Der Einfluss ausgewählter abiotischer Faktoren auf den Brutprozess von Artemia durch reale

Dec 19, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 6370 (2023) Diesen Artikel zitieren

735 Zugriffe

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Aktuelle Studien zu abiotischen Auswirkungen auf Artemia, ein in der Aquakultur und Ökotoxikologie weit verbreitetes Krebstier, konzentrieren sich häufig auf Endpunktanalysen (z. B. Schlupfraten, Überleben). Hier zeigen wir, dass ein mechanistisches Verständnis durch die Messung des Sauerstoffverbrauchs in Echtzeit über einen längeren Zeitraum in einer mikrofluidischen Plattform gewonnen werden kann. Die Plattform ermöglicht eine umfassende Kontrolle der Mikroumgebung und die direkte Beobachtung morphologischer Veränderungen. Zur Demonstration werden Temperatur und Salzgehalt ausgewählt, um kritische abiotische Parameter darzustellen, die auch durch den Klimawandel bedroht sind. Der Schlüpfprozess von Artemia besteht aus vier verschiedenen Phasen: Hydratation, Differenzierung, Entstehung und Schlüpfen. Es hat sich gezeigt, dass unterschiedliche Temperaturen (20, 35 und 30 °C) und Salzgehalte (0, 25, 50 und 75 ppt) die Dauer der Schlupfstadien, die Stoffwechselraten und die Schlüpfbarkeit erheblich verändern. Insbesondere wurde die Wiederaufnahme des Stoffwechsels ruhender Artemia-Zysten bei höheren Temperaturen und mäßigem Salzgehalt deutlich beschleunigt, die für diese Wiederaufnahme benötigte Zeit war jedoch nur von höheren Temperaturen abhängig. Die Schlüpfbarkeit hing umgekehrt mit der Dauer der Differenzierungsphase des Schlüpfens zusammen, die bei niedrigeren Temperaturen und Salzgehalten länger andauerte. Der aktuelle Ansatz der Untersuchung des Stoffwechsels und der entsprechenden physikalischen Veränderungen kann zur Untersuchung der Schlüpfprozesse anderer Wasserlebewesen, auch solcher mit geringer Stoffwechselrate, eingesetzt werden.

Die steigende Konzentration von Treibhausgasen, die durch anthropogene Aktivitäten verursacht wird, verändert das globale Klima und eine der unmittelbaren Folgen ist eine höhere Umgebungstemperatur1,2,3. Die Ozeane auf der ganzen Welt absorbieren als Wärmesenken den Großteil dieser Wärme4,5. Die thermische Ausdehnung der Ozeane infolge des erhöhten Wärmegehalts sowie das Abschmelzen der Gletscher führen zu einem Anstieg des Ozeanvolumens, was sich direkt auf den Salzgehalt des Meerwassers auswirkt6,7, der durch Veränderungen im globalen Wasserkreislauf8,9 noch verstärkt wird . Die Auswirkungen von Schwankungen dieser Parameter auf Fortpflanzung und Gesundheit können die Häufigkeit und Verbreitung verschiedener Wasserarten beeinflussen. Die genauen Wirkmechanismen verschiedener sich ändernder Umweltfaktoren, wie abiotischer Faktoren10,11 und Umweltgifte12,13, auf die phänotypische Reaktion verschiedener Arten wurden untersucht. Unser Ziel ist es, durch Echtzeitüberwachung ein mechanistisches Verständnis der Auswirkungen von Veränderungen in der abiotischen Umgebung auf den Schlüpfprozess von Artemia, allgemein als Salzgarnelen bezeichnet, zu erlangen. Artemia ist ein beliebtes Lebendfutter für die Aquakultur, da es eine hohe Nährstoffdichte aufweist, leicht zu kultivieren ist und relativ klein ist. Dadurch eignet sich diese Art optimal für die Fütterung von Meereslarven mit kleinem Maulspalt14,15. Es wird auch häufig als Modellorganismus in biochemischen, physiologischen, genetischen, ökologischen und ökotoxikologischen Studien eingesetzt16,17,18. Trotz der Tatsache, dass Artemia in einer hypersalinen Umgebung leben, die ihr einziger Abwehrmechanismus gegen Raubtiere ist19,20, kann das mechanistische Verständnis der Auswirkungen abiotischer Faktoren auf den Schlüpfprozess von Artemia möglicherweise Einblicke in die Auswirkungen von Temperatur- und Salzgehaltsänderungen auf die Umgebung liefern Schlüpfen anderer in der Meeresumwelt weit verbreiteter Krebstiere wie Ruderfußkrebse.

