hier in Form einer äquivalenten Konzentration anionischer Ladungen angegeben, die durch ρo /F (in mM) definiert ist, wobei F die Faraday-Konstante ist. Das jedem Makromolekül zugeordnete Paar (ρo,1/λo) wird aus der Modellierung der Abhängigkeit der gemessenen elektrophoretischen Mobilität von der Elektrolytkonzentration in Lösung gemäß Gleichung (1) ermittelt. 1. Die gestrichelten Linien entsprechen dem Satz von Lösungen (ρo,1/λo) der Gleichung µ = µ*, die für die Makromoleküle PnPS18C und PnPS12F sowie für die Makromoleküle Vi, MenW135 und MenA erhalten wurden (siehe farbige Teile in Abb. 5B). deren Mobilität µ über den gesamten Elektrolytkonzentrationsbereich nicht wesentlich von dem bei hohen Elektrolytkonzentrationen (100 mM) gemessenen Mobilitätswert µ* abweicht. Für diese Makromoleküle erschwert die geringe Abhängigkeit von μ von der Elektrolytkonzentration eine genaue Bewertung von ρo und 1/λo, da sich die elektrokinetische Datenanpassung dann auf die Lösung einer Gleichung (Gleichung 1) mit zwei Unbekannten (ρo und 1/λo) reduziert. Der mit Vi, MenW135, MenA und PnPS18C, PnPS12F verbundene Lösungsraum (ρo,1/λo) entspricht den roten bzw. blauen Zonen. Sie werden durch gepunktete Linien abgegrenzt, die den (ρo,1/λo)-Lösungen der Gleichung µ = µ* entsprechen, wobei µ* sich mit den Polysaccharidmobilitäten identifiziert, die durch die gepunkteten Linien in Abb. 5B markiert sind. Der mit den Werten von ρo und 1/λo verbundene Fehler (abgeleitet aus der Levenberg-Marquardt-Anpassung der in Abb. 5 angegebenen Daten) beträgt ±5 %. Dieser Fehler wird anhand der Standardabweichungen der angepassten experimentellen Daten in Abb. 5 geschätzt. Die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Diese Eigenschaften werden durch zwei Schlüsselparameter ausgedrückt, die aus der theoretischen Anpassung elektrophoretischer Daten an Gl. 1, nämlich: ρo, die Nettodichte der vom Makromolekül getragenen negativen Ladungen, und λo der sogenannte Weichheitsparameter. 1/λo (auch Brinkman-Länge genannt) entspricht dem Ausmaß der Durchdringung des elektroosmotischen Flusses innerhalb des Makromoleküls. 1/λo steht in engem Zusammenhang mit der Strukturkompaktheit des Polysaccharids und dem Grad der Verflechtung seiner konstituierenden Ketten. Alle Makromoleküle mit schmaler Spektrumaktivität (PnPS18C und PnPS12F) befinden sich im unteren linken Bereich des Diagramms und geben den ermittelten Wert von ρo als Funktion des entsprechenden 1/λo an (Abb. 6). Im Gegensatz dazu vereinen Polysaccharide mit einer Breitbandaktivität (z. B. Vi, MenA, MenC, MenY, MenW135, PRP, PnPS3, G2cps) eine hohe Ladungsdichte und eine große Brinkman-Längenskala und sind daher im oberen rechten Bereich zu finden ρo-1/λo-Darstellung (Abb. 6). Alle getesteten inaktiven Makromoleküle (PnPS1, PnPS4, PnPS9V, PnPS8, PnPS19A, PnPS20, PNPS10A, PnPS15B, PnPS7F, PnPS22F und PnPS14) sind in einer Region positioniert, die zwischen denen der aktiven Makromoleküle mit breitem Spektrum und aktiven Makromolekülen mit schmalem Spektrum liegt. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass trotz des Fehlens eines spezifischen molekularen Motivs, das mit Antibiofilm-Eigenschaften verbunden ist, die Kombination aus einer lockeren Struktur (d. h. einer großen Durchlässigkeit für Strömungen aufgrund einer großen Anzahl von Hohlräumen innerhalb der Partikel) und einer hohen Dichte getragener elektrostatischer Ladungen vorliegt ist für Polysaccharide von entscheidender Bedeutung, um eine Antibiofilmaktivität zu zeigen.

