Entwicklung genetischer Marker für Arzneimittelresistenz nach Einführung von Dihydroartemisinin

Feb 27, 2024

Malaria Journal Band 22, Artikelnummer: 231 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Dihydroartemisinin-Piperaquin ist seit 2008 Indonesiens erste Behandlung gegen Malaria. Jährliche Studien zur therapeutischen Wirksamkeit (TES), die in den letzten 12 Jahren durchgeführt wurden, zeigten eine anhaltend hohe Wirksamkeit der Behandlung bei unkomplizierter Plasmodium falciparum-Malaria. Obwohl diese Studien keine Hinweise auf eine Artemisinin-Resistenz zeigten, wurde im Laufe der Zeit ein leichter Anstieg von Spätbehandlungsversagen beobachtet. Es ist hervorzuheben, dass die Entwicklung genetischer Marker für die Arzneimittelresistenz von ACT-Partnern seit der Einführung von DHA-PPQ untersucht wird.

Trockene Blutflecken wurden bei einer Massenblutuntersuchung von Patienten mit unkomplizierter Falciparum-Malaria (N = 50) in Sumba von 2010 bis 2018 identifiziert. Analyse des genotypischen Profils (N = 51) und eine Therapeutische Wirksamkeitsstudie (TES) aus Papua (N = 142). ) von 2020 bis 2021, 42-tägige Nachuntersuchung. Zur Unterscheidung von Rekrudeszenz und Reinfektion wurde eine PCR-Korrektur mit msp1, msp2 und glurp verwendet. Parasiten-DNA aus DBSs wurde zur Genotypisierung molekularer Marker für die Resistenz gegen Malariamedikamente verwendet, darunter in Pfk13, pfcrt und pfmdr1 sowie für die Variation der Genkopienzahl in pfpm2/3 und pfmdr1.

Die Studie ergab das Fehlen von SNPs, die mit ART-Resistenz assoziiert sind, und mehrerer neuer SNPs wie L396F, I526V, M579I und N537S (4,25 %). In Sumba wurde der mutierte Haplotyp SDD von pfmdr1 in einem Drittel der Isolate gefunden, in Papua hingegen nur in 8,9 %. Es wurde keine der pfcrt-Mutationen im Zusammenhang mit einer Piperaquin-Resistenz beobachtet, aber 71 % der Isolate wiesen pfcrt I356L auf. Die Amplifikation der pfpm2/3-Gene erfolgte in Sumba (17,02 %) und Papua (13,7 %), während die Prävalenz der pfmdr1-Kopienzahl in beiden Gebieten niedrig war (3,8 %). Für die TES-Studie wurden an den Tagen 28, 35 und 42 zehn erneute Infektionen beobachtet. Ein spätes parasitologisches Versagen (LPF) wurde mikroskopisch bei 10/117 (8,5 %) Probanden beobachtet. Die PCR-Korrektur ergab, dass es sich bei allen neun Fällen um Reinfektionen handelte und bei einem Fall eine erneute Infektion festgestellt wurde.

Diese Studie ergab, dass DHA-PPQ immer noch hochwirksam gegen P. falciparum ist. Die genetische Architektur der Isolate des Parasiten P. falciparum im Zeitraum 2010–2021 ergab, dass einzelne Kopien von Pfpm2 und pfmdr1 weit verbreitet waren. Der leichte Anstieg des DHA-PPQ-LTF veranlasst die Forscher, andere ACTs als Alternativen zu DHA-PPQ für Basisdaten zu testen, um eine Chance zu erhalten, die Ziele zur Malaria-Eliminierung bis 2030 zu erreichen.

In Indonesien haben steigende Behandlungsversagensraten bei der Behandlung der unkomplizierten Falciparum-Malaria mit Chloroquin (CQ) und Sulfadoxin-Pyrimethamin (SP) seit 2004 zu einem Wechsel zur Artemisinin-basierten Kombinationstherapie (ACT) als Erstlinienbehandlung gegen Malaria geführt [ 1]. ACT kombiniert eine wirksame, aber kurzwirksame Artemisinin (ART)-Komponente mit einem weniger wirksamen, aber langwirksamen Partnerarzneimittel [2, 3]. Artesunat-Amodiaquin (AS-AQ) wurde zuerst eingeführt, aber Berichte über schlechte Verträglichkeit und steigende Behandlungsversagensraten führten 2008 zu einer Umstellung auf DHA-PPQ [4,5,6,7].

Seit 2010 ist dieses gut verträgliche und wirksame Regime aufgrund der zunehmenden CQ-Resistenz bei dieser Art auch zur Erstlinienbehandlung anderer menschlicher Malariaarten, einschließlich Plasmodium vivax, geworden [8]. Studien, die zwischen 1995 und 2002 in Nord-Sumatra, West-Kalimantan, Nord-Sulawesi, West-Nusa Tenggara, Ost-Nusa Tenggara und Papua durchgeführt wurden, haben durchweg ein Versagen der Behandlung von CQ bei P. vivax-Infektionen gezeigt. Seitdem war CQ keine wirksame Behandlung für akute Vivax-Malaria [9,10,11,12,13,14,15]. Mehrere Studien [4, 9, 16] haben eine hervorragende Wirksamkeit und Verträglichkeit der DHA-PPQ-Behandlung unkomplizierter Malaria in Indonesien dokumentiert, darunter auch in Papua, Indonesien [17]. Eine Artemisinin-Resistenz bei Plasmodium falciparum wurde in Indonesien bisher nicht nachgewiesen (Abb. 1).

