Pulcherriminsäure moduliert die Eisenverfügbarkeit und schützt vor oxidativem Stress bei mikrobiellen Interaktionen

Sep 25, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2536 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Siderophore sind lösliche oder in Membranen eingebettete Moleküle, die die oxidierte Form von Eisen, Fe(III), binden und bei der Eisenaufnahme durch Mikroorganismen eine Rolle spielen. Fe(III)-gebundene Siderophore binden an spezifische Rezeptoren, die es Mikroben ermöglichen, Eisen aufzunehmen. Bestimmte Bodenmikroben setzen jedoch eine Verbindung (Pulcherriminsäure, PA) frei, die bei der Bindung an Fe(III) einen Niederschlag (Pulcherrimin) bildet, der offenbar die Eisenverfügbarkeit verringert, anstatt zur Eisenaufnahme beizutragen. Hier verwenden wir Bacillus subtilis (PA-Produzent) und Pseudomonas protegens als Konkurrenzmodell, um zu zeigen, dass PA an einem besonderen Eisenmanagementsystem beteiligt ist. Die Anwesenheit des Konkurrenten induziert die PA-Produktion, was zur Ausfällung von Fe(III) als Pulcherrimin führt, was oxidativen Stress in B. subtilis verhindert, indem es die Fenton-Reaktion und die schädliche ROS-Bildung einschränkt. Darüber hinaus nutzt B. subtilis seinen bekannten Siderophor Bacillibactin, um Fe(III) aus Pulcherrimin zu gewinnen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass PA mehrere Rollen spielt, indem es die Eisenverfügbarkeit moduliert und Schutz vor oxidativem Stress während der Konkurrenz zwischen den Arten bietet.

Eisen (Fe) ist ein essentielles Metall, das in hohen zellulären Konzentrationen für das Überleben und Wachstum der meisten Lebewesen auf der Erde benötigt wird. Obwohl es im Boden reichlich vorhanden ist, sind seine Löslichkeit und damit seine Bioverfügbarkeit bei einem neutralen pH-Wert (ca. 10–10 M)1 sehr gering. Um dieses Rätsel aus hoher Nachfrage und geringem Angebot zu lösen, produzieren Bodenbakterien Siderophore – Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht und hoher Affinität zu Fe(III)2. Spezifische Transportsysteme ermöglichen die Aufnahme von Fe durch Zellen und die Nutzung in verschiedenen Zellwegen und Proteinen3,4,5. Bodenmikroorganismen konkurrieren oft um Fe und haben Mechanismen entwickelt, um die Fe-Aufnahme zu maximieren, einschließlich der Produktion mehrerer Siderophore mit einer Reihe von Affinitäten für Fe und der Expression verschiedener Rezeptoren auf der Zelloberfläche, die Siderophore binden können, manchmal auch Xenosiderophore6,7,8 ,9. Im Wettbewerb zwischen den Arten kann die Sekretion von Siderophoren durch eine schnelle Fe-Monopolisierung einen Wachstumsvorteil verschaffen10. Die Fe-Sequestrierung durch Siderophore kann jedoch ein zweischneidiges Schwert sein, da Konkurrenten sie ebenfalls betrügen und so Fe erwerben können, ohne die Stoffwechselkosten der Siderophor-Biosynthese zu teilen9,11.

Auf dem gleichen Syntheseweg produziert B. subtilis zwei Siderophore: die relativ schwache Bindungsaffinität 2,3-Dihydroxybenzoesäure (DHB; eine Catecholfunktion) und das stark bindungsaffine Bacillibactin (BB; drei Catecholfunktionen)12. Pulcherriminsäure (PA), ein weiteres Fe-chelatbildendes Molekül, das von Hefen und vielen Bakterien einschließlich B. subtilis13,14,15 produziert wird, enthält zwei Hydroxamatgruppen und bildet bei der Bindung von Fe(III)15,16,17 den roten unlöslichen Pulcherrimin-Komplex. Kürzlich wurde gezeigt, dass die extrazelluläre Akkumulation von Pulcherrimin (PA-Fe) die Biofilmexpansion einschränkt, und es wurde vermutet, dass PA als interzelluläres Signal fungiert, das den Übergang von der exponentiellen zur stationären Phase in B. subtilis auslöst14,18. Pulcherrimin wurde erstmals in einer kleinen Gruppe von Hefen beschrieben, darunter Candida spp. und Kluyveromyces spp.15,19. In diesen Organismen zeigte sich, dass die PA-Produktion eine antagonistische Aktivität aufweist, wahrscheinlich durch Fe-Abbau20. Bei Kluyveromyces lactis wurde vermutet, dass PA als Siderophor fungieren könnte, eine widersprüchliche Vorstellung, da der Pulcherrimin-Komplex unlöslich und offenbar keine bioverfügbare Quelle für Fe19,21 ist. Tatsächlich deuten fast alle früheren Studien an Hefe und Bacillus darauf hin, dass PA Fe(III) irreversibel bindet und daher bei der Fe-Aufnahme keine Rolle spielt.

Ein weiterer wichtiger Aspekt der Fe-Homöostase in B. subtilis ist die Bildung eines Biofilms. Wir haben zuvor gezeigt, dass sowohl die Biofilmmatrix als auch die Siderophorproduktion für den Organismus notwendig sind, um Fe aus ausgefällten Oxiden zu gewinnen22, und dass biofilmgebundenes Fe als lokale Fe-Quelle23 verwendet werden kann. Eine andere Studie zeigte die Bedeutung von Fe(III) in der tiefen Schicht des Biofilms, das in Abwesenheit von Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor fungiert24. Biofilmgebundenes Fe scheint daher neben dem Zellwachstum auch für die Biofilmfunktion essentiell zu sein. Siderophore und Biofilmbildung tragen zur Fe-Aufnahme und Homöostase in biofilmbildenden Bakterien bei22,25. Über den ökologischen Vorteil der Sekretion präzipitierender Liganden wie PA im Kontext der mikrobiellen Konkurrenz und über das Schicksal des Fe nach der Komplexierung mit PA ist jedoch wenig bekannt.

In dieser Arbeit haben wir ein Zwei-Spezies-Bakterienmodell verwendet, um die Rolle von Pulcherrimin (sofern vorhanden) im Eisenkrieg zu untersuchen. Bacillus und Pseudomonas sind zwei Gattungen, die häufig gemeinsam in der Rhizosphäre vorkommen, wo sie mit Pflanzenwurzeln interagieren, aber wahrscheinlich auch um dieselben Ressourcen konkurrieren. Tatsächlich wurden viele antagonistische Wechselwirkungen zwischen B. subtilis und verschiedenen Pseudomonas-Arten nachgewiesen26,27. Über die Nährstoffaufnahme, insbesondere Fe, während der Konkurrenz zwischen den Gattungen Bacillus und Pseudomonas ist jedoch weniger bekannt. Hier zeigen wir anhand eines Zwei-Spezies-Bakterienmodells, Bacillus subtilis (PA-Produzent) und verschiedener Pseudomonas-Arten, dass B. subtilis PA in paarweiser Wechselwirkung mit Pseudomonas protegens Pf-5 produziert und so eine lokale Quelle für ausgefälltes Fe(III) und ist in der Lage, Fe aus dem Pulcherrimin-Komplex aufzunehmen, indem es den starken Fe-Chelator Bacillibactin (BB) produziert. Wir zeigen auch, dass Pulcherrimin den oxidativen Stress in diesem Organismus mildert und so das Überleben und die Biofilmbildung erhöht, während es mit Pf-5 konkurriert. Unsere Beobachtungen liefern ein neues Verständnis der physiologischen Rolle von Pulcherrimin, das weder ein Siderophor noch ein unzugänglicher Fe-Sequester ist, sondern stattdessen eine lokale Fe-Quelle darstellt und gleichzeitig die Bildung schädlicher reaktiver Sauerstoffspezies verhindert.