Die Hemmung der Bakterienadhäsion durch oberflächenaktive Verbindungen gilt als vielversprechender Ansatz, um die entscheidenden ersten Schritte der bakteriellen Biofilmbildung zu verhindern. In dieser Studie haben wir insgesamt 9 neue nicht-biozide Antibiofilm-Makromoleküle in einer Sammlung von 31 verschiedenen hochmolekularen bakteriellen Kapselpolysacchariden bekannter Struktur und Zusammensetzung identifiziert. Dadurch konnten wir ihre chemischen, strukturellen und elektrokinetischen Eigenschaften vergleichen, um wichtige molekulare und biophysikalische Determinanten zu identifizieren, die aktive von inaktiven Polysacchariden unterscheiden.

Die identifizierten aktiven Polysaccharide bestehen aus einer großen Anzahl sich wiederholender Oligosaccharide mit unterschiedlicher Zusammensetzung und Struktur. Dies legt nahe, dass über die spezifische molekulare Zusammensetzung des aktiven Polysaccharids hinaus die Determinante ihrer Antibiofilmaktivität eher von supramolekularen Merkmalen herrühren könnte. Wir haben durchweg gezeigt, dass die Größenintegrität des G2cps-Polysaccharids entscheidend für die Aufrechterhaltung seiner Antibiofilmaktivität ist. Wir haben auch gezeigt, dass eine hohe Grenzviskosität eine gemeinsame Eigenschaft breitspektrumaktiver Makromoleküle ist, die unter allen getesteten Polysacchariden den höchsten Ladungsindex i aufwiesen. Es zeigte sich, dass die für alle getesteten Makromoleküle gemessenen hydrodynamischen Radien einen relativ engen Bereich abdecken, der zwischen ca. 15 und 40 nm im hydrodynamischen Durchmesser (Ergänzungstabelle 2). Solche kleinen Schwankungen der Partikelgröße können den gut differenzierten Bereich der Grenzviskosität, der für nicht aktive und aktive Makromoleküle gemessen wird (1 bis 6 bzw. 7 bis 12 dl/g, siehe ergänzende Abbildung 5), nicht erklären, insbesondere nicht für beide Aktive und nicht aktive Polysaccharide weisen identische Molekulargewichtsbereiche auf (ergänzende Abbildung 5). Im Gegensatz dazu korrelieren die für aktive Makromoleküle gemessenen hohen Grenzviskositäten mit ihrem Ladungsindex i, was auf eine hohe Ladungsdichte hinweist. Diese Korrelation könnte auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass die viskosimetrischen Eigenschaften von Partikeldispersionen von den elektrostatischen Eigenschaften der Partikel abhängen, die das Ausmaß der sogenannten primären und sekundären elektroviskosen Effekte bestimmen35,36. Diese Effekte sind eine direkte Folge des Vorhandenseins geladener elektrischer Doppelschichten (EDL) an der Grenzfläche zwischen Makromolekül und Lösung und den daraus resultierenden elektrohydrodynamischen Wechselwirkungen zwischen Partikeln und Partikeln sowie Partikeln und Flüssigkeiten: Je größer die Dichte der Partikelladungen, desto signifikanter sind die elektrohydrodynamischen Wechselwirkungen. viskose Effekte werden35,36. Infolgedessen kann sich die Viskosität einer Lösung, die Makromoleküle ähnlicher Größe enthält, je nach Dichte ihrer getragenen elektrostatischen Ladungen erheblich unterscheiden35,36. Eine große Strömungsdurchdringung innerhalb des Partikelkörpers (erkennbar an einer hohen Brinkman-Länge, 1/λo, siehe Abb. 6) steht im Einklang mit der Existenz einer relativ lockeren Struktur, die von den Makromolekülen angenommen wird, und einer verringerten Reibungskraft, die sie auf elektrochemische Partikel ausüben. osmotischer Fluss während der Elektrophorese, was zu einer erheblichen elektrophoretischen Mobilität führt. Insgesamt korrelieren die identifizierten Eigenschaften einer lockeren makromolekularen Struktur in Kombination mit einer hohen Ladungsdichte und einer damit verbundenen hohen Grenzviskosität mit der Antibiofilmaktivität.