Artemia-Weibchen entwickeln während der Oviparitätsart der Fortpflanzung (endogene Diapause) eine Diapausenzyste ohne erkennbare Stoffwechselaktivität21. In diesem Ruhestadium können Zysten durch Lufttrocknung oder osmotische Wasserentfernung dehydriert werden. Zu diesem Zeitpunkt befinden sich die Zysten im Ruhezustand und können bis zu 28 Jahre überleben22. Der Metabolismus der Zysten kann wieder aufgenommen und das Schlüpfen eingeleitet werden, wenn die Umweltbedingungen günstig sind23, wobei die primären abiotischen Umweltparameter, die die Schlupfbarkeit beeinflussen, Wassertemperatur und Salzgehalt sind17,24,25. In einer Reihe früherer Studien wurde der Einfluss dieser abiotischen Umweltparameter auf das Schlüpfen von Artemia untersucht26,27,28,29,30,31, die Auswertung beschränkte sich jedoch auf die Messung der Schlupfrate am Endpunkt des Experiments. Kumar et al. beobachteten, dass die optimale Schlüpfleistung von Artemia bei 29 °C und einem Salzgehalt von 29 ppm auftrat26, während Sharahi et al. fanden heraus, dass die optimalen Bedingungen bei 27–28 °C bzw. 35 ppt liegen30. Hasan et al. zeigten, dass der maximale Anteil an Artemia schlüpfte, wenn der Salzgehalt und die Temperatur 30 ppt bzw. 24 °C betrugen, und dass die Schlüpfrate abnahm, wenn die Temperatur von 24 auf 32 °C anstieg, während der Salzgehalt zwischen 20 und 40 ppt lag27. Ahmed et al. berichteten, dass der optimale Salzgehalt für die Brutfähigkeit 20 ppt31 beträgt. In einer anderen Studie von Bahr et al. Zum Einfluss des Salzgehalts auf das Schlüpfen wurde die optimale Schlüpfbarkeit bei einem Salzgehalt von 60 ppt und Temperaturen um 30 °C gefunden28. Die Variation der optimalen Parameter könnte auf Unterschiede in den Testeinstellungen (z. B. Lichteinwirkung25,30,32) oder auf Unterschiede in den Umgebungsbedingungen (Behältergröße, Temperatur-/Salzgehaltsgradienten in Massenmedien) zurückzuführen sein.

Diese Arbeit zielt darauf ab, Umweltbedingungen zu vereinheitlichen und das Verständnis der Auswirkungen abiotischer Parameter über die Endpunktmetrik der Schlupfrate hinaus auf eine eingehende, mechanistische Analyse ihrer Auswirkungen auf den Schlüpfprozess von Artemia zu erweitern. Die vier unterschiedlichen Stadien des Schlüpfens von Artemia – (1) Hydratation, (2) Differenzierung, (3) Entstehung und (4) Schlüpfen33 – können anhand der morphologischen Veränderungen und des Stoffwechsels34,35 unterschieden werden. In dieser Studie haben wir einen optischen Sauerstoffsensor in ein mikrofluidisches „Aquarium“ integriert, um die Rate des Sauerstoffverbrauchs, auch Routine-Stoffwechselrate36 genannt, während des gesamten Schlüpfprozesses in Echtzeit zu überwachen, während zur Erfassung ein optisches Mikroskop eingesetzt wird Mikrofotografien der schlüpfenden Zysten in regelmäßigen Zeitabständen. Zuvor wurde der Metabolismus von Artemia-Zysten37 und anderen kleinen Krebstieren wie Acartia tonsa38,39 und Leptodora kindti40 mithilfe verschiedener Respirometrietechniken untersucht. Die relativ geringe Größe der in dieser Studie verwendeten Mikrofluidikplattform kann das Signal-Rausch-Verhältnis41,42,43 des Sauerstoffsensors verringern und die Korrelation von Sensordaten mit Mikroskop-Bilddaten ermöglichen. Die Plattform kann mit programmierbaren Steuerungen außerhalb des Chips auch leichter einheitliche Umgebungsbedingungen aufrechterhalten44,45,46 als mit Massensystemen (z. B. Bechergläsern, Fischtanks), die in zeitgenössischen Studien verwendet werden. In jüngster Zeit wurden mikro- und millifluidische Lab-on-a-Chip-Plattformen für pharmazeutische Anwendungen eingesetzt, darunter Arzneimitteltests an Zellen47, biologische Studien an Arten wie C. elegans48,49,50,51,52 und Zebrafischen53,54,55. Darüber hinaus wird in der vorliegenden Arbeit die Genauigkeit der Endpunktanalyse der Schlupfrate auch durch die automatisierte Übertragung der gesamten getesteten Probe auf einen Zählchip mit Sieb verbessert, wodurch Kontaminationen und menschliche Fehler minimiert werden56,57,58,59. wie Strukturen, die in ihrer Gesamtheit abgebildet und mit Bildanalyse verarbeitet werden können, anstatt sich auf eine Chargenprobe und manuelle Zählmethoden zu verlassen.