Um die Abwehrstrategien von B. subtilis bei der Interaktion mit anderen Bodenbakterien zu untersuchen, führten wir zeitabhängige paarweise Interaktionstests zwischen B. subtilis NCIB 3610 und drei Pseudomonas-Arten (P. fluorescens WCS365, P. capeferrum WCS358 und P. protegens) durch Pf-5), das aus der Rhizosphäre isoliert und als Biokontrollmittel in Nutzpflanzen verwendet wird28,29. Diese drei Pseudomonas-Arten wurden aufgrund ihrer Unterschiede in der Produktion von Sekundärmetaboliten ausgewählt30,31,32. Die Wechselwirkungen wurden auf zwei verschiedenen Medien untersucht: MSgg, das häufig zur Untersuchung der Biofilmbildung bei B. subtilis verwendet wird und zuvor bei Bacillus spp. verwendet wurde. – Paarweise Interaktionen mit Pseudomonas27 und Murashige- und Skoog-Medium (MS), das üblicherweise zum Züchten von Pflanzen und zur Untersuchung ihrer Wechselwirkungen mit nützlichen Bakterien verwendet wird. Hier wurde MS mit Glycerin und Glutamat ergänzt, um die Bildung von B. subtilis-Biofilmen zu fördern33. In MSgg liegt Fe als Salz (FeCl3; anorganisch) vor, das unter oxischen Bedingungen Eisenhydroxide und -oxide bildet, die ausfallen. Bei MS wird Fe als organischer Komplex (Fe-EDTA) bereitgestellt, der seine Löslichkeit über die Zeit behält. Dennoch ist Fe für B. subtilis unter beiden Bedingungen nicht leicht bioverfügbar. Im Laufe der Zeit verschlang B. subtilis auf MSgg sowohl P. fluorescens WCS365 als auch P. capeferrum WCS358, aber B. subtilis- und Pf-5-Kolonien stellten keinen physischen Kontakt her, was auf antagonistische Aktivitäten schließen lässt, die durch diffundierbare Moleküle vermittelt werden (Abb. 1a). Side-by-Side-Kolonien auf MS zeigen einen Mangel an Interaktion, mit Ausnahme eines roten Halos, der die B. subtilis-Kolonie in Konkurrenz zu Pf-5 umgab (Abb. 1b). Dieser rote Halo fehlte, wenn B. subtilis allein auf MS war, war aber immer auf MSgg vorhanden, wie bereits beschrieben14 (Abb. 1a). Pulcherriminsäure (PA) ist das einzige bekannte Pigment, das von B. subtilis14 produziert wird. Es ist farblos, bildet aber bei der Fe(III)-Bindung außerhalb der Zelle den roten unlöslichen Pulcherrimin-Komplex34. B. subtilis, bei dem yvmC deletiert war, ein Gen, das das für die PA-Synthese verantwortliche Protein kodiert, wurde auf beiden Medien (MS und MSgg) mit Pf-5 belastet und produzierte unter allen Bedingungen kein rotes Pigment (Abb. 1a, b). Die Komplementierung des yvmC-cypX-Operons am amyE-Locus stellte die Pigmentsynthese wieder her (ergänzende Abbildung 1a), was zeigt, dass der „rote“ Phänotyp auf die PA-Produktion zurückzuführen ist.

a Repräsentative Bilder von Biofilmen von B. subtilis WT und ∆yvmC im Wettbewerb mit Pseudomonas WCS365, WCS358 und Pf-5. In regelmäßigen Abständen wurden Bilder auf MSgg und auf (b) MS-Medium aufgenommen. Der Bildkontrast wurde angepasst, um eine klare Visualisierung zu ermöglichen. c Durchflusszytometrieanalyse, die die Verteilung der Fluoreszenzintensität des YFP-basierten Transkriptionsreporters für yvmC allein (schwarz) gegenüber den Pseudomonas-Arten WCS365 (blaugrün), WCS358 (lila) und Pf-5 (rosa) zeigt. d B. subtilis, das den fluoreszierenden Reporter für die PA-Produktion (PyvmC – yfp) beherbergt, wurde 24 Stunden lang auf MS mit und ohne Pseudomonas-Arten gezüchtet. Der Prozentsatz fluoreszierender Zellen (YFP + ) wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Alle Experimente wurden in drei biologischen Replikaten mit drei technischen Replikaten durchgeführt. Es werden repräsentative Experimente und Bilder vorgestellt. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede hin, P < 0,05, einfaktorielle ANOVA und Tukeys Mehrfachvergleichstest. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD, n = 3 dargestellt. Maßstabsbalken, 5 mm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Auf MSgg zeigte B. subtilis eine starke und gleichmäßige Expression des PyvmC-yfp-Bioreporters im gesamten Biofilm (ergänzende Abbildung 2a, b). Im Gegensatz dazu zeigten bei MS nur B. subtilis-Zellen neben Pf-5 eine PyvmC-yfp-Expression und damit eine PA-Produktion (ergänzende Abbildung 2c). Die durchflusszytometrische Analyse des Anteils der Zellen, die PyvmC-yfp exprimieren, bestätigte eine deutliche Populationsverschiebung, wenn B. subtilis in der Nähe von Pf-5 mit fast ~95 % YFP+ gezüchtet wurde, verglichen mit nur ~30 % bei darin gezüchteten B. subtilis-Kolonien das Vorhandensein von WCS365 oder WCS358 (Abb. 1c, d).

Es ist bekannt, dass Pf-5 für B. subtilis schädliche Sekundärmetaboliten absondert, darunter 2,4-DAPG und Pyoluteorin27,35, die für die Auslösung der PA-Produktion verantwortlich sein könnten. Die Herausforderung von B. subtilis mit der Pf-5-∆phlD-Mutante, die diese beiden Sekundärmetaboliten nicht synthetisieren konnte, verringerte die Anzahl der Zellen, die yvmC (PyvmC-yfp-Reporter) exprimierten, nicht signifikant (ergänzende Abbildung 1c). In Gegenwart von Pf-5 exprimierten die Zellen jedoch PyvmC-yfp im Vergleich zu WT in geringerem Maße, was darauf hindeutet, dass entweder DAPG oder Pyoluteorin an der PA-Produktion beteiligt sein könnten (ergänzende Abbildung 1b). Die Anreicherung von DAPG in der Nähe der B. subtilis-Kolonie löste die PyvmC-yfp-Expression aus (ergänzende Abbildung 2d). Interessanterweise exprimierten etwa 70 % der Zellen in der Population nach dem Entfernen einer Agarscheibe zwischen 3610 und Pf-5, um den Einfluss mitteldiffusionsfähiger Moleküle zu eliminieren, immer noch PyvmC-yfp (ergänzende Abbildung 1c). Da es uns nicht gelingt, alle Moleküle, die für die Auslösung der PA-Produktion verantwortlich sind, direkt zu bestimmen, deuten unsere Beobachtungen darauf hin, dass dies auf einen Effekt sowohl flüchtiger Stoffe als auch mitteldiffusionsfähiger Sekundärmetaboliten von Pf-5 zurückzuführen ist.