Die Analyse der elektrokinetischen Daten ergab sehr ausgeprägte elektrokinetische Muster, die mit einem breiten und schmalen Spektrum an Antibiofilmaktivitäten verbunden sind, wohingegen inaktive Makromoleküle ein intermediäres elektrokinetisches Verhalten zeigten (Abb. 6). Dies deutet darauf hin, dass die hohen und niedrigen Größenordnungen der Polysaccharidladungen ihre breite bzw. schmale Aktivität bestimmen könnten, da eine Ladungsdichte mit einer Größenordnung zwischen diesen beiden Extremen zu einem Aktivitätsverlust führte. Wir haben jedoch zuvor gezeigt, dass G2cps trotz seiner hohen negativen Ladung eine geringe Affinität zu kationischen Farbstoffen aufweist7, was darauf hindeutet, dass seine Wechselwirkung mit der umgebenden biotischen oder abiotischen Umgebung nicht nur durch Elektrostatik gesteuert wird, sondern möglicherweise auch eine Umgestaltung seiner Oberflächeneigenschaften mit sich bringt. Dies könnte möglicherweise Änderungen der Oberflächenhydratation oder der sterischen Abstoßung und eine daraus resultierende Einschränkung der Bakterienadhäsion umfassen7. Dies weist darauf hin, dass die Berücksichtigung der elektrostatischen Eigenschaften von Polysacchariden allein nicht ausreicht, um ihre Antibiofilmaktivität zu erklären. Die Analyse unserer elektrokinetischen Datensätze legt übereinstimmend nahe, dass die Organisation der Polymerketten und die daraus resultierenden Flusspermeabilitätseigenschaften der polysaccharidischen Makromoleküle (qualitativ angezeigt durch die Größe ihrer Brinkman-Länge) eine wichtige Rolle bei der Definition ihrer Antibiofilmaktivität spielen. Wenn man bedenkt, dass durch Elektrophorese nur Ladungen untersucht werden, die sich im peripheren Bereich der Makromoleküle befinden (35), sind die Lage dieser Ladungen und der Grad ihrer Exposition gegenüber der äußeren Lösung wahrscheinlich wichtige Faktoren, die der Antibiofilmaktivität zugrunde liegen.

Wie korreliert dann die molekulare Zusammensetzung der Polysaccharide mit der Antibiofilmaktivität? Die meisten aktiven Makromoleküle weisen eine hohe Dichte negativer Ladungen auf, die zur elektrostatischen Abstoßung negativ geladener Bakterien beitragen könnten. Es ist jedoch bekannt, dass bakterielle Oberflächenstrukturen wie Pili, Fimbrien, Lipopolysaccharide oder sogar polykationische Exopolysaccharide diese abstoßenden Kräfte überwinden und die Adhäsion und Aggregation von Bakterien fördern37,38,39. Wir gehen daher davon aus, dass die Richtung der Wechselwirkungen auf Oberflächen ein entscheidender Faktor für die Breitband-Antibiofilm-Polysaccharidaktivität sein könnte. Die richtige Exposition elektrostatischer Ladungen könnte die Abstoßungseffekte in den in dieser Studie identifizierten Antibiofilm-Makromolekülen optimieren. Darüber hinaus könnten ihre hohe Eigenviskosität und ihre relativ lockere Struktur die lokalen Adhäsionsbedingungen mechanisch verändern und die Wahrnehmung der Oberfläche durch Bakterien verändern, wodurch ihre Adhäsion in Gegenwart der identifizierten Polysaccharide minimiert wird41. Wir schlagen daher vor, dass die in unserer Studie identifizierten aktiven Antibiofilm-Polysaccharide eine mehrstufige Aktivität haben könnten, mit sowohl kurz- als auch langfristigen Modifikationen der Wechselwirkungen zwischen Oberfläche und Bakterien oder Bakterien und Bakterien, insbesondere durch eine Veränderung der lokalen Adhäsionsbedingungen auf der Klebefläche vorherrschend. Die Unterscheidung zwischen breiter, enger oder fehlender Aktivität würde daher von der spezifischen Kombination der biophysikalisch-chemischen Eigenschaften abhängen, die jedes Makromolekül aufweist.