Artemia-Zysten wurden von Brine Shrimp Direct gekauft und wie vom Verkäufer empfohlen bei 4 °C bis einen Tag vor den Schlüpfstudien gelagert. Anschließend wurden sie auf Raumtemperatur gebracht, um eine allmähliche Temperaturanpassung zu ermöglichen. Abbildung 1A zeigt die Rasterelektronenmikroskopbilder (REM) (JEOL FS-100) der Artemia-Zysten im erhaltenen Zustand. Die Zysten haben eine becherförmige Struktur und der Durchmesser der kreisförmigen Becherstruktur liegt zwischen 180 und 260 µm.

Versuchsaufbau. (A) Rasterelektronenmikroskopie (REM) zeigt die becherartige Struktur der Artemia-Zysten im Originalzustand bei 450-facher Vergrößerung. (B) Schematischer Überblick über die mikrofluidische Plattform zur Untersuchung der Auswirkung abiotischer Umweltparameter auf die Schlupfleistung von Artemia. (C) Schraffurchip mit integriertem O2-Sensor und angeschlossenen Temperatursonden (Skalenbalken = 5 mm) (Position des O2-Sensorflecks ist im Einschub dargestellt) (D) Zählchip mit siebartigen Strukturen aus PDMS-Mikrosäulen am Auslass (Skala). Balken = 10 mm) [An den Siebstrukturen eingeschlossene Zysten und Nauplien sind im Einschub dargestellt (Maßstabsbalken = 500 µm)].

Die Schlüpfstudien der Artemia-Zysten wurden auf einer mikrofluidischen Plattform durchgeführt (Abb. 1B). Die Plattform bestand aus einem Schlüpfchip, der eine zylindrische Kammer (Durchmesser 13 mm, Höhe 3,55 mm) aufweist, die mit einem Einlass und Auslass (Höhe 1,7 mm, Breite 4 mm) verbunden ist (ergänzende Abbildung 1A). Das Gesamtvolumen des Brutchips beträgt ~ 563 µL. Abgerundete Ecken (Verrundungen) wurden am Ein- und Auslass eingebaut, um sicherzustellen, dass Zysten beim Einsetzen zu Beginn des Schlüpfens und beim Transfer der Zysten und Nauplien am Ende des Experiments nicht in den Kammerecken eingeklemmt wurden. Das Totvolumen wurde durch die Simulation des Flüssigkeitsflusses in ANSYS FLUENT minimiert (ergänzende Abbildung 1B). Abbildung 1C zeigt die für diese Studie verwendete Brutkammer. Der Chip bestand aus Polydimethylsiloxan (PDMS) und wurde durch Gießen von PDMS auf eine Form (ergänzende Abbildung 1C) hergestellt, die mit einem 3D-Drucker (MAX X-43, Asiga) hergestellt und über Nacht bei 60 ° C in einem Schwerkraftkonvektionsofen (Modell : 10GC, Quincy Lab). Der Schraffurchip besteht aus zwei Schichten. Die obere Schicht weist die Kammer- und Kanalstrukturen auf und die untere Schicht ist eine leere PDMS-Platte. Sowohl die obere als auch die untere Schicht des Schlüpfchips wurden durch Koronabehandlung (BD-20AC, ETP) und anschließendes Erhitzen auf 60 °C über Nacht verbunden. Vor dem Verkleben der Schichten wurden mithilfe von Biopsiestanzen mehrere Löcher für den Einlass, den Auslass und die Sensoren in die obere Schicht gebohrt. Ein O2-Sensorpunkt (OXSP5, Pyroscience) wurde mit Silikonkleber (Spglue, Pyroscience) auf die PDMS-Oberschicht im Inneren der Kammer geklebt. Durch ein Loch im PDMS-Chip wurde ein Lichtwellenleiter genau hinter dem O2-Sensorpunkt angeschlossen. Die optische Faser wurde an ein externes optisches Sauerstoffmessgerät (FireSting®-O2, Pyroscience) angeschlossen. Das Sauerstoffmessgerät bestand aus einer Leuchtdiode (LED) und einer Fotodiode, die die sauerstoffabhängige Lumineszenzemission des sauerstoffempfindlichen Flecks sowohl stimulieren als auch erkennen und während des Schlüpfens jede Sekunde die gelöste Sauerstoffkonzentration des Wassers in der Kammer messen. An den Chip wurde außerdem eine Temperatursonde (Pt100, Pyroscience) angeschlossen, um die Temperatur des Wassers im Inneren des Chips zu erfassen und so die Messwerte der gelösten Sauerstoffkonzentration bei Temperaturschwankungen zu kompensieren. Um Abweichungen zu minimieren, wurde der Chip auf einer Filmheizung (PI Film Heater-24 V, Icstation) platziert, die mit einem Proportional-Integral-Differential-Regler (PID) (6–30 V DC Electronic Thermostat Controller, DROK) verbunden war, der die Steuerung übernahm die Temperatur des Wassers im Brutchip entsprechend der eingestellten Temperatur (20, 25 und 30 °C). Zur Stromversorgung des PID-Reglers wurde ein Gleichstromadapter mit variabler Spannung (ALP002, KEJIESHENG) verwendet und eine Thermoelementsonde (TC 10K, QINGDAO) zur Messung der Wassertemperatur im Chip angeschlossen. Der PID-Regler passt die Eingangsleistung entsprechend der Sondenmessung an, um eine maximale Abweichung von 0,1 °C von der eingestellten Temperatur aufrechtzuerhalten. Der Schlüpfchip mit der eingebetteten Heizung wurde unter ein digitales optisches Stereomikroskop (SE400-Z, Amscope) gelegt, das mit einer Digitalkamera (MD500, Amscope) ausgestattet war, um während des Schlüpfens alle fünf Minuten eine Mikrofotografie des Chips aufzunehmen. Während des gesamten Schlüpfvorgangs wurde eine Leuchtdiode (LED) (1 W, Amscope) aufgrund ihrer Wirkung auf den Schlüpfvorgang kontinuierlich eingeschaltet26,32.