Flussdiagramm für die Untersuchung von Probensätzen

Therapeutische Wirksamkeitsstudien (TES), die zwischen 2011 und 2018 in Süd-Sumatra, Zentral-Kalimantan, West-Kalimantan, Nord-Sulawesi, Zentral-Sulawesi, Nord-Maluku und Ost-Nusa Tenggara durchgeführt wurden, haben durchweg hohe 42-Tage-Heilungsraten mit DHA-PPQ für die Behandlung gezeigt der unkomplizierten Falciparum-Malaria. Es wurden keine Hinweise auf eine verzögerte Parasitenbeseitigung, das Kennzeichen der ART-Resistenz, gefunden [17]. Von 2017 bis 2018 ergab die molekulare Überwachung von K13 in Proben aus Papua-Neuguinea, dass alle P. falciparum-Isolate das Wildtyp-Allel von K13 trugen [18, 19]. Einige andere Mutationen, wie G453W (20 %), V454C (20 %), E455K (20 %) und T474A (2,6 %), wurden ebenfalls mit geringer Häufigkeit beobachtet [20]. In einigen Papua-Isolaten, die das DHA-PPQ überlebten, wurde eine erhöhte Kopienzahl des pfpm2/3-Gens festgestellt [5].

Auch wenn DHA–PPQ bei der Behandlung von Malariapatienten immer noch wirksam sind und es keine Hinweise auf ein Versagen der Behandlung gab, sollten Evaluierungsstudien für das genotypische Profil und zusätzliche Maßnahmen wie die Parasiten-Clearance-Zeit (PCT) und die Parasitendichte regelmäßig überwacht werden. Der Zeitraum zwischen der ersten Dosis des Patienten und dem Zeitpunkt des ersten negativen Blutspiegels wurde als PCT bezeichnet. Laut einer Studie in Papua wurden von April 2017 bis April 2018 in 7 von 102 Fällen, die die 42-tägige Nachuntersuchung abschlossen, wiederkehrende P. falciparum-Parasiten nachgewiesen und an den Tagen 21, 35 und 42 als LTF eingestuft. Von den 7 LTF-Fällen wurde einer erneut mit P. vivax infiziert, bei 2 wurde eine erneute Infektion bestätigt und bei den restlichen 4 handelte es sich um erneute Infektionen. Bei keinem Studienteilnehmer wurden eine Verzögerung der Parasitenbeseitigung oder schwere Nebenwirkungen beobachtet [5].

Die Wirksamkeit von ACT hängt von der Empfindlichkeit der Parasiten gegenüber beiden Komponenten der Kombination ab. Die Artemisinin-Resistenz kann durch die Beurteilung der Parasiten-Clearance-Rate und des Vorhandenseins von SNPs im Pfk13-Gen, einem etablierten Marker für ART-Resistenz, überwacht werden. Resistenzen gegen einige der ACT-Partnermedikamente können durch molekulare Überwachung überwacht werden. Dazu gehören: für PPQ-SNPs im pfcrt-Gen (Position 343, 350, 353) und Kopienzahlvariationen (CNVs) des P. falciparum-Plasmepsin2/3-Gens (pfpm2/3) und des pfmdr1-Gens. Zusätzlich für ART-SNPs im pfcrt-Gen (356).

Die vorliegende Studie zielt darauf ab, die Entwicklung genetischer Marker für die Resistenz gegen Malariamedikamente nach der Einführung von DHA-PPQ als Erstlinienmedikament gegen Malaria im Jahr 2010 für alle unkomplizierten Malariafälle sowie die zeitlichen Dynamiktrends der Entwicklung von pfk13 zu bewerten , pfcrt, pfmdr1-Gene, außerdem eine Kopienzahl von pfpm2/3 und pfmdr1 aus Sumba und Papua und Beobachtung von PCT einschließlich Parasitendichte. Dieses Risiko entsteht, da sich möglicherweise mehr Parasiten entwickeln, die gegen PPQ resistent sind.

Plasmodium falciparum-Parasiten-DNA aus Filterpapier-Blutflecken wurde aus zwei verschiedenen Probensatzstudien gewonnen, wie in Abb. 2 beschrieben. Der ausgewählte Bereich für Probensatzstudien basierte auf der Tatsache, dass beide Standorte eine hohe jährliche Parasiteninzidenz (API) aufwiesen. Die Gesamt-API in Jayapura und Keerom, Papua, betrug von 2019 bis 2021 95,43 bzw. 383,01, 92,42 bzw. 360,38, 73,08 bzw. 254,93 Fälle pro 1000 Einwohner. In West-Sumba und Südwest-Sumba, Ost-Nusa Tenggara API, wurden im Zeitraum 2019–2021 jeweils 33,22 und 11,95, 33,09 und 24,21, 16,79 und 10,97 Fälle verzeichnet [21].

Zeitpunkte historischer Höhepunkte der Resistenz gegen Malariamedikamente in Indonesien und Südostasien. Zitiert werden Studien von Wasis und Sandra [65], MoH [66], Hutapea [67], Tjitra et al. [52], Wells [53], Lim et al. [54], Ebisawa und Fukuyama [68], Rumans et al. [69], WHO [51], Cylde et al. [70], Baird et al. [71], Poespoprodjo et al. [72], Yuliani et al. [73], Ratcliff et al. [4], Lederman et al. [74], Sutanto et al. [75], Syafruddin et al. [48], Syafruddin et al. [33], Basuki et al. [76]

Im Zeitraum 2010–2018 wurden in Sumba durch aktive Fallerkennung 50 Blutflecken auf Filterpapier (3 MM; Whatman, Hillsboro, OR, USA) mit einem Blutäquivalent von etwa 25–50 μL gesammelt. Die Probenauswahl basierte auf der Verfügbarkeit der vorhandenen archivierten Probe.