Durch die Bereitstellung einer besseren Definition der chemischen und strukturellen Grundlagen der Breitband-Antibiofilmaktivität von Kapselpolysacchariden bietet unsere Studie die Möglichkeit, neue oberflächenaktive Polysaccharide auf der Grundlage ihrer biophysikalischen Eigenschaften zu identifizieren, aber auch Makromoleküle zu entwerfen und zu entwickeln, die sie nachahmen Antibiofilm-Polysaccharidaktivität durch Total- oder Teilsynthese. Diese Moleküle könnten als nicht-biozide Biofilmkontrollstrategien bei der prophylaktischen Behandlung gegen die anfängliche Anhaftung biofilmbildender Krankheitserreger auf medizinischen und industriellen Materialien eingesetzt werden.

Die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. Gram-Bakterien wurden in 0,4 % Glucose-M63B1-Minimalmedium (M63B1) oder in Lysogenie-Brühe (LB)-Medium bei 37 °C gezüchtet, bei Bedarf mit geeigneten Antibiotika. Gram+-Stämme wurden in tryptischer Sojabrühe (TSB), ergänzt mit 0,25 % Glucose, kultiviert. Die potenzielle biozide Wirkung von Antibiofilm-Polysacchariden wurde anhand der Wachstumskurvenbestimmung in Gegenwart von 100 μg/ml gereinigtem Polysaccharid bewertet.

Die in dieser Studie verwendeten Kapselpolysaccharide wurden von Sanofi, Marcy l'Etoile France und Swiftwater, USA, bezogen. E. coli-Polysaccharide wurden am Institut Pasteur in Paris hergestellt. Teichonsäurepolysaccharid (Zellwand-PS, CWPS) aus dem Streptococcus pneumoniae-Stamm CSR SCS2 stammte vom Statens Serum Institut (Ref. 3459).

Übernachtkulturen wurden auf eine OD600nm von 0,02 eingestellt, bevor 50 µl in Polyvinylchlorid (PVC)-Platten mit 96 Vertiefungen (Falcon; Becton Dickinson Labware, Oxnard, CA) inokuliert und im Verhältnis 1:1 zu 50 µl filtersterilisiertem, gereinigtem Produkt hinzugefügt wurden Polysaccharid in der gewünschten Konzentration: i) 50 µg/ml für standardisierte Antibiofilm-Aktivitätsexperimente; ii) 3,125–100 µg/ml, um den Aktivitätsgrad der Makromoleküle zu testen. Man ließ die Biofilme 16 Stunden lang bei 37 °C wachsen. Anschließend wurde der Überstand aus jeder Vertiefung entfernt, dreimal mit Wasser gewaschen und der Biofilm 15 Minuten lang mit 1%iger Kristallviolettlösung gefärbt. Nach Entfernung der Kristallviolettlösung wurden die Biofilme dreimal mit Wasser gewaschen. Zur Quantifizierung der Biofilmbildung wurden getrocknete, gefärbte Biofilme in 30 %iger Essigsäure resuspendiert und die Absorption bei 585 nm mit einem Infinite-Plattenlesegerät Tecan Infinite M200 PRO gemessen. Die Biofilmbildung bei verschiedenen Stämmen wird in Werten dargestellt, die auf die durchschnittliche Biofilmbildung bei den Kontrollstämmen normalisiert sind.

Pyrex-Biofilm-Mikrofermenter mit einem abnehmbaren Pyrex-Glasspatel (VSN, Paris, Frankreich, Ref. 028703022601) wurden verwendet, um Biofilme unter kontinuierlichen Flussbedingungen zu züchten, wie in42 beschrieben (siehe auch https://research.pasteur.fr/en/tool/ Biofilm-Mikrofermenter/). Der Mediumfluss wurde unter interner Blasenbewegung unter Verwendung filtersterilisierter Druckluft auf 60 ml/h eingestellt. Diese Durchflussrate minimiert das Planktonwachstum gegenüber der Biofilmentwicklung durch ständige Verdünnung von Nicht-Biofilm-Bakterien. Die Inokulation erfolgte durch 5-minütiges Eintauchen des Glasspatels in OD600 = 1 M63B1 0,4 % Glucose-Minimalmedium (M63B1glu) für den E. coli-Stamm und in tryptische Sojabrühe 0,25 % Glucose (TSBglu) für den S. aureus-Stamm, ergänzt oder nicht mit 100 μg/ml gereinigtem Polysaccharid Vi, PnPS8, PnPS18C, PnPS12F. Nachdem sich die Bakterien an den Spateln festsetzen konnten, wurden sie wieder in den Mikrofermenter eingeführt, der mit den entsprechenden Medien und der gleichen Endkonzentration an getestetem Polysaccharid gefüllt war. Nach 24 Stunden kontinuierlicher Kultur wurden Bilder des Glasspatels gemacht und die Biofilm-Biomasse durch Bestimmung der OD600 nm des vom internen Mikrofermenter-Glasobjektträger resuspendierten Biofilms geschätzt.