Auf beiden Medien zeigten WT und ∆yvmC (PA-Mutante) in Abwesenheit von Pf-5 keine signifikanten Unterschiede in den Biofilm-Phänotypen, der Wachstumskurve und der Biomasse (Abb. 2a, b), außer bei MSgg zu späteren Zeitpunkten, wo ∆ yvmC dehnte sich wie zuvor beobachtet weiter aus (Abb. 1a, b)14. Pf-5 behinderte jedoch die Biofilmbildung im WT auf beiden Medien, und dieser Effekt wurde in der ∆yvmC-Mutante verstärkt, was durch das Fehlen von Falten in Gegenwart von Pf-5 beobachtet wurde (Abb. 1a, b). Darüber hinaus stoppte Pf-5 das Wachstum und Überleben von ∆yvmC vollständig (Abb. 2c, d). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass die Sekretion von PA B. subtilis-Zellen schützt und die Bildung eines Biofilms gegen Pf-5 ermöglicht.

a KBE-Zahlen und Biomasse (OD600) von WT und ∆yvmC allein auf MSgg (ns nicht signifikant, *P = 1,82 × 10−2) und (b) auf MS (ns nicht signifikant). c KBE-Zahlen und Biomasse (OD600) von WT und ∆yvmC mit Pf-5 auf MSgg (ns nicht signifikant, ** = P < 0,01) und (d) auf MS. (ns nicht signifikant, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P = 8,93 × 10−4, Zwei-Wege-ANOVA, Sidaks). Alle Experimente wurden in drei biologischen Replikaten mit drei technischen Replikaten durchgeführt. Es werden repräsentative Experimente vorgestellt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD, n = 3 dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Sekretion eines starken und unlöslichen Fe-Chelators wie Pulcherriminsäure könnte die Fe-Anreicherung im Biofilm beeinträchtigen. Somit wurde der gesamte Fe-Gehalt in den Kolonien (Biofilmen + Zellen) und Zellen (intrazellulärer Fe-Gehalt) von B. subtilis WT und der ∆yvmC-Mutante (PA-Mutante) quantifiziert. Es gab eine leichte Verringerung der Fe-Akkumulation im ∆yvmC-Biofilm (1,58E–7 M) im Vergleich zum WT allein (2,92E–7 M) im MSgg-Medium, wenn PA stark produziert wird (Abb. 3a), während der intrazelluläre Fe-Gehalt hoch ist blieb ähnlich (Ergänzende Abbildung S3a). Auf dem gleichen Medium zeigte B. subtilis WT in Gegenwart von Pf-5 einen etwa dreifachen Anstieg des Fe-Gehalts in den Kolonien (Biofilme + Zellen) im Vergleich zu WT allein (8,45E–7 M), jedoch den intrazellulären Fe-Gehalt unterschied sich nicht signifikant (ergänzende Abbildung S3a). Außerdem akkumulierte die ∆yvmC-Mutante in Gegenwart von Pf-5 deutlich mehr Fe in den Kolonien (3,20E–7 M) im Vergleich zu ∆yvmC (1,58E–7 M), jedoch deutlich weniger als der WT neben Pf-5 ( Abb. 3a). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Pulcherriminproduktion die extrazelluläre Anreicherung von Fe im Biofilm begünstigt. Diese Beobachtung wurde durch eine erhöhte Fe-Anreicherung bei MS im WT-Biofilm in Gegenwart von Pf-5 bestätigt, was die PA-Produktion im MS-Medium stimuliert (Abb. 3b). Nur bei MS war der Unterschied zwischen PA-Produzenten und Nicht-Produzenten sowohl in den Kolonien als auch intrazellulär nicht signifikant (Abb. 3b; ergänzende Abb. S3b).

ein Fe-Gehalt (in Mol; M), normalisiert auf mg feuchter Biofilme, von 48-Stunden-Kolonien, die auf MSgg und (b) auf MS-Medium gebildet wurden. c Bilder von unten von B. subtilis, das den Transkriptionsreporter des β-Galactosidase-Gens für die DhbA-Produktion (PdhbA-lacZ) beherbergt, gewachsen auf MSgg und (d) auf MS-Medium. Der Bildkontrast wurde angepasst, um eine klare Visualisierung zu ermöglichen. e β-Galactosidase-Aktivitäten von WT und ∆yvmC, die den PdhbA-lacZ-Reporter allein und in Wechselwirkung mit Pf-5 in MSgg nach 48 Stunden (f) und in MS nach 24 Stunden beherbergen. Die Experimente wurden in drei biologischen Replikaten mit drei technischen Replikaten durchgeführt. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede hin, P < 0,05, einfaktorielle ANOVA und Tukeys Mehrfachvergleichstest. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD, n = 3 dargestellt. Maßstabsbalken, 5 mm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Aufrechterhaltung der intrazellulären Fe-Homöostase (ergänzende Abbildung S3) trotz der Bildung des unlöslichen PA-Fe-Komplexes lässt auf das Vorhandensein einer starken Siderophorproduktion schließen. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde ein B. subtilis-Stamm verwendet, der PdhbA-lacZ, einen β-Galactosidase-Transkriptionsreporter des DHB- und BB-Biosyntheseoperons, beherbergt. Eine 24 Stunden lang auf MSgg gewachsene Kolonie zeigte in ihrer Mitte einen kleinen blauen Ring, der sich mit der Zeit schnell verdunkelte, was auf eine Fe-Begrenzung aufgrund der Fe-Ausfällung hindeutet (Abb. 3c). Interessanterweise war das PdhbA-lacZ-Signal nach 96 Stunden auch am äußeren Ring des WT sichtbar, jedoch nicht in ∆yvmC (Abb. 3c), was wahrscheinlich auf die Fe-Sequestrierung durch Pulcherrimin zurückzuführen ist, wie in einer früheren Studie beschrieben. Die PdhbA-lacZ-Expression wurde auch nach 48 Stunden auf MSgg quantifiziert, wo der WT in Gegenwart von Pf-5 ein erhöhtes Maß an LacZ-Aktivität zeigte, wenn PA reichlich produziert wurde (Abb. 3e). Die ∆yvmC-Mutante zeigte im Vergleich zu WT eine verringerte LacZ-Aktivität, neben Pf-5 wurde jedoch ein Anstieg beobachtet, was auf die Siderophorproduktion durch die konkurrierende Kolonie schließen lässt (Abb. 3e). Im MS-Medium, in dem Fe durch EDTA in Lösung gehalten wird, erschien PdhbA-lacZ sehr schwach exprimiert (Abb. 3d). In Gegenwart von Pf-5 zeigte der WT auf beiden Medien eine dunkelblaue Färbung (Abb. 3c, d). Bei WT mit Pf-5 in MS-Medium konnte ein deutlicher physikalischer Gradient des Fe-Mangels beobachtet werden, da die den Pf-5-Kolonien zugewandten Zellen einen viel dunkleren Farbton aufwiesen als der Rest der Kolonie (ergänzende Abbildung 4a). Die PdhbA-lacZ-Expression wurde auch nach 24 Stunden auf MS-Medium quantifiziert, um zu bestätigen, dass die PdhbA-lacZ-Expression nur dann erhöht war, wenn PA stark produziert wurde (Abb. 3f). Um den Beitrag von Pulcherrimin bei der Stimulierung der dhbA-Transkription zu validieren, wurde der mutierte ∆pchR (der negative Regulator der PA-Synthese) verwendet. Wie erwartet kam es bei ∆pchR zu einem starken Fe-Mangel, was durch eine starke Expression von lacZ unter und auf dem Biofilm gezeigt wurde (ergänzende Abbildung 4a – c). Darüber hinaus war die Anwesenheit von Pf-5 erforderlich, um eine starke dhbA-Expression im gesamten Biofilm zu erreichen, selbst wenn die Pulcherrimin-Akkumulation die dhbA-Expression auslöste (ergänzende Abbildung 4b). Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Kombination aus Pf-5- und Pulcherrimin-Produktion einen Fe-Stress erzeugt, der eine starke PdhbA-lacZ-Expression durch B. subtilis-Zellen hervorruft, was auf eine stärkere DHB- und BB-Synthese schließen lässt.