Eine therapeutische Wirksamkeitsstudie wurde in der Provinz Papua von 2020 bis 2021 vom Eijkman Institute for Molecular Biology, National Research and Innovation Agency, Cibinong, Indonesien, durchgeführt und dient als Teil der DBS-Analyse für die aktuelle Studie. Die TES-Verfahren folgten den Kriterien der Weltgesundheitsorganisation (WHO). Kurz gesagt wurden an den Tagen vor der Einschreibung und dann an den Tagen 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35 und 42 Abstriche und Blots auf Filterpapier (Whatman International Ltd., Maidstone, UK) aus Fingerstichen gesammelt Mit Blut befleckte Filterpapiere wurden vollständig trocknen gelassen, in einzelne Plastiktüten überführt, beschriftet und bis zur weiteren Verarbeitung bei Raumtemperatur in einem Kieselgel-Exsikkator gelagert. 2749 Probanden wurden mittels passiver und aktiver Fallerkennung untersucht und 42 % (1156/2749) waren positiv auf Malaria. Einhundertzweiundvierzig Proben, die die Einschlusskriterien erfüllten, wurden aus 768, einem Pool von mit P. falciparum-Malaria infizierten Personen, entnommen. Die Befragten waren zwischen 1 und 65 Jahre alt, wogen mehr als 5 kg und hatten in den letzten 24 Stunden Fieber oder hatten Fieber in der Vorgeschichte, mit durch Objektträger bestätigter Malaria mit einer Parasitämie von ≥ 500/µL asexueller Parasiten für P. falciparum. In der Zwischenzeit wurden sie anhand der folgenden Ausschlusskriterien ausgeschlossen: schwanger, in der Vergangenheit eine Allergie gegen die Studienmedikamente oder das untersuchte Arzneimittelderivat aufgetreten, hatte in den letzten zwei Wochen zuvor eine Behandlung mit einem Anti-Malaria-Medikament abgeschlossen oder hatte in der Krankengeschichte keine Behandlung erhalten Bluthochdruck oder chronische Herz-, Nieren- oder Lebererkrankung [5]. Alle Studienteilnehmer erhielten von einem primären Gesundheitszentrum eine überwachte Behandlung mit DHA-PPQ mit 40 mg DHA und 320 mg PPQ pro Tablette und erhielten drei Tage lang einmal täglich eine Dosis von 2,25 und 18 mg/kg von DHA-PPQ [26]. Behandlungsergebnisse und eine Neuinfektion wurden nach den WHO-Kriterien klassifiziert [16, 17, 22].

In dieser Studie wurden 51 archivierte Proben, bestehend aus 41 erfolgreichen Behandlungen und 10 fehlgeschlagenen Behandlungen, aus 142 Probanden ausgewählt, um das genotypische Profil molekularer Marker im Zusammenhang mit der DHA-PPQ-Resistenzbehandlung zu analysieren. Im Rahmen der Papua-TES-Studie wurden 142 Probanden an den Tagen 0, 1, 2, 3, 7, 14,21, 28, 35, 42 auf die klinische und parasitologische Wirksamkeit von DHA-PPQ untersucht [22].

DNA aus allen Proben (einschließlich Probensatz 2, am Tag der Aufnahme und am Tag des Wiederauftretens) wurde mit einem Chelex-100-Ionenaustauscher (Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA) aus den DBS-Proben extrahiert [22]. Die erhaltene genomische DNA wurde gemäß den Qiagen-Verfahren gereinigt.

Polymorphismen im Pfk13-Gen wurden mithilfe einer verschachtelten PCR-Amplifikation untersucht, die die Propellerregion des Gens abdeckte [23], gefolgt von einer Sequenzierung mit einem ABI-Sequenziergerät (Macrogen Inc, Südkorea). Die Sequenzierungsergebnisse wurden dann mit dem Pfk13-Gen des Referenzstamms 3D7 (PF13 0238) (NCBI-Referenzsequenznummer XM 001350122.1) abgeglichen. Die Analyse wurde mit der Software BioEdit (Abbott, CA, USA) durchgeführt.

PCR: pfcrt wurde aus der DNA-Vorlage amplifiziert, um pfcrt-Mutationen im Zusammenhang mit PPQ-Resistenz zu bewerten, die in einer früheren Studie identifiziert wurden [24, 25]. Dies waren die Codons 343, 350, 353 und 356. Auf einem 2 %igen Agarosegel wurden PCR-Produkte sichtbar gemacht.

Pfmdr1 wurde mithilfe einer verschachtelten PCR aus der DNA-Vorlage amplifiziert, um pfmdr1-Mutationen zu bewerten, einschließlich der folgenden SNPs: 1034, 1042 und 1246. Das PCR-Amplifikat wurde auf einem 3 %igen Agarosegel unter ultravioletter Beleuchtung analysiert. Alle PCR-Produkte wurden zur DNA-Sequenzierung zur Qualitätskontrolle an 1st Base Inc. in Singapur geschickt [26, 27]. Einzelheiten zu den Amplifikationsprimersequenzen und PCR-Produktergebnissen finden Sie in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1, Abb. S1.