Vor Beginn des Experiments wurde das Wasser zum Schlüpfen vorbereitet, indem unterschiedliche Mengen handelsübliches Meersalz (Fluval Sea, pH: 8,1–8,2) zu entionisiertem Wasser (DIW) gegeben wurden (aufbereitet und gefiltert (Filterporengröße = 200 nm). ) unter Verwendung des Barnstead Smart2Pure Water Purification System, Thermo Scientific) zur Herstellung von künstlichem Salzwasser mit 0, 25, 50 und 75 ppm Salzgehalt, das in einem Reagenzglas mit einem Vortex-Mischer gemischt wurde (Vortex Genie 2, Scientific Industries) . Durch gründliches Mischen der Salzwasserlösung wird eine gleichmäßige Verteilung des gelösten Sauerstoffs und Salzes ermöglicht. Das Gewicht der Artemia-Zysten wurde mit einer digitalen Präzisionswaage (Bonvoisin) gemessen und sorgfältig mit der Salzwasserlösung gemischt, so dass die Zystenkonzentration 5 g/L betrug. Die Zystenlösung wurde sofort in den Schlüpfchip eingebracht, bis die Kammer gefüllt war. Anschließend wurden der Ein- und Auslass des Chips mit flexiblen Schläuchen und Verbindungsklammern verschlossen, um das Eindringen von Luft in das Innere des Chips zu verhindern. Ab dem Eintauchen der Zysten in die Salzlösungen wurden 24 Stunden lang Schlüpfversuche durchgeführt. Die Schlüpfexperimente wurden dreifach für jede Temperatur- (20, 25 und 30 °C) und Salzgehaltsbedingung (0, 25, 50 und 75 ppt) durchgeführt.

Die verschiedenen Schlüpfstadien von Artemia und der Übergang zwischen ihnen können anhand von Änderungen im Rückgang der gelösten Sauerstoffkonzentration (DDOC) des Wassers im geschlossenen Schlüpfchip als Folge des Sauerstoffverbrauchs durch die Zysten identifiziert werden, gemessen durch die on- Chip-Sauerstoffsensor und die Mikrofotografien des Lichtmikroskops. Dies gibt Aufschluss über den Sauerstoffverbrauch und die Dauer der verschiedenen Schlüpfstadien. Die Ergebnisse des Sauerstoffverbrauchs werden unter Berücksichtigung der Sauerstoffkonzentrationsrate (ROC) in jedem Stadium normalisiert, da der absolute Wert und die Dauer der verschiedenen Schlüpfstadien je nach Temperatur und Salzgehalt variieren. ROC kann auch als Standardstoffwechselrate betrachtet werden, wie in der Literatur erwähnt36. Der ROC wurde anhand der folgenden Formel berechnet

In jedem Schlupfstadium wurden die Dauer und der entsprechende ROC gemessen – mit Ausnahme bestimmter Temperaturen und Salzgehalte, bei denen die Schlüpf- und Schlüpfstadien im Schlüpfzeitraum von 24 Stunden nicht abgeschlossen waren (siehe „Auswirkungen des Salzgehalts und der Temperatur des Wassers auf …“) die Dauer verschiedener Schlüpfstadien“).