Die Aufrechterhaltung des WT-Wachstums in Gegenwart von Pf-5 bei MS trotz der Tatsache, dass Fe(III) im unlöslichen Pulcherrimin-Komplex chelatisiert ist, wirft die Frage auf, wie B. subtilis unter diesen Bedingungen Fe erwirbt. Daher präsentieren wir einen konzeptionellen Rahmen, der zwei mögliche Wege zur Fe-Rückgewinnung in Gegenwart von Pulcherrimin zusammenfasst (Abb. 4a). Erstens könnte der PA-Fe-Komplex von B. subtilis-Zellen aufgenommen werden, was seine Rolle als Siderophor bestätigt, wie zuvor vermutet19. Alternativ könnte Fe durch das starke BB-Siderophor remobilisiert werden, das unter diesen Bedingungen überproduziert wird. In ähnlicher Weise könnte Pf-5 Fe aus Pulcherrimin gewinnen, indem es die Produktion des richtigen Werkzeugs (dh des hochaffinen Fe-Liganden Pyoverdin) übernimmt. Wie in Abb. 4b zu sehen ist, stellte die Zugabe von FeCl3 oder Pulcherrimin das WT-Wachstum von B. subtilis (überwacht als OD600) im Vergleich zum Zustand mit Fe-Mangel wieder her. Die Wiederholung dieses Experiments mit einem ∆dhbF-Mutanten, der nicht in der Lage war, den letzten Schritt der BB-Synthese zu katalysieren, zeigte einen deutlichen Wachstumsdefekt in Gegenwart von Pulcherrimin als einziger Fe-Quelle, jedoch nicht in Gegenwart von FeCl3 gemäß einer früheren Studie (Abb. 4c)12,24. Schließlich konnte ein ∆dhbA-F-Mutant, der weder DHB noch BB produzieren kann, in Gegenwart von Pulcherrimin und FeCl3 nicht wachsen, konnte aber in Gegenwart von Fe-Citrat wachsen (ergänzende Abbildung S5). Dieses Ergebnis legt nahe, dass Pulcherrimin per se kein Siderophor ist und dass Siderophore für die Aufnahme von Pulcherrimin-gebundenem Fe erforderlich sind. In ähnlicher Weise kann B. subtilis WT, jedoch nicht die ∆dhbF-Mutante, Pulcherrimin als einzige Fe-Quelle für die Bildung des Fe-reichen Pellikels verwenden (Abb. 4e), ein Prozess, der eine große Menge Fe37 erfordert.

ein konzeptioneller Rahmen in MSgg, der den möglichen Weg der Fe-Rückgewinnung zeigt. Pulcherrimin könnte als Komplex (Siderophor) aufgenommen werden, oder in Pulcherrimin eingeschlossenes Fe könnte durch ein stärkeres Siderophor (BB) basierend auf der Affinitätskonstante remobilisiert werden. Eine fremde Spezies (Pf-5) könnte Fe aus Pulcherrimin entfernen und es als Fe-Quelle verwenden. b: Das WT-Wachstum von B. subtilis wurde (durch Absorption bei OD600) in MSgg-Medium überwacht. Die optische Dichte wurde alle 6 Stunden gemessen, beginnend 12 Stunden nach der Inokulation (12 Stunden, 18 Stunden, 24 Stunden, 30 Stunden und 36 Stunden) in Gegenwart von keinem zugesetztem Fe (Kontrolle), 50 µM FeCl3 und 50 µM Pulcherrimin as Fe-Quellen. c Das Wachstum von ∆dhbF wurde wie in (a) überwacht. d Das Wachstum des Konkurrenzstamms P. protegens Pf-5 wurde wie in (a) bewertet. e Häutchenbildungstests wurden durchgeführt, um die Robustheit des Biofilms in Gegenwart von nicht zugesetztem Fe, 50 µM FeCl3 und 50 µM Pulcherrimin als Fe-Quellen zu bewerten. Häutchen wurden in einer Platte mit 24 Vertiefungen kultiviert und 24 Stunden später wurden Bilder aufgenommen. Maßstabsleiste (oben oben rechts – 5 mm). Alle Experimente wurden in drei biologischen Replikaten mit drei technischen Replikaten durchgeführt. Es werden repräsentative Experimente und Bilder vorgestellt. Die Daten werden als Mittelwerte ±SD, n = 3 dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Da die Sequestrierung von Fe in Pulcherrimin die Fe-Aufnahme durch B. subtilis nicht verhindert, könnte Pf-5 durch die Monopolisierung von Fe ausgehungert werden (Abb. 4a). Überraschenderweise zeigte Pf-5 in Gegenwart von Pulcherrimin oder FeCl3 immer noch ein starkes Wachstum im Vergleich zu MSgg ohne Fe (Abb. 4d), was zeigt, dass an Pulcherrimin gebundenes Fe vom konkurrierenden Pf-5 verwendet werden kann.

Um zu bestätigen, dass Pulcherrimin-gebundenes Fe(III) durch BB remobilisiert wurde, wurde ein In-vitro-Dissoziationstest durchgeführt. Dieses Experiment erfordert hochwertige gereinigte Verbindungen, was mit den harten Schritten des Pulcherrimin-Reinigungsverfahrens nicht erreichbar ist. Daher wurde das Apo-PA synthetisiert, um das lösliche Molekül zu erhalten (siehe ergänzende Daten für Synthesedetails; siehe ergänzende Abbildung S6 für chemische Strukturen). Die Zugabe von Fe(III) zum Apo-PA führte zur Bildung eines roten, flockigen Niederschlags im Verhältnis 3:1 (PA:Fe) (Abb. 5c). Zunächst wurde Pulcherrimin (d. h. Fe-PA) mit Apo-BB im Verhältnis 1:1 basierend auf der Fe-Bindungskapazität gemischt und die Entwicklung der Fe-Bindung durch BB und die Wiederlöslichmachung von PA aufgrund der Dissoziation im Laufe der Zeit mit verfolgt UPLC-MS. Wie in Abb. 5a zu sehen ist, wurde eine Abnahme von Apo-BB und eine Zunahme von Apo-PA beobachtet. Der Apo-PA in Abwesenheit von BB wurde alle 24 Stunden bis 96 Stunden quantifiziert und die Pulcherrimin-Niederschläge wurden bei T = 0 und T + 96 Stunden gewichtet, um ihre Stabilität zu bewerten. Es wurden keine signifikanten Veränderungen beobachtet (ergänzende Abbildung S7), was bestätigt, dass BB Pulcherrimin dissoziierte, indem es Fe bindete und den Vorläufer PA löste. Auch die Größe der Pulcherrimin-Aggregate nahm mit der Zeit ab und ist sichtbar (Abb. 5c). Parallel dazu wurde der trockene Niederschlag gewogen und eine Abnahme der Pulcherrimin-Masse beobachtet, die nach 96 Stunden von 3,50 ± 1,11 mg auf 1,30 ± 0,26 mg anstieg, was die Dissoziation von Pulcherrimin durch BB bestätigte (Abb. 5b).

a Apo-BB wurde mit präzipitiertem Pulcherrimin im Verhältnis 1:1 gemischt. Apo-Siderophore (BB und PA) wurden durch UPLC-MS quantifiziert und Proben wurden nach 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden und 96 Stunden gesammelt. n = 12. b Röhrchen wurden zentrifugiert und getrocknet, um die Masse des Niederschlags über die Zeit zu bestimmen. n = 12. c Bilder wurden bei 0, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h aufgenommen, um die Pulcherrimin-Dissoziation sichtbar zu machen. n = 3. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

B. subtilis benötigt eine große Menge Fe für die Biofilmbildung, es ist jedoch bekannt, dass eine Fe-Überladung in Gegenwart von Sauerstoff schädliche Auswirkungen auf die Zellen hat38. Folglich ist eine strenge Regulierung erforderlich, um den Reduktions-Oxidations-(Redox-)Zyklus und die unter diesen Bedingungen auftretende Fenton- und Fenton-ähnliche Reaktion zu verhindern. Die Ausfällung von Pulcherrimin erzeugt einen großen Pool an lokalem Fe(III), der durch BB-Komplexierung zugänglich ist (siehe oben), und verhindert möglicherweise gleichzeitig die Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Die ROS-Spiegel wurden extrazellulär und intrazellulär im WT und der ∆yvmC-Mutante unter Verwendung der 2',7'-Dichlordihydrofluorescindiacetat-Sonde (DCFH2-DA) quantifiziert. DCFH2-DA ist eine weit verbreitete Fluoreszenzsonde zur Erkennung von allgemeinem oxidativem Stress39,40. Wie in Abb. 6a, b zu sehen ist, zeigten WT-Biofilme niedrige ROS-Werte auf MSgg, wo PA in großen Mengen ausgeschieden wird, und auf MS-Medium, wo die PA-Produktion minimal ist. Im Gegensatz dazu zeigte die ∆yvmC-Mutante hohe ROS-Werte in MSgg, jedoch nicht im MS-Medium, was darauf hinweist, dass die PA-Produktion und die anschließende Pulcherriminbildung für die Kontrolle des oxidativen Stresses auf MSgg sowohl extrazellulär als auch intrazellulär verantwortlich sind (Ergänzende Abbildung S8a – d). Die trans-Komplementierung des ∆yvmC reduzierte die ROS-Werte ähnlich wie bei WT (Abb. 6a, b).