Relative quantitative Echtzeit-PCR (TaqMan-Echtzeit-PCR) auf einem Applied Biosystems 7500 quantifizierte pfpm 2/3 und pfmdr1-Kopienzahlen (Roche Molecular Systems, Inc., USA). Zuvor veröffentlichte Primer und Sonden [28, 29], ein BioRad CFX 96-Thermocycler wurde verwendet, um 20 μl in dreifacher Ausfertigung zu amplifizieren. Die geschätzten Kopienzahlen betrugen 2−∆∆CT, wobei CT die Differenz zwischen dem Schwellenwertzyklus (CT) der unbekannten Probe und dem CT der Referenzprobe ist. Läufe sind für Ct-Werte > 33 für pfpm2/3 oder pftub oder eine Probe mit einer geschätzten Kopienzahl von < 0,5 nicht interpretierbar; Die Reaktionen wiederholten sich. Wie in früheren Studien wurde in der Hauptanalyse eine Schätzung der Cut-off-Kopienzahl von 1,5 verwendet, um die Einzelkopie von der Mehrfachkopie des pfpm2/3- und pfmdr1-Genträgers zu unterscheiden (28, 29).

Die Plasmodium-Speziation und der Genotyp von P. falciparum wurden mittels PCR bestimmt. Genotypische Analysen der Parasiten am Tag 0 und am Tag des Wiederauftretens wurden unter Verwendung der drei von der WHO empfohlenen Marker durchgeführt: Merozoiten-Oberflächenprotein 1 (MSP1), MSP2 und Glutamat-reiches Protein (GLURP)-Gene (26, 27). Fälle wurden als erneute Infektionen kategorisiert, da sich die Genotypen der Parasiten, die am Tag des Wiederauftretens gefunden wurden, von denen unterschieden, die am Tag 0 (Vorbehandlung) gefunden wurden. Die identischen Genotypen für die drei Marker könnten rezidivierend sein [25, 28].

Die Analyse wurde mit den Basisfunktionen von Microsoft Office Excel und der Open-Source-Software RStudio Version 2022.07.2+576, basierend auf R Version 4.2.2, durchgeführt [30, 31]. Signifikante Unterschiede in den SNP-Prävalenzanteilen jedes Jahr während des Untersuchungszeitraums wurden mithilfe des exakten Fischer-Tests für kategoriale Variablen oder des Mann-Whitney-U-Tests für nichtparametrische Vergleiche analysiert. In dieser Studie wurde die von der WHO bereitgestellte Excel-Kaplan-Meier-Analysevorlage verwendet. Die Ergebnisse werden als kumulative Erfolgs- und Misserfolgshäufigkeit mit einem 95 %-KI ausgedrückt.

Demografische Merkmale für TES-Proben, wie in Tabelle 1 dargestellt. Trockene Blutflecken aus einer Massenblutuntersuchung von Patienten mit unkomplizierter Falciparum-Malaria (N = 50) in Sumba von 2010 bis 2018 und einundfünfzig von TES von 2020 bis 2021 in Papua zur Analyse Genotypisches Profil molekularer Marker im Zusammenhang mit der DHA-PPQ-Resistenzbehandlung. Im Rahmen der Papua-TES-Studie wurden einhundertzweiundvierzig Probanden während einer 42-tägigen Nachuntersuchung auf die klinische und parasitologische Wirksamkeit von DHA-PPQ untersucht (Tabelle 2). In Papua wurde kein frühes Behandlungsversagen (ETF) beobachtet. Allerdings kam es bei zehn von 117 Patienten (8,5 %) an den Tagen 28, 35 und 42 zu einer wiederkehrenden Infektion, die als spätes Behandlungsversagen (LTF) bezeichnet wurde (Tabelle 3).

Von den 101 analysierten DNA-Proben ergaben 94 vollständige Amplifikate. Keines der 20 SNPs, von denen zuvor berichtet wurde, dass sie mit ART-Resistenz assoziiert sind, wurde gefunden. Wie in Abb. 3 gezeigt, wurde die Gesamtprävalenz des nicht-synonymen neuen mutierten Allels in BTB/POZ und der Propellerdomäne in Sumba mit einem Prozentsatz von 4/94 (4,25 %, 95 % KI 0,94–1; siehe Zusätzlich) gefunden Datei 1: Abb. S2, Tabelle S2; Tabelle 4) an den Positionen L396F, I526V, N537S und M579I.

Karte von Indonesien mit Angabe des molekularen Resistenzmarkers und der Probenahmeorte der P. falciparum-Feldisolate während der Beobachtungsstudie. Kartenquelle von Natural Earth (https://www.naturalearthdata.com) und entsprechend den Daten aus den Referenzen geändert

Die Kopienzahl von Pfplasmepsin 2/3 wurde in 98 Proben erfolgreich gemessen. Seit 2010 empfiehlt das Nationale Malaria-Kontrollprogramm des Gesundheitsministeriums der Republik Indonesien DHA-PPQ als Mittel der ersten Wahl bei unkomplizierter Malaria. Nach dem Einsatz von DHA-PPQ nahm die Prävalenz von Parasiten mit pfpm2/3 im Zeitraum 2016–2018 in Sumba langsam zu (Tabelle 4). Die Amplifikation der pfpm2/3-Gene in Sumba und Papua wurde bei 8/47 (17,02 %) bzw. 7/51 (13,7 %) gefunden (Tabelle 4). Zehn wiederkehrende Isolate aus Papua zeigten keine pfpm2/3-Amplifikation (Tabelle 5).

Achtzig Proben wurden erfolgreich auf pfmdr1-Kopienzahlen gemessen, von denen 3/80 (3,8 %) Mehrfachkopien waren. In Sumba und Papua verschwanden Parasiten mit pfmdr1-Amplifikation tendenziell, nachdem AS-AQ im Jahr 2010 durch DHA-PPQ ersetzt wurde (Tabelle 4). In dieser Studie wurde keine gleichzeitige Amplifikation von pfpm2/3 und pfmdr1 beobachtet (Tabelle 5).