Die Tiefe des Schlüpfchips (3,55 mm) wurde so ausgelegt, dass die Suspensionsflüssigkeit ausreichend gelösten Sauerstoff zum Schlüpfen und Platz zum Schwimmen der Nauplien enthält. Diese Tiefe ermöglichte die Platzierung mehrerer Nauplien und Zysten in derselben vertikalen Ebene, was eine genaue Zählung der Nauplien und Zysten unmöglich machte. Daher wurde ein Zählchip (Abb. 1D) mit einer Kammer mit geringer Tiefe (800 µm) entworfen, sodass Nauplien und Zysten auf eine einzige Monoschicht beschränkt waren. Der Chip hatte einen Einlass und einen Auslass. Der Auslass enthielt PDMS-Mikrosäulen, die als siebartige Strukturen fungierten (Abb. 1D-Einschub) und nur das Wasser durch den Kanal fließen ließen, wodurch verhindert wurde, dass die Nauplien und Zysten in der Kammer entweichen. Der Chip bestand aus zwei Schichten: Die oberste Schicht hatte eine Kammer, Mikropillarstrukturen, einen Einlass und einen Auslass und bestand aus PDMS, das auf eine 3D-gedruckte Form gegossen wurde (ergänzende Abbildung 2A). Die unterste Schicht war eine leere PDMS-Platte. Die Verbindung beider Schichten erfolgte mittels Koronabehandlung und anschließender Erwärmung, wie oben beschrieben. Am Ein- und Auslass des Zählchips ist die Höhe höher als die der Kammer (1,7 mm gegenüber 800 µm) und mit einem Kehlkopfradius von 900 µm ausgestattet, um einen reibungslosen Fluss von Artemia-Zysten und Nauplien durch den Ein- und Auslass zu ermöglichen . Ergänzende Abbildung 2B zeigt die Ergebnisse einer ANSYS Fluent-Simulation des Flüssigkeitsflusses durch den Chip und zeigt, dass kein Totvolumen vorhanden ist. Nach 24 Stunden wurden die geschlüpften Nauplien und die geschlüpften/nicht geschlüpften Zysten im Schlüpfchip automatisch in einer 30 %igen Methanollösung mit einer Flussrate von 100 µL/min mittels einer Spritzenpumpe (Pico plus 11 Elite, Harvard Apparatus) auf den Zählchip übertragen. Der Auslass des Schlüpfchips und der Einlass des Zählchips wurden durch einen Schlauch aus Poly(tetrafluorethylen) (PTFE) verbunden, und der Einlass des Schlüpfchips ist über einen flexiblen Tygon-Schlauch mit der in der Spritzenpumpe montierten Spritze verbunden. Artemia-Nauplien schwimmen nach dem Schlüpfen schnell und die 30 %ige Methanollösung in DIW wurde zum Einschläfern der Nauplien verwendet, um klare Bilder im Zählchip zu erhalten. Mit einer Digitalkamera (D3100, Nikon) wurden Bilder der Nauplien und Zysten im Brutchip aufgenommen. Die Bilder wurden in ImageJ verarbeitet, wobei die Anzahl der Zysten und Nauplien anhand ihrer Zirkularität gezählt wurde. Wenn ein Objekt eine Zirkularität größer oder gleich 0,9 aufwies, wurde es als Zyste (schraffiert oder nicht schraffiert) betrachtet, und jedes Objekt im Bild mit einer geringeren Zirkularität (weniger als 0,9) wurde als Nauplie betrachtet (ergänzende Abbildung). 3). Die Schlupfrate wurde anhand der folgenden Formel berechnet