a Quantifizierung des allgemeinen oxidativen Stresses (ROS) mit der DCFH2-DA-Sonde in MSgg-Medium. Die Fluoreszenzintensitäten wurden auf Biomasse (OD600) normalisiert. DFO zeigt an, dass das Siderophor Deferoxaminmesylat hinzugefügt wurde, um Fe zu chelatisieren; Com zeigt die Komplementierung durch amyE::PyvmC-yvmC-cypX im ∆yvmC-Mutantenhintergrund an. Die Experimente wurden in drei biologischen Replikaten mit drei technischen Replikaten durchgeführt. b Wie in (a), außer dass das Experiment in MS-Medium durchgeführt wurde. Die Experimente wurden in drei biologischen Replikaten mit drei technischen Replikaten durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwerte ±SD, n = 3 dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede hin, P < 0,05, einfaktorielle ANOVA und Tukeys Mehrfachvergleichstest. Graue Streifen zeigen das Fehlen von Pf-5 an und weiße Streifen zeigen das Vorhandensein von Pf-5 an. c Cyclovoltammetrie-Profilkurven von Fe(III)-EDTA (schwarze Linie; der Pfeil zeigt den Fe-Reduktionspeak), Fe(III)-DFO (blaugrüne Linie; der Pfeil zeigt den Fe-Reduktionspeak, DFO bezeichnet Deferoxamin) und Pulcherrimin ( PA-Fe(III); rosa Linie). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Beim Wachstum auf MS-Medium wird PA vom WT nur dann in hohem Maße produziert, wenn Pf-5 vorhanden ist. Außerdem zeigten ∆yvmC-Zellen, jedoch nicht WT-Zellen, in Gegenwart von Pf-5 hohe ROS-Werte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Anwesenheit von Pf-5 eine oxidative Umgebung schafft, die durch Pulcherrimin gemildert wird. Um zu bestätigen, dass PA oxidativen Stress durch Fe-Sequestrierung verhindert, wurden die resuspendierten Biofilme chemisch mit Deferoxamin (DFO), einem bekannten ROS-Schutzmittel41, und TPEN (N,N,N',N'-Tetrakis(2-pyridylmethyl)) ergänzt. Ethylendiamin), ein Metallchelatbildner mit hoher Affinität zu Zink42,43. Sowohl die DFO- als auch die TPEN-Supplementierung in der ∆yvmC-Mutante reduzieren die mit WT vergleichbaren extrazellulären ROS-Spiegel in beiden Medien (Abb. 6a, b). Allerdings reduzierte TPEN den intrazellulären ROS nicht in einem mit der DFO-Supplementierung vergleichbaren Ausmaß (ergänzende Abbildung S8c, d), was darauf hindeutet, dass Pulcherrimin durch Fe-Ausfällung den oxidativen Stress in B. subtilis abschwächte.

Ein charakteristisches Merkmal von PA im Vergleich zu den meisten Fe-Chelatbildnern besteht darin, dass nach der Fe-Bindung der resultierende Pulcherrimin-Komplex ausfällt. Um die Idee zu untersuchen, dass die Fe-Sequestrierung durch Pulcherrimin Fe(III) immobilisiert und Fenton-Reaktionen verhindert, wurde das Redoxpotential von an PA gebundenem Fe mit zwei bekannten Metallchelatbildnern verglichen: EDTA und Deferoxamin. Der vorgebildete Komplex Fe-EDTA zeigte reversible Oxidations- und Reduktionspeaks mit einem Zentrum bei E = 83 mV gegenüber Ag/AgCl (Abb. 6c). Die Fe-Komplexierung durch den starken Chelator Deferoxamin (vorgeformt) induzierte dagegen eine große kathodische Verschiebung des Reduktionspotentials auf −750 mV. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Reduzierung von an Deferoxamin gebundenem Fe schwieriger ist (Abb. 6c). Für Pulcherrimin wurde im Vergleich zu allen Liganden keine elektrochemische Reaktion gemessen, was darauf hindeuten könnte: (1) dass es an Fe(III) bindet und ausfällt, was zu einer Konzentration unterhalb unserer nachweisbaren voltammetrischen Werte führt; oder (2) dass Fe(III)-gebundenes Pulcherrimin ein Reduktionspotential außerhalb des von uns eingescannten Fensters besitzt (Abb. 6c; ergänzende Abb. S9). Dennoch führen beide Hypothesen zu einer geringen Fe-Reduktion im Vergleich zu den anderen Fe(III)-Chelatoren, was zeigt, dass Pulcherrimin oxidativem Stress stark entgegenwirkt.

In natürlichen Umgebungen ist die Eisengewinnung für Mikroben von zentraler Bedeutung, um im Wettbewerb zu bestehen und ihre ökologischen Nischen zu schützen. Um zu verstehen, was bakterielle Interaktionen in natürlichen Gemeinschaften antreibt, ist es notwendig, die verschiedenen Strategien und Moleküle zu kennen, die an der Fe-Fängung und -Sequestrierung beteiligt sind. Diese Studie liefert ein beispielloses Verständnis darüber, wie Pulcherrimin, ein Fe-ausfällendes Molekül aus B. subtilis und anderen Mikroorganismen, an der Fe-Aufnahme beteiligt ist und als Schutzmittel fungiert.

Während vermutet wurde, dass die PA-Produktion von B. subtilis und Metschnikowia entweder konstitutiv ist oder durch abiotische Faktoren moduliert wird14,44, berichten wir hier zum ersten Mal, dass sie als Reaktion darauf ausgeschüttet werden kann, dass ein bestimmter Konkurrent PA zu einem Teil des B. subtilis-Wettbewerbswerkzeugkastens macht . Signale, die die PA-Sekretion auslösen, sind wahrscheinlich multifaktoriell, da sowohl diffundierbare Moleküle als auch von Pf-5 produzierte flüchtige Stoffe einen hohen Anteil an PA-produzierenden Zellen in der B. subtilis-Population auslösen (Abb. 1). Es gibt zahlreiche Hinweise darauf, dass flüchtige Stoffe eine wichtige Rolle bei der Modulation mikrobieller Gemeinschaften spielen45,46. Bemerkenswert ist, dass die flüchtigen Stoffe der Pseudomonas-Arten vielfältig sind und andere Mikroorganismen antagonisieren können, darunter Pilze und bakterielle Pflanzenpathogene47,48,49. Es könnte interessant sein zu untersuchen, wie sich die Produktion von Pulcherrimin auf die Fitness von B. subtilis in Gegenwart anderer Bakterienarten auswirkt und, was noch wichtiger ist, ob Pulcherrimin während der Besiedlung von Pflanzenwurzeln produziert wird.

Das auffälligste Merkmal von Pulcherriminsäure ist ihre Ausfällung bei der Fe(III)-Bindung15. Während Pulcherrimin vermutlich als Siderophor fungiert19, deuten unsere Arbeiten darauf hin, dass der PA-Fe-Komplex nicht ohne weiteres für die Aufnahme verfügbar ist und daher per se kein Siderophor ist. Unsere Daten deuten jedoch auch darauf hin, dass es an einer umfassenderen Strategie zur Eisengewinnung beteiligt sein könnte. Eine wesentliche Einschränkung der Siderophor-unterstützten Akquisition sind die hohen Kosten für die Siderophor-Produktion und die Gewinnung des Fe-Siderophor-Komplexes. Darüber hinaus erhöht der Verlust von Siderophoren vor der Fe-Rückgewinnung aufgrund der Diffusion von den Zellen und des Abbaus (z. B. sind einige Siderophore empfindlich gegenüber Oxidation) wahrscheinlich die Kosten der Fe-Aufnahme. Die PA-Synthese ist eine zweistufige enzymatische Reaktion unter Verwendung von Leucin-tRNA als Vorläufer50, und BB wird über eine vierstufige nicht-ribosomale Peptidsynthese12 hergestellt. Somit sind die Stoffwechselkosten von PA deutlich niedriger als die von BB. Wir schlagen vor, dass Pulcherrimin Teil einer „Store and Mine“-Strategie sein könnte. Wir können uns ein Modell vorstellen, bei dem PA (niedrige metabolische Kosten) ausgeschieden wird, um Fe aus der Umwelt innerhalb und in der Nähe des Biofilms schnell zu immobilisieren. Diese immobilisierte lokale Fe-Quelle, die von potenziellen Flüssen nicht beeinflusst wird, könnte dann von BB abgerufen werden (Abb. 4), wenn Fe benötigt wird.