Aufgrund des Mangels an Parasiten-DNA konnten nur 31 der 101 Proben erfolgreich per PCR für das pfcrt-Gen amplifiziert werden. Es wurde keine der pfcrt-Mutationen im Zusammenhang mit einer Piperaquin-Resistenz beobachtet. Obwohl die Anzahl der Proben gering war, wiesen etwa 71 % (22/31) aller Isolate aus beiden Untersuchungsgebieten pfcrt I356L auf, wie in Tabelle 4 und Zusatzdatei 1: Tabelle S2 gezeigt.

PCR-Amplikons von pfmdr1 wurden aus 90 erhaltenen Proben (Codons 1034, 1042 und 1246) amplifiziert. Tabelle 4 und Zusatzdatei 1: Tabelle S2 zeigen, dass etwa 79,6 % (74/93) der Isolate den Wildtyp-SND-Haplotyp aufwiesen. In Sumba wurde der mutierte Haplotyp SDD in einem Drittel der Isolate gefunden (15/48; 31,3 %); in Papua wurde der Haplotyp in 8,9 % (4/45) gefunden. In Papua sank die Prävalenz innerhalb von zwei Beobachtungsjahren von 10,3 % (3 von 29) auf 6,3 % (1 von 16) (Tabelle 4). Da beide Allele (1034 und 1246) an mehreren Orten in Indonesien in der gesamten Region beobachtet wurden (32, 33), wurden ähnliche Beobachtungen in pfmdr1 (1034C und 1246Y) in keinem der untersuchten Isolate gefunden.

Analyse von einhundertzweiundvierzig mit P. falciparum infizierten Probanden (Tabelle 1) 117 Fälle schlossen die 42-tägige Nachbeobachtung ab und 25 Fälle gingen entweder für die Nachuntersuchung verloren (LFU) oder wurden zurückgezogen (WTH). Die Klassifizierung der Behandlungsergebnisse nach PCR-Korrektur ist in Tabelle 3 dargestellt. Am Tag 42 wurde bei 91,5 % eine ACPR festgestellt (95 %-KI 84,8–95,8). Von den 10 LTF-Fällen handelte es sich bei neun um Neuinfektionen und einer wurde als wiederkehrend bestätigt (Tabelle 3). Daher betrug die PCR-korrigierte DHA-PPQ-Wirksamkeit für Falciparum 99,1 % (95 %-KI 94,9–100,0). Bei keinem der Isolate wurde eine Verzögerung der Parasitenbeseitigung am Tag 3 beobachtet.

Die PCT lag zwischen 1,5 und 35,7 Tagen, mit einem Median von 1 Tag (Interquartilbereich [IQR], 1 bis 2 Tage) und 38,5 Tagen (IQR, 28 bis 42 Tage) in der ACPR- bzw. Rezidivgruppe. Die auf Häufigkeiten basierende Dynamik der Parasitendichte zeigt einen abnehmenden Trend während der Beobachtungen (Zusatzdatei 1: Abb. S3), obwohl nur eine Probe am letzten Beobachtungstag eine hohe Parasitämie aufwies. Die unterstellten korrigierten geometrischen mittleren Parasitendichten (/μl) für erkannte Infektionen betrugen 707.326 Parasiten/ml (95 %-KI 469.080–1.066.577 Parasiten/ml) mit einer Standardabweichung s = 2.891.848 (IQR: 299.600–1.525.600) in D0; 29.078 Parasiten/ml (95 %-KI 15.665–53.975 Parasiten/ml) mit Standardabweichung s = 55.888 (IQR: 8.800–106.800) in D1; 3326 Parasiten/ml (95 %-KI 3095–3.573.239 Parasiten/ml) mit Standardabweichung s = 2715 (IQR, 1920–5760) in D2; 47.614 Parasiten/ml (95 % KI 0,12–18 × 1010 Parasiten/ml) mit Standardabweichung s = 80.554 (IQR, 17.280–131.200) in D42 (Zusatzdatei 1: Abb. S4).

In Indonesien wurde AS-AQ im Jahr 2004 eingeführt und es wurde über eine schlechte Verträglichkeit berichtet. Steigende Behandlungsversagensraten von AS-AQ führten 2008 zu einer Änderung der Arzneimittelpolitik hin zu DHA-PPQ. In Südostasien ist eine DHA-PPQ-Resistenz aufgetreten, die eine erhebliche Bedrohung für die Bemühungen zur Malariakontrolle und -eliminierung darstellt [34,35,36]. DHA-PPQ wird gut vertragen, wobei ein ART-Derivat Parasiten schneller beseitigt und der Wirkstoff PPQ die verbleibenden Parasiten langsamer entfernt [37]. In mehreren Teilen Indonesiens durchgeführte TES [17, 19] ergaben, dass DHA-PPQ immer noch hochwirksam ist, was durch das Fehlen einer verzögerten Parasitenbeseitigung und die geringen Fälle von Parasitenrezidiven nach 42-tägigen Beobachtungen belegt wird.