Wachstumskurven von S. aureus und E. coli, die 100 μg/ml ausgesetzt waren, wurden in Gegenwart jedes angegebenen getesteten Makromoleküls gemessen (ergänzende Abbildung 3). Die Bakterienstämme wurden in Mikrotiterplatten mit einer OD600 nm von 0,05 inokuliert und in einem TECAN-Plattenlesegerät (Infinite 200 Pro) mit einer Orbitalschüttelamplitude von 2 mm 24 Stunden lang bei 37 °C wachsen gelassen. Das Bakterienwachstum wurde mit dem TECAN-Plattenlesegerät bestimmt.

G2cps-Polysaccharid wurde aus 24-Stunden-Kulturen wie in7 beschrieben erhalten. Kurz gesagt, CFT073-E.-coli-Stämme wurden 24 Stunden lang bei 37 °C in M63B1 0,4 % Glucose gezüchtet. Nach 10-minütiger Kaltzentrifugation (4 °C) bei 3800 g wurden die Überstände durch einen 0,22-µm-Filter filtriert. Polysaccharide wurden aus zellfreiem Überstand mit eiskaltem Ethanol (Verhältnis Ethanol/Überstand 3:1) ausgefällt und anschließend 2 Stunden lang bei 5000 g und 4 °C zentrifugiert. Ausgefällte Polysaccharide wurden resuspendiert und gegen entionisiertes Wasser dialysiert (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, Pierce, Rockford, IL). Die gesamten Polysaccharidkonzentrationen wurden mit dem kolorimetrischen Dubois-Assay43 gemessen. Die Polysaccharide wurden schließlich durch Gelfiltration auf einer Sepharose 6BCL-Säule (GE Healthcare Life Sciences) in 1 % Natriumdesoxycholat44 von restlichen Lipopolysacchariden getrennt und gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Die Polysaccharidkonzentration wurde mithilfe der Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie mit gepulster Amperometrie-Detektion (HPAEC-PAD) (Thermo Fischer Scientific, Dionex, Sunnyval, CA) wie zuvor beschrieben45 bestimmt.

Das Polysaccharid G2cps wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur mit Flusssäure (HF) (48 Massen-%) hydrolysiert. HF wurde durch Trocknen unter einem Stickstoffstrom bei 40 °C entfernt. Die Probe wurde in Wasser erneut gelöst und dann mit 2 M Trifluoressigsäure (TFA) 2 Stunden lang bei 121 °C hydrolysiert. TFA wurde durch Trocknen unter einem Stickstoffstrom bei 40 °C entfernt. Die Probe wurde vor der Analyse erneut in Wasser gelöst. Zu Vergleichszwecken wurden sowohl die HF-alleinige als auch die TFA-alleinige Hydrolyse auch am Polysaccharid G2cps durchgeführt. Es wurde eine gepulste amperometrische Detektion mit einer Wellenform mit vierfachem Potential verwendet. Die Daten wurden auf Computern gesammelt und analysiert, die mit der Dionex Chromeleon-Software (Dionex) ausgestattet waren. Als Standards wurden handelsübliche Monosaccharide verwendet.