Die intrazelluläre und extrazelluläre Sequestrierung wertvoller Nährstoffe ist eine wirksame Strategie zur Bewältigung des Wettbewerbs51,52. Die Sequestrierung von Fe(III) in einem Niederschlag würde den Fe-Zugang zu benachbarten Konkurrenten ohne starke Siderophore sehr effektiv verlangsamen und B. subtilis einen erheblichen Wettbewerbsvorteil verschaffen. Aber wie bei Pf-5 beobachtet (Abb. 4d), wird es die Fe-Erfassung durch Konkurrenten, die Siderophore mit hoher Affinität besitzen, nicht hemmen. In Böden, in denen mehrere Stressfaktoren (z. B. Nährstoffe) die Stoffwechselaktivität einschränken, ist die Immobilisierung von Fe immer noch von Vorteil, wenn sie zu einer insgesamt höheren Steuer auf die Fe-Erfassung durch den Konkurrenten führt als bei B. subtilis. Daher argumentieren wir, dass die extrazelluläre Fe-Sequestrierung durch PA zwar höchstwahrscheinlich keine allgemeingültige Strategie zur Bewältigung von Konkurrenten darstellt, sie jedoch eine weitere wertvolle Waffe im Arsenal ist, die B. subtilis und möglicherweise anderen Arten zur Verfügung steht, um Fe zu verwalten unter Wettbewerbsstress. Weitere Untersuchungen zur PA-Fe-Nutzungseffizienz durch B. subtilis und Konkurrenten sind erforderlich, um diese Hypothese weiter zu testen.

Es ist allgemein bekannt, dass Siderophore zusätzlich zur Fe-Aufnahme mehrere physiologische Rollen spielen, die sich aus ihren Fähigkeiten zur Fe-Chelatbildung ergeben53,54. Zusätzlich zu seiner Rolle als Fe-Immobilisierer beobachteten wir, dass Pulcherrimin den oxidativen Stress im B. subtilis-Biofilm reduzieren kann. Oxidativer Stress und Fe sind über die Fenton-Reaktion miteinander verbunden, bei der Fe(II) das Substrat und Fe(III) das Produkt ist. Die Bindung von Fe(III) durch Chelatbildner, wie z. B. von verschiedenen Bakterienarten produzierte Siderophore, kann die Reduktion zu Fe(II) behindern und somit die Fenton-Reaktion verhindern53,55,56. Auf diese Weise würde Pulcherrimin die Sterblichkeitsrate aufgrund von ROS begrenzen und eine nachhaltige Biofilmbildung ermöglichen (Abb. 2), da gezeigt wurde, dass B. subtilis den ROS-Spiegel streng kontrollieren muss, um seinen Biofilm vollständig zu entwickeln57. Mithilfe der Cyclovoltammetrie haben wir bestätigt, dass die Immobilisierung von Fe(III) durch Pulcherrimin dessen Reduktion verhindert. Bemerkenswert ist, dass der schwache Siderophor DHB, der in hohen Konzentrationen von B. subtilis gegen Pf-5 produziert wird, eine phenolische Verbindung ist, die die Fenton-Reaktion fördern kann58,59. Daher schlagen wir vor, dass die PA-Produktion und die anschließende Bildung des Pulcherrimin-Komplexes der Wirkung von DHB entgegenwirken (Abb. 3c, d) und B. subtilis vor oxidativem Stress während der Biofilmbildung schützen, da eine große Produktion von DHB22,24 sowie eine Akkumulation von erforderlich sind Fe für Stoffwechselaktivitäten in den anoxischen Schichten des Biofilms24.

Pulcherrimin- und Siderophorproduktion sind Merkmale, die viele Mikrobenarten gemeinsam haben, und die in dieser Studie aufgedeckten Fe-Management-Strategien könnten auf mehr Mikroben als B. subtilis anwendbar sein. Tatsächlich wurde durch eine vergleichende Genomanalyse bestätigt, dass PA von Isolaten von Bacillus cereus (opportunistischer Erreger) und Staphylococcus epidermidis (Hautkommensalbakterium) produziert wird14. Die Bildung einer immobilisierten, aber zugänglichen lokalen Fe-Quelle, die durch Fe-ausfällende Moleküle und die Produktion von Siderophoren gesteuert wird, ist eine attraktive Strategie für das Management von Fe im Biofilm- (oder Kolonie-) Maßstab und könnte in vielen Ökosystemen weit verbreitet sein.

Die in dieser Studie verwendeten Stämme und Plasmide sind in Tabelle S1 aufgeführt. B. subtilis-Stämme wurden routinemäßig in lysogener Brühe (Luria-Bertani LB; 1 % w/v Trypton, 0,5 % w/v Hefeextrakt, 0,5 % w/v NaCl) bei 37 °C unter Rühren 3 Stunden lang kultiviert. Pseudomonas-Stämme wurden in LB bei 30 °C unter Rühren 3 Stunden lang kultiviert. Bei Bedarf wurden Antibiotika in der folgenden Konzentration verwendet: Spectinomycin (100 µg·mL−1), Kanamycin (10 µg·mL−1), Ampicillin (100 µg·mL−1).

Alle in dieser Studie verwendeten Deletionsmutanten wurden aus der Sammlung des Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) (http://www.bgsc.org) im Hintergrund von B. subtilis 168 erworben und durch Transduktion mit SPP1 in die undomestizierten Stämme NCIB 3610 eingeführt -vermittelte generalisierte Transduktion60. Für die PyvmC-yfp-Transkriptionsreporter wurde die Promotorregion von yvmC durch PCR aus NCIB 3610-gDNA unter Verwendung der Primer PBB666 (5ʹ-AGTCGAATTCTGTTCATTAAGGTGCAGCAGTCTCAC-3ʹ) und PBB667 (5ʹ-GTAGCATGCCTATTATGCCCCGTCAAACGCAACG-3ʹ) amplifiziert. Das PCR-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SphI verdaut und in das Plasmid pKM00361 ligiert. Das resultierende Plasmid wurde linearisiert und in B. subtilis 168 transformiert, bevor es durch Transduktion unter Verwendung von SPP1-Phagen in NCIB 3610 eingeführt wurde. Für die PdhbA-lacZ-Transkriptionsfusion wurde die Promotorregion von dhbA durch PCR aus NCIB 3610-gDNA unter Verwendung der Primer PBB696 (5ʹ-GCTAGAATTCGTATACGGGCAGAATTTTGCGAGT-3ʹ) und PBB697 (5ʹ-GTACGGATCCTGCGCCTTGACTGGCAAGC-3ʹ) amplifiziert. Die Primer wurden bei Integrated DNA Technologies, IDT, bestellt. Das PCR-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI verdaut und in das Plasmid pDG172862 ligiert. Das resultierende Plasmid wurde linearisiert und in B. subtilis 168 transformiert, bevor es durch Transduktion unter Verwendung von SPP1-Phagen in NCIB 3610, ∆yvmC und ∆pchR eingeführt wurde.