Die Analyse des pfk13-Gens von P. falciparum-Isolaten, die zwischen 2010 und 2021 gesammelt wurden, ergab das Fehlen von Mutationen, die mit ART-Resistenz verbunden sind. Es wurden jedoch mehrere Polymorphismen wie L396F, I526V, N537S und M579I gefunden. Obwohl sie nicht mit einer ART-Resistenz assoziiert sind, sind diese SNPs neu gefunden und wurden noch nie in einem Endemiegebiet beschrieben [16, 18,19,20, 23, 24, 34,35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49,50]. Es ist dennoch wichtig, die Rollen der vier SNPs näher zu beschreiben. Bei keinem der Isolate wurde ein durchschnittliches PCT-Ergebnis von 1,5 Tagen und keine Verzögerung der Parasitenbeseitigung am Tag 3 beobachtet. Die TES-Ergebnisse aus Papua erfüllen nicht die WHO-Kriterien für einen Verdacht auf ART-Resistenz [51].

Resistenz gegen PPQ wurde mit der zunehmenden Kopienzahl des pfpm2-Gens [28, 52, 53] und in jüngerer Zeit mit mutierten Allelen von pfcrt [54, 55, 56, 57, 58] in Verbindung gebracht. Dieses Forschungsergebnis zu 10 wiederkehrenden Infektionsfällen ergab keinen Zusammenhang zwischen der PPQ-Resistenz und der pfpm2/3-Kopienzahl (Tabelle 5). Bei früheren TES-Analysen in der südlichen Region Papuas wurden auch keine P. falciparum-Isolate identifiziert, die mehrere Kopien des pfpm2/3-Gens tragen [18]. Andere Studien schlugen pfcrt-Mutationen im Zusammenhang mit PPQ-Resistenz vor, nämlich 343, 350 oder 353 [24, 25]. Diese Mutationen wurden in dieser Studie nicht beobachtet. Nach dem Einsatz von DHA-PPQ stieg die Prävalenz von Parasiten mit mehreren Kopien von pfpm2/3 von 2016 bis 2018 langsam an und schien in nicht wiederkehrenden Isolaten relativ häufig vorzukommen. All dies geschah wahrscheinlich aufgrund der selektiven Exposition von DHA-PPQ im Laufe der mehr als zehnjährigen Einführung in Indonesien. Die begrenzte Anzahl der in dieser Studie verwendeten Proben könnte ebenfalls ein entscheidender Faktor sein, sodass zur Bestätigung weitere Untersuchungen erforderlich sind. Obwohl es keine Hinweise auf eine erhöhte Kopienzahl von pfpm2/3 in Rezidivfällen gab, gelang es der PPQ-Behandlung dennoch nicht, den Parasiten aus dem Blut zu eliminieren und eine erneute Infektion während der Nachbeobachtungszeit zu verhindern.

Die Überwachung in Gebieten, in denen DHA-PPQ als Erstbehandlung gegen Malaria eingesetzt wird, zeigte, dass die pfpm2/3-Verstärkung nicht der einzige Faktor war, der zur PPQ-Resistenz führte. Der genetische Hintergrund zirkulierender Feldisolate schien eine Rolle bei der Arzneimittelanfälligkeit zu spielen [36, 37]. Es wird auch von Fidock et al. unterstützt. [42] und Iwanaga et al. [59], was insbesondere zeigt, dass die erfolgreiche Produktion eines arzneimittelresistenten Stamms direkt in einem arzneimittelempfindlichen Stamm durch In-vitro-Studien oder ein genomweites funktionelles Screening der Arzneimittelresistenz erzeugt wird. Diese Transformationen wurden durch die geografische Herkunft (Südostasien, Afrika und Südamerika) und den genetischen Hintergrund (Haplotyp-Allel oder Genotyp aller anderen verwandten Gene) beeinflusst, was die Ergebnisse der Bevölkerungsumfrage stützt, dass der mutierte pfcrt möglicherweise ausreichte, um Resistenz zu verleihen [60]. . Es wurde auch vermutet, dass die anfängliche Selektion von pfpm2/3- und pfmdr1-CNVs zwar keinen PPQ-resistenten Phänotyp hervorbrachte, aber einen genetischen Hintergrund für neuartige pfcrt-Mutationen entwickelte [61].

Pfcrt ist ein 13-Exon-Gen mit mehreren Punktmutationen 74, 75, 76, 220, 271, 326, 356, 371, die mit CQR in Verbindung stehen [42] und 93, 97, 145, 218, 343, 350, 353, die ausschließlich mit CQR assoziiert sind PPQ-Resistenz [36, 60, 62] befindet sich auf Chromosom 7 und erstreckt sich über ein 36-kb-Segment. Die überlappende Region korrelierte mit dem pfcrt-Gen und seinen regulatorischen Elementen wie dem Promotor und der 3'-untranslatierten Region (3'-UTR), die für die Regulierung und Aktivierung der kodierenden Region verantwortlich sind (59). Die Mutationen in pfcrt könnten den Transport der natürlichen Substrate aus der Verdauungsvakuole beeinträchtigen, was zu einem erhöhten osmotischen Druck führen würde. Dieser Phänotyp wurde auch bei Dd2-Parasiten beobachtet, die die pfcrt-Mutationen F145I, M343L und G353V exprimierten [60]. Abhängig vom Ort der mutierten Aminosäuren weisen nicht alle neuen pfcrt-Mutationen einen geschwollenen DV-Phänotyp auf [63].