Etwa 5 mg Polysaccharid wurden einmal lyophilisiert, in 700 µl deuteriertem Wasser gelöst und 550 µl in ein 5-mm-Röhrchen gefüllt. NMR-Spektren wurden auf einem Bruker Avance 500 MHz-Spektrometer mit der Topspin 2.1-Software bei einer angegebenen Sondentemperatur von 20 °C gesammelt. Die Spektren wurden für Lösungen in D2O mit 0,01 % DSS als internem Standard für Protonen-NMR (1H) (δ 0,00 ppm) gemessen. Phosphorsäure (2 %) wurde als externer Standard für Phosphor-NMR (31 P) (δ 0,00 ppm) und TSP als externer Standard für Kohlenstoff-NMR (13 C) (δ 0,00 ppm) verwendet. Die verwendeten Pulsprogramme waren diejenigen in der Bruker-Bibliothek mit Ausnahme der Diffusionsexperimente Korrelationsspektroskopie (COSY) und Totalkorrelationsspektroskopie (TOCSY). Die Diffusionsverzögerung betrug für diese zweidimensionalen Experimente 80 ms und die Mischzeit für TOCSY betrug 100 ms. Das zweidimensionale 1H-31P-Experiment wurde mit einem JH-P-Kopplungswert von 7 Hz erfasst. Die 1H-13C heteronuklearen Einzelquantenkohärenzspektren (HSQC) wurden mit einem nJH-C-Kopplungswert von 145 Hz und einem nJH-C-Kopplungswert mit großer Reichweite von 5 Hz für die heteronukleare Mehrfachbindungskorrelation (HMBC) erfasst.

Polysaccharide wurden in einer Konzentration zwischen 600 und 1000 μg/ml in Wasser analysiert. Die Analysen wurden mit einem TDA301 Viscotek HPSEC-System durchgeführt, das aus einem automatischen Probenehmer mit einer HPLC-Pumpe, ausgestattet mit einer Injektionsschleife von 100 μl, einem Online-Entgaser, einem Viskosimeter, einem Brechungsindex (RI) und einem rechtwinkligen Laserlicht besteht Streudetektor (RALLS). Die HPSEC-Analysen von Polysacchariden wurden unter Verwendung der in Reihe geschalteten Analysesäulen TSK G4000 PWXL (0,7 × 30 cm) und TSK G6000 PWXL (0,7 × 30 cm) mit einer Flussrate von 0,5 ml/min und bei 30 °C durchgeführt. Als mobile Phase wurde Tris-Puffer 2,5 mM, pH 7,5 oder Phosphatpuffer 200 mM pH 6,9 verwendet. Die Säulen wurden auf einer konstanten Temperatur von 30 °C gehalten. Für die Datenerfassung und Datenverarbeitung wurde die Software Omnisec (Malvern) verwendet. Diese dreifache Detektion bestehend aus Online-RI, RALLS und viskometrischem Detektor wurde zur Bestimmung des Molekulargewichts (Mw) und der intrinsischen Viskosität ([η]) von Polysacchariden verwendet.

Insgesamt 7,5 mg Polysaccharid wurden in einer Lösung mit Ascorbinsäure, Kupfer und Eisensulfat bei 30 °C hydrolysiert. Die Hydrolysekinetik wurde durch HPSEC-Analyse für 15 Minuten, 1 Stunde und 24 Stunden verfolgt.

Glasdeckplättchen (24 x 50 mm Menzel-Glaser Thermo Scientific Ref. 17234914) oder 17 × 28 mm Polyester-Kunststoffdeckplättchen (Thermo Scientific Ref. AB-0578) wurden mit 80 µl destilliertem entionisiertem Wasser oder mit 100 µg/ml Lösung gereinigter aktiver und inaktiver Substanzen behandelt Polysaccharide. Die Objektträger wurden unter einer Laminarströmungshaube getrocknet und 2,5 μl Wassertropfen wurden mit einem Kruss DSA4 Tropfenformanalysator auf der Oberfläche beschichteter und unbeschichteter Objektträger abgeschieden und der Kontaktwinkel wurde dann dreimal gemessen.

Mikroskopie-Objektträger wurden 10 Minuten lang mit einer 100 µg/ml-Lösung gereinigter aktiver und inaktiver Polysaccharide behandelt und mit hochreinem Wasser gespült. AFM-Messungen wurden in Reinstwasser unter Verwendung eines Fastscan Dimension Icon mit Nanscope V-Controller (Bruker) durchgeführt. Die Bilder wurden im Peak-Force-Tapping-Modus mit goldbeschichteten Siliziumnitridspitzen (NPG, Bruker) mit einer maximal angelegten Kraft von 500 pN, einer Scanrate von 1 Hz, einer Peak-Force-Amplitude von 300 nm und einer Peak-Kraft aufgenommen Frequenz von 2 kHz. Zur Quantifizierung der Hydrophobie beschichteter Oberflächen mittels chemischer Kraftmikroskopie wurden hydrophobe Spitzen hergestellt, indem goldbeschichtete Siliziumnitridspitzen (NPG, Bruker) 12 Stunden lang in eine 1 mM Lösung von Dodecanthiol (Sigma) in Ethanol eingetaucht, mit Ethanol gespült und getrocknet wurden mit N2. Räumliche Abbildungen wurden durch die Aufzeichnung von 32 × 32 Annäherungs- und Rückzugskraft-Abstandskurven auf 5 µm × 5 µm großen Flächen mit einer maximal ausgeübten Kraft von 500 pN und einer Annäherungs- und Rückzugsgeschwindigkeit von 500 nm/s erhalten.