B. subtilis-Stämme und Pseudomonas-Arten wurden in PBS gewaschen und ihre OD600 wurde auf 0,6 eingestellt. Zehn µL Zellsuspension wurden dann in einem Abstand von 0,7 cm auf Murashige und Skoog (MS; Sigma – M5519; 20,61 mM NH4NO3, 100 µM H3BO3, 2,99 mM CaCl2, 0,11 µM CoCl2·6H2O, 0,1 µM CuSO4·5H2O, 100 µM) getupft Na2-EDTA, 100 µM FeSO4·7H2O, 1,5 mM MgSO4, 100 µM MnSO4·H2O, 1,03 µM Na2MoO4·2H2O, 5 µM KI, 18,79 mM KNO3, 1,25 mM KH2PO4, 29,91 µM ZnSO4·7H2O, 26,64 µM Glycin, 0,56 µM Myoinositol, 4,06 µM Nikotinsäure, 2,43 µM Pyridoxin·HCl, 0,30 µM Thiamin·HCl, 0,5 % v/v Glycerin und 0,5 % v/v Glutamat) oder MSgg (5 mM Kaliumphosphat und 100 mM MOPS (3- (N-Morpholino)propansulfonsäure) bei pH 7,0 mit 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM Thiamin, 0,5 % v/v Glycerin und 0,5 % v/v Glutamat ), ergänzt mit 1,5 % w/v Agar, und inkubiert bei 30 °C. Bei Bedarf wurde X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Galactopyranosid) in einer Endkonzentration von 120 µg·mL−1 hinzugefügt. Zur Beurteilung von Biomasse und KBE wurden B. subtilis-Biofilme mit einer sterilen P200-Spitze entfernt und in ein Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml PBS überführt. Biofilme wurden 30 bis 60 Sekunden lang (bis zur Homogenität) ohne Pause mit 30 % Amplitude beschallt. Die Zellen wurden verdünnt und zur KBE-Zählung auf LB ausplattiert. Die optische Dichte bei 600 nm (Biomasse) wurde mit einem Genesys 30 S UV-Vis-Spektrophotometer bewertet.

Für diese Studie wurden zwei Mikroskope verwendet. Mit dem Stereomikroskop Leica M165 FC wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Hellfeldbilder mit der Kamera Leica MC170 HD aufgenommen. Für Fluoreszenzbilder wurde die Kamera Leica DFC3000 G (Graustufen) verwendet. Das Zeiss-Mikroskop Axio Zoom. Es wurde auch ein V16 mit der Farbkamera AxioCam 506 verwendet. Für die Bildanalyse wurde Fidschi (ImageJ1; Version 2.9.0/1.53t) verwendet.

Für die durchflusszytometrische Analyse des amyE::PyvmC-yfp-Reporters wurden 24 Stunden lang gewachsene Zellen mit einer P200-Spitze von der Agaroberfläche entfernt und in ein Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml PBS gegeben. Die Zellen wurden mit einer Amplitude von 30 % zwischen 30 und 60 s ohne Pause bis zur Homogenität beschallt, dann 2 Minuten lang bei 13.800 × g zentrifugiert, bevor 200 µl Paraformaldehyd 4 % zugegeben wurden. Die Zellen wurden 7 Minuten lang fixiert und vor der Analyse zweimal mit PBS gewaschen. Die Datenerfassung erfolgte mit BD FACSJazz unter Verwendung eines 488-nm-Lasers und BD Accuri C6 plus. Die Datenanalyse wurde mit der BD-Software (BD CSampler plus Version 1.0.23.1 und BD FACS Sortware 1.2.0.142) durchgeführt.

Biofilme wurden gewogen und dann mit 0,8 ml Salpetersäure (Spurenmetallqualität; Fischer Scientific) auf einem SCP Science Digiprep Jr 45 Minuten lang bei 65 °C aufgeschlossen. Nach dem Aufschluss wurden 0,4 ml in ein 15-ml-Falcon-Röhrchen überführt und mit Milli-Q-Wasser aufgefüllt, um ein Endvolumen von 10 ml zu erreichen. Zur intrazellulären Fe-Quantifizierung wurden Zellen aus der Matrix anhand eines optimierten Protokolls isoliert, das an anderer Stelle entwickelt wurde22. Die gesamten Biofilme wurden in 1 ml Oxalat/EDTA (0,1 M/0,05 M) gewonnen und 7 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die Proben wurden 7 Minuten lang bei 6500 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in 1 ml NaCl 0,5 M resuspendiert, bevor sie 30 s lang bei 30 % Amplitude beschallt wurden. Dem Überstand wurde NaOH in einer Endkonzentration von 0,1 M zugesetzt und 5 Minuten bei RT inkubiert. Die Proben wurden 7 Minuten lang bei 6500 × g zentrifugiert und erneut 7 Minuten lang in 1 ml Oxalat/EDTA (0,1 M/0,05 M) resuspendiert. Die Proben wurden wie in den vorherigen Schritten zentrifugiert und die Pellets wurden 7 Minuten lang in verdünnter Oxalat/EDTA-Lösung (0,025 M/0,0125 M) resuspendiert. Abschließend wurden die Zellen zentrifugiert und bis zur Analyse bei 4 °C gelagert. Die Zellen wurden wie oben beschrieben verdaut. Die Proben wurden auf einem ICP-MS XSeries 2 auf ihren Fe-Gehalt analysiert. Thermo Scientific und auf einem ICP-MS Agilent 7850, ausgestattet mit einem Autosampler SPS 4.

Die Reinigung von Pulcherrimin wurde gegenüber den zuvor beschriebenen Protokollen15,19 modifiziert. Kurz gesagt, B. subtilis NCIB 3610 wurde 3 Stunden lang bei 37 °C in LB unter Rühren gezüchtet, um eine OD600 = 1–1,5 zu erreichen. Ein ml B. subtilis NCIB 3610 (OD600 normalisiert auf 1) wurde in 50 ml MSgg-Medium in einem 200-ml-Kulturkolben ohne Rühren bei 37 °C für 48–72 Stunden inokuliert (bis ein klarer roter Niederschlag sichtbar war). Die Kultur wurde 15 Minuten lang bei 4 °C und 27.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und 25 ml 2 M NaOH wurden zugegeben, um den roten Niederschlag zu lösen. Die gelbe Mischung wurde bei 20.000 × g und 4 °C zentrifugiert, um ausgefallenes Eisen zu entfernen. Der klare Überstand wurde überführt und mit 36,5–38 % HCl angesäuert, um einen pH-Wert von 1 zu erreichen. Nach der Zugabe von HCl begann sich die Mischung rot zu färben und es begann sich Pulcherrimin-Niederschlag zu bilden. Die Mischung wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurde die Mischung bei 10.000 xg zentrifugiert und das ausgefallene Pulcherrimin mit 100 % EtOH gewaschen. Pulcherrimin wurde über Nacht bei 37 °C getrocknet und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Einzelheiten zur Pulcherriminsäure-Synthese finden Sie in den Zusatzinformationen.

B. subtilis-Biofilme wurden in Z-Puffer (40 mM NaHPO4; 60 mM Na2HPO4; 1 mM MgSO4; 10 mM KCl) suspendiert, bevor sie 30 s lang mit 30 % Amplitude beschallt wurden und die OD600 gemessen wurde. β-Mercaptoethanol wurde bis zu einer Endkonzentration von 38 mM zugegeben. Der Bakteriensuspension wurden 20 Mikroliter Lysozym (20 mg/ml) zugesetzt und zwischen 30 Minuten und 1 Stunde bei 30 °C inkubiert. Alle Proben wurden verdünnt und 100 µL einer ONPG-Lösung (4 mg/ml) in Z-Puffer mit β-Mercaptoethanol (38 mM) hinzugefügt. Als die Lösungen begannen, sich gelb zu färben, wurden 250 µL 1 M Na2CO3 zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und OD420 und OD550 wurden aufgezeichnet. Die Miller-Einheiten wurden auf Grundlage der folgenden Gleichung berechnet: Miller-Einheiten = 1000 x [(A420nm −1,75 x OD550nm)]/(Tmin x VmL x OD600).