Interessanterweise erhöhte die pfcrt-I356T/L-Mutation auch die ART-IC50-Werte und die ART-Resistenz [38, 39], was die jüngste Korrelation der I356T-Mutation in Südostasien mit ART-resistenten Parasitenpopulationen in der pfk13-Mutation unterstreicht.[40, 41]. Mehrere pfcrt-Haplotyplinien aus vielen geografischen Regionen dienen als genetischer Hintergrund, wobei 356 Allele eines davon mit der Entwicklung einer ART-Resistenz bei P. falciparum-Parasiten in Verbindung gebracht wurden (38, 39, 40, 42). Das Vorliegen mäßiger Häufigkeiten von pfcrt I356L 22/31 (71 %) am Studienstandort war möglicherweise mit dem langfristigen medikamentösen Druck durch die verwendete DHA-PPQ-Behandlung und der Verfügbarkeit von Zugang zu CQ im privaten Gesundheitssektor (nicht) verbunden -Malaria-Zwecke), die die Entwicklung von ART-Resistenz-pfcrt-Allelen erleichtern könnten [16, 39].

Pfmdr1 wurde auch als Modulator für die PPQ-Resistenz vorgeschlagen. [28, 34] Resistenz gegen PPQ war auch mit der Amplifikation von pfmdr1 verbunden. Eine weitere In-vitro-Studie berichtete über eine Korrelation zwischen einer einzelnen Kopienzahl von pfmdr1 und der Resistenz von P. falciparum-Isolaten gegen PPQ [35, 36, 43]. Plasmodium falciparum-Parasiten könnten einen Fitness-Nachteil oder eine verringerte Übertragbarkeit erleiden, wenn das pfmdr1-Gen häufiger amplifiziert wird [47]. Im Gegensatz dazu war die Mehrfachkopienzahl von pfmdr1 mit einer MQ-Resistenz verbunden (29, 37, 44, 64). Diese Studie ergab, dass P. falciparum-Isolate in Indonesien überwiegend eine Einzelkopie von pfmdr1 zu 95 % aufwiesen, was auf eine verringerte PPQ-Wirksamkeit schließen lässt. Frühere Studien beobachteten eine verringerte Prävalenz von Multicopy-pfmdr1 seit der Einführung von DHA-PPQ [28, 37, 45]. Die Rolle von pfmdr1 blieb jedoch umstritten [43, 46].

Neben der Verringerung der CNVs von pfmdr1 stieg auch der Polymorphismus im pfmdr1-Gen wie N1042D vor der Einführung der PPQ-Behandlung um 76,9 % an. In einem anderen östlichen Teil Indonesiens wurde beobachtet, dass die SNP-Mutation S1034C im Jahr 2010 100 % erreichte [49]. Nach der Einführung von PPQ sanken die Werte von pfmdr1 S1034C, N1042D und D1246Y deutlich um 20,4 %. Es gab eine bemerkenswerte Änderung der Haplotyphäufigkeiten zwischen dem SND-Haplotyp und dem mutierten SDD-Haplotyp (Tabelle 4).

Diese Studie ergab, dass DHA-PPQ immer noch hochwirksam gegen P. falciparum ist. Die genetische Architektur der Isolate des Parasiten P. falciparum im Zeitraum 2010–2021 ergab, dass die Einzelkopienzahl pfmdr1 und pfpm2/3 weit verbreitet war. Der leichte Anstieg des DHA-PPQ-LTF macht Forscher auf die Notwendigkeit aufmerksam, alternative ACTs auf Basisinformationen zu testen, für den Fall, dass DHA-PPQ ersetzt werden muss.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und den zugehörigen Zusatzdateien enthalten.

Plasmodium falciparum

Artemisinin-Kombinationstherapie

Dihydroartemisinin–Piperaquin

Piperaquin

Chloroquin

Sulfadoxin-Pyrimethamin

Artemisinin

Lumefantrin

Artesunat–Amodiaquin

Plasmodium falciparum Kelch 13

Plasmodium falciparum Chloroquin-Resistenztransporter

Plasmodium falciparum Multiresistenz 1

Plasmodium falciparum Plasmepsin 2/3

Studie zur therapeutischen Wirksamkeit

Spätes Versagen der Behandlung

Frühzeitiges Versagen der Behandlung

Spätes klinisches Versagen

Spätes parasitologisches Versagen

Keine Nachverfolgung mehr möglich

Rückzug

Einzelnukleotidpolymorphismus

Trockene Blutflecken

Massenblutuntersuchung

Zeit zur Parasitenbeseitigung

Angemessene klinische und parasitologische Reaktionen

Jährliche Parasiteninzidenz

Schwellenzyklus

Merozoiten-Oberflächenprotein 1

Merozoiten-Oberflächenprotein 2

Glutamatreiches Protein

Interquartilbereich

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Referenzen herunterladen

Die Autoren sind dem Eijkman Research Center for Molecular Biology, National Research and Innovation Agency (BRIN), Cibinong, Indonesien, zutiefst dankbar für alle bereitgestellten Einrichtungen und dem Koordinator und Direktor des Global Malaria Program WHO, Dr. Pascal Ringwald, für seine kontinuierliche Unterstützung Therapeutische Wirksamkeitsstudien (TES) in Indonesien. Besonderer Dank geht an die Universitas Muhammadiyah Yogyakarta, Indonesien, für die Unterstützung des FVR im Graduiertenstudienprogramm der Mahidol-Universität.

HHB und MDGB sind Mitarbeiter der Weltgesundheitsorganisation und für die in dieser Veröffentlichung geäußerten Ansichten verantwortlich, die nicht unbedingt die Entscheidungen oder Richtlinien der Weltgesundheitsorganisation widerspiegeln.