1 g/L-Stammsuspensionen von Makromolekülen wurden zunächst in Reinstwasser aus entsprechenden gefrorenen Pulvern hergestellt und nach 48 Stunden wurden die Suspensionen auf 250 mg/L verdünnt und auf pH 5 eingestellt. Für jedes getestete Makromolekül wurden dann Chargen hergestellt, um dies zu erreichen Erhalten Sie eine Reihe von Suspensionen mit einer NaNO3-Hintergrundelektrolytkonzentration im Bereich von 1 bis 100 mM. Die endgültige Makromolekülkonzentration und die pH-Bedingungen wurden übernommen, um die gemessene elektrophoretische Reaktion zu optimieren, nachdem ein Bereich von Partikelkonzentrationen von 50 bis 250 mg/L und vier pH-Bedingungen (3, 5, 7 und 9) getestet wurden. Alle Dispersionen, Stammlösungen und verdünnten Suspensionen wurden bei 4 °C gelagert und vor den Messungen erneut bei Raumtemperatur akklimatisiert.

Nach 24 bis 48 Stunden Chargenvorbereitung wurden Diffusionskoeffizienten (umgerechnet in Partikeldurchmesser unter Verwendung der Stokes-Einstein-Gleichung) und elektrophoretische Mobilitäten der bakteriellen Polysaccharide durch dynamische Lichtstreuung (DLS, Ergänzungstabelle 2) und Phasenanalyse-Lichtstreuung (Malvern Instruments) gemessen ). Jeder in Abb. 5 angegebene Datenpunkt entspricht drei Messungen, die an drei verschiedenen Aliquots einer gegebenen Charge einer Makromoleküldispersion durchgeführt wurden.

Die elektrophoretische Mobilität der verschiedenen interessierenden Makromoleküle wurde als Funktion der NaNO3-Elektrolytkonzentration gemessen (Abb. 5) und mit der von Ohshima entwickelten analytischen Theorie für die Elektrophorese weicher Kolloide33 im Hermans-Fujita-Grenzwert verglichen, der für weiche Polyelektrolyte gilt34. Demnach wird μ durch den Ausdruck definiert

wobei ρo die Dichte der vom Makromolekül getragenen negativen Ladungen darstellt, κ die reziproke Dicke der Debye-Schicht ist, definiert durch \(\kappa={[2{F}^{2}{c}_{{{{{{\rm{ o}}}}}}}/(\varepsilon RT)]}^{1/2}\) mit R der Gaskonstante, T der absoluten Temperatur, F der Faraday-Zahl und co der Massenkonzentration eines 1:1-Elektrolyten (NaNO3 in dieser Arbeit) ist λo der sogenannte Weichheitsparameter, wobei 1/λo der charakteristischen Eindringlänge des elektroosmotischen Flusses innerhalb des Makromoleküls entspricht. Die Größe b in Gl. 1 ist der Radius des Polyelektrolyt-Makromoleküls. Der Satz von (ρo,1/λo)-Paaren, die für alle polysaccharidischen Makromoleküle erhalten wurden, ist in der Ergänzungstabelle 2 angegeben und die erforderlichen Werte von b für die Datenanpassung an Gleichung. 1 wurden durch dynamische Lichtstreuung bestimmt und sind auch in der Ergänzungstabelle 2 angegeben. Die Abhängigkeit der elektrophoretischen Mobilitätsdaten von der Elektrolytkonzentration wurde mithilfe der Levenberg-Marquardt-Methode mit der Mathcad 13-Software angepasst.