Für alle statistischen Analysen wurde OriginPro (Version 2022b, OriginLab) verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Wie bereits im Abschnitt „Sauerstoffverbrauchsrate und Dauer verschiedener Stadien“ erwähnt, waren die Entstehungs- und Schlüpfstadien bei bestimmten Temperaturen und Salzgehalten nicht innerhalb von 24 Stunden abgeschlossen. Daher wurde für diese Phasen die Signifikanz der Daten mithilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und anschließendem Bonferroni-Post-hoc-Test bestimmt. Für die ersten beiden Phasen (Hydratation und Differenzierung) und die Schlüpfrate am Endpunkt wurden jedoch Daten bei allen Temperaturen und Salzgehalten erhalten, und die Signifikanz der Daten innerhalb und zwischen den Gruppen wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test bestimmt . Die ANOVA-Tabellen sind in der Ergänzungstabelle 1 enthalten. Vor der Durchführung der ANOVA-Tests wurden die Daten mithilfe eines normalen Quantil-Quantil-Diagramms mit einem Konfidenzniveau von 95 % auf Normalität untersucht. Die Analyse der Korrelation zwischen verschiedenen Ergebnissen wurde mithilfe des Pearson-Korrelationskoeffizienten durchgeführt. Daten wurden in allen statistischen Analysen als signifikant angesehen, wenn p < 0,05.

Wenn Artemia-Zysten schlüpfen, verändern sich ihr Sauerstoffverbrauch und ihre Morphologie. Wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben, wurden diese Veränderungen mit einem On-Chip-Sauerstoffsensor und einem optischen Mikroskop aufgezeichnet. Abbildung 2A zeigt Mikrofotografien verschiedener Schlüpfstadien. Abbildung 2B zeigt die Abnahme der gelösten Sauerstoffkonzentration (DDOC) des Wassers im Schraffurchip. Wenn sich Zysten im Schlüpfchip befanden, nahm die Konzentration des gelösten Sauerstoffs im Wasser ab, da die Zysten während des Schlüpfvorgangs Sauerstoff verbrauchten, und somit stieg der DDOC (blaue durchgezogene Linie). Die Sauerstoffverbrauchsrate (ROC) in jeder Phase, geschätzt durch Gl. (1) ist auch in Abb. 2B dargestellt (grüne durchgezogene Linie). Wenn der Schlüpfchip nur künstliches Salzwasser, aber keine Zysten enthielt (Kontrollexperiment), waren DDOC (blaue gepunktete Linie) und ROC (grüne gepunktete Linie) nahezu vernachlässigbar. Es ist wichtig zu beachten, dass das Schlüpfchip-Material PDMS zwar sauerstoffdurchlässig ist60,61, ein Vergleich des DDOC mit Zysten im Chip mit dem DDOC ohne Zysten (Kontrolle) jedoch zeigt, dass die Sauerstoffverbrauchsrate in allen Stadien deutlich höher ist als Dies unterstützt die Verwendung des vorliegenden Aufbaus zum qualitativen Vergleich des DDOC unter verschiedenen Umgebungsbedingungen. Da die Artemia-Zysten, die in dieser Studie zum Schlüpfen verwendet wurden, nicht sterilisiert wurden, stellen wir fest, dass die Möglichkeit besteht, dass sie Mikroorganismen enthalten, die einen Teil des gelösten Sauerstoffs verbrauchen. Die Auswirkungen von Zysten und das potenzielle Vorhandensein von Mikroorganismen auf das DDOC wurden in dieser Studie nicht unterschieden und weitere Untersuchungen sind erforderlich. Da das Kontrollexperiment jedoch (gepunktete Linien in Abb. 2B) vernachlässigbare Veränderungen des DDOC über den Zeitraum von 24 Stunden anzeigt, kann der Schluss gezogen werden, dass weder der Schlüpfchip noch potenzielle Mikroorganismen im künstlichen Salzwasser selbst zu Veränderungen des DDOC beigetragen haben .

Mikrofotografien und Messwerte des O2-Sensors in verschiedenen Phasen des Schlüpfens. (A) Mikrophotographie in verschiedenen Stadien der Schraffur, erhalten mit dem optischen Stereomikroskop (Maßstabsbalken = 500 µm). Der Einschub zeigt die Morphologie der Zysten/Nauplien in verschiedenen Stadien (Maßstabsbalken = 100 µm). (B) On-Chip-Erkennung der Erschöpfung der gelösten Sauerstoffkonzentration (DDOC), wenn Artemia-Zysten (blaue durchgezogene Linie) und keine Zysten (kontrollblaue gestrichelte Linie) im Schraffurchip bei 25 °C und 25 ppt vorhanden waren. Die Sauerstoffverbrauchsrate (ROC) in verschiedenen Stadien wurde durch grüne Linien dargestellt (durchgezogene Linie – mit Zysten, gepunktete Linie – Kontrolle). Die fetten Linien im Diagramm zeigen den Durchschnitt und der schattierte Bereich zeigt die Standardabweichung. Rote Dreiecke in (B) stellen den DDOC zu den Zeitpunkten dar, die den in (A) dargestellten Mikrofotografien entsprechen.