In dieser Studie wurden die Probenentnahme und molekulare Tests vom Eijkman Research Center for Molecular Biology, National Research and Innovation Agency (BRIN), Cibinong, Indonesien, unterstützt. Die in dieser Studie gesammelten TES-Proben wurden von der WHO unterstützt. Mehrere Tests wurden von der Universitas Muhammadiyah Yogyakarta, Indonesien, finanziert. Diese Studie wurde von der Mahidol University, dem Strategic Research Fund der MU: Geschäftsjahr 2023, unterstützt und ist Teil des Mahidol-University Oxford Tropical Medicine Research Program, das vom Wellcome Trust des Vereinigten Königreichs (Hauptstipendium 106698/B/14/Z) und Wellcome finanziert wird OA-Erklärung. Diese Forschung wurde ganz oder teilweise vom Wellcome Trust [220211] finanziert. Für die Zwecke des Open Access hat der Autor eine öffentliche CC BY-Urheberrechtslizenz auf alle vom Autor akzeptierten Manuskriptversionen angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergeben.

Graduiertenprogramm in Molekularer Medizin, Fakultät für Naturwissenschaften, Mahidol University, Bangkok, 10400, Thailand

Farindira Vesti Rahmasari

Abteilung für Molekulare Tropenmedizin und Genetik, Fakultät für Tropenmedizin, Mahidol-Universität, 420/6 Ratchawithi Road, Ratchathewi, Bangkok, 10400, Thailand

Farindira Vesti Rahmasari & Mallika Imwong

Abteilung für Parasitologie, Medizinische Fakultät, Fakultät für Medizin und Gesundheitswissenschaften, Muhammadiyah-Universität Yogyakarta, Bantul, Indonesien

Farindira Vesti Rahmasari

Eijkman-Forschungszentrum für Molekularbiologie, Nationale Forschungs- und Innovationsagentur (BRIN), Cibinong, Indonesien

Puji Budi Setia Asih, Ismail Ekoprayitno Rozi, Suradi Wangsamuda, Rifqi Risandi, Farahana Kresno Dewayanti, Dendi Hadi Permana, Lepa Syahrani und Din Syafruddin

Malaria-Arbeitsgruppe, Gesundheitsministerium, Jakarta, Indonesien

Helen Dewi Prameswari

Weltgesundheitsorganisation, Landesbüro für Indonesien, Jakarta, Indonesien

Herdiana H. Basri

Weltgesundheitsorganisation, Landesbüro für Thailand, Nonthaburi, Thailand

Maria Dorina G. Bustos

Abteilung für klinische Tropenmedizin, Fakultät für Tropenmedizin, Mahidol-Universität, Ratchathewi, Bangkok, 10400, Thailand

Prakaykaew Charunwatthana

Mahidol-Oxford Tropical Medicine Research Unit, Fakultät für Tropenmedizin, Mahidol University, Bangkok, Thailand

Arjen M. Dondorp & Mallika Imwong

Zentrum für Tropenmedizin und globale Gesundheit, Nuffield Department of Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Arjen M. Dondorp

Abteilung für Parasitologie, Medizinische Fakultät, Universität Hasanuddin, Makassar, Indonesien

Din Syafruddin

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DS, PBSA, PC und MI konzipierten die Studie zur genetischen Analyse. DS, HHB und MDGB haben die Therapeutic Efficacy Studies (TES) in Indonesien konzipiert. FVR, PBSA, AD, MI und DS haben den ursprünglichen Entwurf entworfen. FVR, PBSA, MI, IER, SW, RR, FKD, DHP, LP und HDP sind für die formale Analyse und Untersuchung verantwortlich und trugen zur Datenkuratierung und Entwurfsmethodik bei. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Mallika Imwong.

Ethische Prüfungen und Genehmigungen wurden von der Ethikkommission der medizinischen Fakultät der Universität Hasanuddin, Indonesien, der Ethikkommission für Gesundheitsforschung der Fakultät für Medizin und Gesundheitswissenschaften der Universitas Muhammadiyah Yogyakarta, Indonesien und dem Central Institutional Review Board der Mahidol University erteilt Fakultät für Tropenmedizin, Mahidol-Universität (Zulassungsnr. MUTM 2012-045-05), Thailand. Therapeutic Efficacy Studies (TES) in Indonesien wurde mit der klinischen Studiennummer ACTRN12622000248763 registriert.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Primersequenzen in dieser Studie. Abbildung S1. PCR-Produktergebnis für (A) K131-Propellerdomäne (B) pfcrt-Exon 102 (C) pfmdr13 im Elektrophorese-Gel 2 %. Abbildung S2. Chromatogramme der Sequenzanalyse zur Mutationsposition der Kelch13 BTB/POZ- und Propellerdomäne in Sumba. Der Pfeil zeigt die Mutationsposition. Tabelle S2. Zusammenfassung des Konfidenzintervalls (KI) 95 % mit unterem und oberem KI für jeden molekularen Marker, der mit Arzneimittelresistenz assoziiert ist. Abbildung S3. Liniendiagramm, das die Parasitendichte basierend auf der Häufigkeit pro Tag der Beobachtungen in Papua zeigt. Abbildung S4. Geometrisches Mittel der Parasitendichte im Beobachtungszeitraum 2020 bis 2021 in Papua.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

Rahmasari, FV, Asih, PBS, Rozi, IE et al. Entwicklung genetischer Marker für Arzneimittelresistenz nach der Einführung von Dihydroartemisinin-Piperaquin als Erstbehandlung gegen Malaria bei unkomplizierter Falciparum-Malaria in Indonesien. Malar J 22, 231 (2023). https://doi.org/10.1186/s12936-023-04658-4

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Eingegangen: 31. März 2023

Angenommen: 25. Juli 2023

Veröffentlicht: 09. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-023-04658-4

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