B. subtilis-Zellen wurden in LB bei 37 °C 3 Stunden lang bis zur exponentiellen Phase gezüchtet, gewaschen und in PBS bei einer OD600 = 1 resuspendiert. Anschließend wurden 15 µL in 1 ml MSgg in einer 24-Well-Platte inokuliert. Eisenchlorid (FeCl3) oder Pulcherrimin oder Fe-Citrat wurden 12 Stunden nach der Inokulation in einer Endkonzentration von 50 µM zugegeben. Um das Wachstum zu bewerten, wurde der Inhalt der Vertiefungen nach 12, 18, 24, 30 und 36 Stunden geerntet und mit Ultraschall behandelt, um das Häutchen und die Aggregate aufzubrechen. Die Biomasse wurde anhand der optischen Dichte bei OD600 bewertet und die Zellen wurden verdünnt und auf LB-Agarplatten ausplattiert, um die KBE zu zählen.

Alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien waren analysenrein. Methanol (MeOH), Wasser (H2O) und Ameisensäure (FA) (Optima-Qualität für LC-MS) wurden von Fisher Scientific (Ottawa, ON, Kanada) bezogen. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 4 ° C und 10.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und durch Festphasenextraktion (SPE) unter Verwendung von HLB-Kartuschen (Waters Corporation, Milford, MA) gereinigt. Die Kartuschen wurden mit 1 ml MeOH konditioniert und mit 1 ml H2O äquilibriert. Nach dem Laden von 1 ml Überstand wurde die SPE-Kartusche mit 1 ml H2O gespült und 1 Minute lang unter einem sanften Stickstoffstrom getrocknet. Der Analyt wurde mit viermal 250 µL MeOH eluiert. Abschließend wurde die Probe vor der UPLC-MS/MS-Analyse durch einen 0,22 µm PTFE-Spritzenfilter filtriert. Probenanalysen wurden mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (UPLC, Xevo TQ MS) durchgeführt. Die Verbindungen wurden mit einem HSS-T3 (100 × 2,1 mm, Partikelgröße 1,8 µm) (Waters Corporation, Milford, MA) getrennt. Die mobile Phase bestand aus Lösungsmittel A (H2O + 0,1 % FA) und aus Lösungsmittel B (MeOH + 0,1 % FA). Die Flussrate wurde auf 0,4 ml/min eingestellt und das injizierte Volumen betrug 3 µL. Nach der Injektion wurden die Proben mit folgendem Gradienten eluiert: 0–1 Min., 5 % B, 1–4 Min., 5–100 % B, 4–6 Min., 100 % B, 6–7 Min., 100–5 % B, 7–8 min, 5 % B. Die Effizienz der Methode ist in Tabelle S2 für Linearität dargestellt. Die Wiederfindungs- und Nachweisgrenzen sowie die Quantifizierungsgrenzen sind in Tabelle S3 aufgeführt. Die Nachweisgrenzen (LOD) und Quantifizierungsgrenzen (LOQ) wurden gemäß dem Internationalen Komitee für Harmonisierung auf das Drei- und Zehnfache des Standardfehlers der Kalibrierungskurve63 festgelegt.

B. subtilis-Kolonien wurden nach 24 Stunden geerntet und 30–60 Sekunden lang bei 30 % Amplitude beschallt, bis sie homogen waren. Die Zellsuspension wurde dann mit 2',7'-Dichlordihydrofluorescindiacetat (DCFH2-DA; Reinheit ≥97 %, Sigma), einem fluorogenen Farbstoff, der in das fluoreszierende DCF umgewandelt wird, in einer Endkonzentration von 100 µM gemischt und darin inkubiert 1 Stunde dunkel. Deferoxaminmesylat (DFO; Reinheit ≥92,5 %, Sigma) und N,N,N',N'-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylendiamin (TPEN; Reinheit ≥97 %, EMD Millipore). Durch 1-minütige Zentrifugation bei 16.200 × g wurden die Zellen zu Pellets. Der Überstand wurde gesammelt (100 µL) und die Zellen wurden in PBS resuspendiert, bevor sie in eine 96-Well-Platte (100 µL) überführt wurden, und die Fluoreszenzintensität wurde mit einem TECAN Spark-Monochromator (SparkControl Version 3.1) mit Anregung gemessen Wellenlänge von 485 nm und Emissionswellenlänge von 535 nm, Bandbreite 20.

Um das Redoxpotential von Pulcherrimin zu charakterisieren, wurde eine zyklische Voltammetrie durchgeführt, um zu bewerten, inwieweit Pulcherrimin Fe(III) im Vergleich zu bekannten Fe-Chelatoren wie Deferoxamin und EDTA immobilisiert. Fe-Deferoxamin- und Fe-EDTA-Komplexe wurden 1 Stunde lang im Dunkeln vorgebildet. Für Fe-PA wurde die Komplexierung in der elektrochemischen Zelle 3 Minuten vor der Aufnahme des ersten Voltammogramms durchgeführt. Das Experiment wurde auf einem CHI-1040C (CH Instruments) durchgeführt. Eine Glaskohlenstoff-Arbeitselektrode (CHI104) mit 3 mm Durchmesser, eine Platinplatte (Gegenelektrode) und eine Ag/AgCl (KCl-gesättigt; Referenzelektrode) wurden verwendet und von CH Instruments erworben. Alle voltammetrischen Experimente wurden in sauerstofffreiem PBS mit einem konstanten Argonfluss durchgeführt, indem das Potential zwischen −1,0 und 1,0 V bei einer Abtastrate von 25 mV·s−1 variiert wurde. Alle Lösungen wurden mit 10–4 M Fe (Verhältnis 1:1; Ligand-Metall) bewertet, mit Ausnahme von Pulcherriminsäure, wo 2 × 10–4 M zugesetzt wurden (Verhältnis 3:2; PA-Fe).

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 9 Version 9.4.0 durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

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Wir danken den Mitgliedern des Beauregard-Labors, des Bellenger-Labors und des Matthew F. Traxler-Labors für hilfreiche Diskussionen. Wir danken außerdem Daniel Garneau, Philippe Venne, René Gagnon, Matthieu Fillion und Daniel Fortin für die technische Beratung. Wir danken François MM Morel und Anne M. Kraepiel-Morel für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch ein Master-Stipendium (302246) von Fond de Recherche – Nature et Technologies an FO, durch ein Doktoratsstipendium (299933) von Fond de Recherche – Nature et Technologies an VCL und durch das NSERC Discovery Grant RGPIN-2016-03660 unterstützt an JPB und NSERC Discovery Grant RGPIN-2020-07057 an PBB

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lounès Haroune, Maude Pomerleau, Léo Hall, Frédéric Orban.

Fachbereich Biologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Kanada

Vincent Charron-Lamoureux, Maude Pomerleau, Julie Leroux, Jean-Sébastien Bourassa und Pascale B. Beauregard

Fachbereich Chemie, Fakultät für Naturwissenschaften, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Kanada

Lounès Haroune, Léo Hall, Frédéric Orban, Adrien Rizzi, Nicolas Fontaine, Élodie V. d'Astous, Philippe Dauphin-Ducharme, Claude Y. Legault und Jean-Philippe Bellenger

Sherbrooke Institute of Pharmacology, Medizinische Fakultät, University of Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Kanada

Lounès Haroune

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VCL hat das Projekt konzipiert. PBB und JPB überwachten die Entwicklung des Projekts. VCL, L.Har, MP und JL erfassten Daten. JSB beriet und half beim Bau der Dehnungsanlagen. AR, NF und EVA leisteten technische Beratung. FO und L.Hal führten alle Syntheseexperimente durch. CYL leitete und beriet die synthetische Chemie. PDD leitete und beriet zyklische Voltammetrie-Experimente. VCL, PBB und JPB haben das Manuskript geschrieben und alle Autoren haben zur Bearbeitung beigetragen und das Manuskript genehmigt.

Korrespondenz mit Vincent Charron-Lamoureux oder Pascale B. Beauregard.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Yunrong Chai und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Charron-Lamoureux, V., Haroune, L., Pomerleau, M. et al. Pulcherriminsäure moduliert die Eisenverfügbarkeit und schützt vor oxidativem Stress bei mikrobiellen Interaktionen. Nat Commun 14, 2536 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38222-0

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Eingegangen: 07. September 2022

Angenommen: 20. April 2023

Veröffentlicht: 03. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38222-0

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