Zweiseitige ungepaarte t-Tests mit Welch-Korrekturanalysen wurden mit Prism 9.0 für Mac OS X (GraphPad-Software) durchgeführt. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal durchgeführt. Alle Daten werden in den Abbildungen als Mittelwert (±Standardabweichung, SD) ausgedrückt. Unterschiede wurden für p-Werte von <0,05 als statistisch signifikant angesehen; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. ****p < 0,0001.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle in dieser Studie generierten Daten und ihre Zusatzinformationen werden als ergänzende Quelldatendatei in den Zusatzinformationen bereitgestellt. Diese Microsoft Excel-Datei stellt die Quelldaten bereit, die in den Abbildungen im Haupttext und in den Zusatzinformationen angezeigt werden. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Olaya Rendueles für hilfreiche Diskussionen und Nadia Izadi und Laurence Mulard für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken Heike Claus, Ulrich Vogel und Muhamed-kheir Taha für die großzügige Unterstützung bei einigen der in dieser Studie verwendeten Stämme. Wir danken auch Sandrine Mariot von der Somacomic-Plattform Orsay für ihre Hilfe bei der Messung der Kontaktwinkel. Diese Arbeit wurde durch ein gemeinsames Forschungsstipendium des Instituts Pasteur und Sanofi sowie durch Zuschüsse des Investissement d'Avenir-Programms der französischen Regierung und des Laboratoire d'Excellence „Integrative Biologie neu auftretender Infektionskrankheiten“ (Zuschuss Nr. ANR-10-LABX-62-) unterstützt. IBEID an JMG) und von der Fondation pour la Recherche Médicale (Grant DEQ20180339185 an JMG). J. BB war Empfänger eines langfristigen Postdoktorandenstipendiums der Federation of European Biochemical Societies (FEBS) und des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Stipendienvereinbarung Nr. 842629. Diese Arbeit wurde teilweise durchgeführt im Pôle de Compétences Physico-Chimie de l'Environnement, LIEC-Labor UMR 7360 CNRS – Université de Lorraine.

Institut Pasteur Universität Paris Cité, CNRS UMR 6047, Labor für Genetik von Biofilmen, Paris, F-75015, Frankreich

Joaquín Bernal-Bayard, Laetitia Travier, Sylvie Létoffé, Christophe Beloin und Jean-Marc Ghigo

Abteilung für Genetik, Fakultät für Biologie, Universität Sevilla, Apartado 1095, 41080, Sevilla, Spanien

Joaquin Bernal-Bayard

Sanofi, Forschung und Entwicklung, Campus Mérieux, 1541 avenue Marcel Mérieux, 69280, Marcy l'Etoile, Frankreich

Jerome Thiebaud, Marina Brossaud, Bachra Rokbi, Philip Talaga & Christmas Mistretta

Universität Lothringen, CNRS, Interdisziplinäres Labor für kontinentale Umwelt (LIEC), F-54000, Nancy, Frankreich

Audrey Beaussart, Céline Caillet, Yves Waldvogel und Jérôme FL Duval

Institut Pasteur, Universität Paris Cité, Inserm U1224, Gruppe Gehirn-Immun-Kommunikation, F-75015, Paris, Frankreich

Laetitia Travier

Institut Pasteur, Université Paris Cité, INRAE, USC2019, Labor für Pilzbiologie und Pathogenität, F-75015, Paris, Frankreich

Thierry Fontaine

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JB-B., NM, PT, JFLD und J.-MG haben die Experimente entworfen. LT, CB und BR trugen zu den ersten Experimenten bei. JB-B., JT, MB, AB, CC, YW, SL, TF, J.-MG und PT führten die Experimente durch. JB-B., JT, MB, AB, TF, SL, PT, NM, JFLD und J.-MG analysierten die Daten. JB-B., JFLD und J.-MG haben den Artikel mit maßgeblichen Beiträgen von CB, JT, TF, AB, PT, BR und NM verfasst

Korrespondenz mit Noëlle Mistretta, Jérôme FL Duval oder Jean-Marc Ghigo.

JT, MB, BR, PT und NM sind Sanofi-Mitarbeiter und können Aktien oder Aktienoptionen des Unternehmens halten. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Meriem Bendaoud und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Bernal-Bayard, J., Thiebaud, J., Brossaud, M. et al. Bakterielle Kapselpolysaccharide mit Antibiofilmaktivität haben gemeinsame biophysikalische und elektrokinetische Eigenschaften. Nat Commun 14, 2553 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37925-8

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Eingegangen: 20. Juni 2022

Angenommen: 05. April 2023

Veröffentlicht: 03. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37925-8

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