Das Eintauchen der Zysten in Wasser leitet die Hydratationsphase ein, in der sich die Zysten aufblähen und eine kugelförmige (statt einer becherförmigen) Form annehmen [Abb. 2A(i)]. Da die Zysten Wasser aufnehmen, beginnen innerhalb kurzer Zeit der Energiestoffwechsel, die RNA- und Proteinsynthese34,62. Wenn der Energiestoffwechsel reaktiviert wird, nimmt die Atmungsaktivität dramatisch zu, was durch den erhöhten ROC belegt wird (Abb. 2B). Am Ende der Hydratationsphase haben die meisten Zysten eine kugelförmige Form und die Differenzierung beginnt. Außerdem gibt es in diesem Stadium keine Zellteilung und keinen Anstieg der DNA34,62, was zu einem nahezu konstanten und niedrigen Sauerstoffbedarf und damit zu einem niedrigeren ROC führt (Abb. 2B). Im dritten Stadium (Emergenz) beginnt die Zystenhülle aufgrund des erhöhten Turgordrucks im Inneren, der durch eine erhöhte Menge an Glycerin entsteht, zu brechen, und der Embryo beginnt, innerhalb einer Schlüpfmembran aus der zerbrochenen Hülle hervorzutreten [Abb. 2A(iii)]35. Die Emergenzphase ist sehr aktiv und benötigt zusätzliche Energie, was zu einem Anstieg von DDOC und ROC führt (Abb. 2B). Schließlich verlassen die Artemia-Embryonen im letzten Stadium (Schlüpfen) die Zystenhülle und die Schlupfmembran und beginnen zu schwimmen [Abb. 2A(iv)]. Zu diesem Zeitpunkt sank der Sauerstoffbedarf wieder, was durch eine vergleichsweise Abnahme des ROC nachgewiesen wurde (Abb. 2B).

Die Dauer jeder Schlüpfphase bei verschiedenen Temperaturen und Salzgehalten ist in Abb. 3 dargestellt. Insgesamt stellen wir fest, dass bei der niedrigsten Temperatur (20 °C) und/oder dem niedrigsten Salzgehalt (0 ppt) in unserem getesteten Bereich die 24- Aufgrund der langen Dauer jeder der ersten drei Phasen, mit Ausnahme von 20 °C bei 25 ppt und 0 ppt bei 30 °C, reichte der Zeitraum von h nicht aus, um das Schlüpfen abzuschließen. Dementsprechend wurde festgestellt, dass die Dauer des Schlüpfstadiums (definiert als die verbleibende Zeit am Ende des Auflaufstadiums) erheblich abnahm, wenn der Salzgehalt bei 25 und 30 °C auf 75 ppt anstieg. Bei 20 °C (wo das Schlüpfstadium nur bei einem Salzgehalt von 25 ppt beobachtet wurde) war die Dauer des Schlüpfstadiums im Vergleich zu allen anderen untersuchten Temperaturen unabhängig vom Salzgehalt deutlich verkürzt.

Dauer verschiedener Schlüpfstadien bei unterschiedlichen Wassersalzgehalten und -temperaturen. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) ausgedrückt. In jeder Kategorie (Hydratation und Dauer der Differenzierungsphase) unterscheiden sich Mittelwerte, die nicht den gleichen Buchstaben haben, signifikant voneinander (zweistufige ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test, p < 0,05). Die Schlupfstadien, die nicht innerhalb von 24 Stunden abgeschlossen waren, wurden nicht statistisch ausgewertet und mit „nc“ gekennzeichnet. * und # bezeichnen eine deutlich unterschiedliche Dauer des Auflauf- bzw. Schlüpfstadiums bei einer Temperatur im Vergleich zu den anderen getesteten Temperaturen (einfaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test, p < 0,05). ** bezeichnet eine signifikant unterschiedliche Dauer des Schlüpfstadiums zwischen zwei verschiedenen getesteten Salzgehalten (einfaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test, p < 0,05).

Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die trockenen Artemia-Zysten während der Hydratation (grüne Balken, Abb. 3) Wasser durch Osmose absorbieren63, kann der Einfluss von Temperatur und Salzgehalt durch das Van't-Hoff-Gesetz64 modelliert werden

Dabei ist Δπ der Unterschied im osmotischen Druck, R die universelle Gaskonstante, T die Temperatur und ΔC der Unterschied in den Konzentrationen gelöster Stoffe. Mit zunehmender Temperatur (T) steigt auch die Osmoserate, was einer Verringerung der Hydratationsdauer entspricht, wie in Abb. 3 dargestellt. Ergänzende Abbildung 4A zeigt die signifikante negative Korrelation zwischen der Hydratationsdauer und der Temperatur, die durch die Pearson-Korrelation bestimmt wird Koeffizient (r = − 0,9) und eine lineare Anpassung zwischen diesen Parametern (R2 = 0,99) (ergänzende Abbildung 4B). Gleichzeitig kann die Erhöhung des Salzgehalts des Wassers bei jeder Temperatur den Unterschied in der inneren und äußeren Konzentration gelöster Stoffe (ΔC) von Zysten verringern, was den osmotischen Druck mit zunehmender Hydratationsdauer verringern sollte. Die experimentellen Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass Änderungen im Salzgehalt keinen signifikanten Einfluss auf die Hydratationsdauer hatten. Im Gegensatz dazu verringerte sich die Differenzierungsdauer (blaue Balken, Abb. 3) bei jeder Temperatur außer 30 °C signifikant, wenn die Temperatur oder der Salzgehalt von 0 auf 25 ppt erhöht wurde (variiert nicht wesentlich über 25 ppt). Um dies zu verstehen, stellen wir fest, dass die Zyste im Differenzierungsstadium das Entstehungsstadium erreicht, in dem der zunehmende Turgordruck, der durch die Synthese von Glycerin aus Trehalose hervorgerufen wird, dazu führt, dass die Schale zu brechen beginnt. Ein Temperaturanstieg steigert die Glycerinsynthese63, was wiederum die Differenzierungsdauer verkürzt. Ein zunehmender Salzgehalt erhöht auch den Glycerinspiegel35 und kann die Differenzierungsdauer verkürzen. Wenn jedoch der Salzgehalt des Wassers steigt, wird die äußere Umgebung hypertonisch und es besteht die Möglichkeit eines zellulären Wasserverlusts aufgrund des Exosmoseprozesses, der die Differenzierungsperiode bei höherem Salzgehalt verlängern könnte. Der Wettbewerb zwischen diesen beiden gegensätzlichen Faktoren könnte erklären, warum es bei einem Salzgehalt von mehr als 25 ppt keinen signifikanten Unterschied in der Dauer der Differenzierungsphase gab. Interessanterweise deutet die Dauer des Auflaufstadiums (orangefarbene Balken, Abb. 3) auf eine optimale Temperatur von 25 °C mit einer deutlichen Verkürzung der Dauer im Vergleich zu 20 und 30 °C hin. Obwohl die Temperatur dazu beiträgt, den osmotischen Druck zu erhöhen und somit die Länge der Hydratations- und Differenzierungsphase zu verkürzen, scheint es, sobald die Emergenzphase beginnt und der Embryo innerhalb der Schlupfmembran schlüpft, eine geringere Toleranz gegenüber höheren Temperaturen zu haben. Daher war eine Zwischentemperatur von 25 °C für das Auflaufstadium günstiger und erforderte weniger Zeit für die Fertigstellung.

Ein weiteres Verständnis des Schlüpfprozesses erhält man durch die direkte Untersuchung der Abnahme der gelösten Sauerstoffkonzentration (DDOC) des Wassers in der Schlüpfkammer bei unterschiedlichen Temperaturen und Salzgehalten. Ergänzende Abbildung 5 zeigt die durchschnittlichen DDOC-Kurven von Dreifachexperimenten, die bei jeder Temperatur- und Salzgehaltsbedingung durchgeführt wurden. Insgesamt deuten die Ergebnisse auf eine positive Korrelation zwischen der Schlüpfdauer und dem DDOC für Salzgehalte über Null hin.

Der gesamte DDOC bzw. Gesamtsauerstoffverbrauch für die 24-stündige Schlüpfperiode ist in Abb. 4A dargestellt und weist auf das Vorliegen einer optimalen Temperatur (25 °C) hin, da der Gesamtsauerstoffverbrauch bei dieser Temperatur unabhängig vom Salzgehalt höher ist. Der Gesamtsauerstoffverbrauch nahm unabhängig vom Salzgehalt deutlich ab, als die Temperatur von 20 auf 30 °C stieg. Der Salzgehalt senkte den Gesamtsauerstoffverbrauch nur dann signifikant, wenn er unabhängig von der Temperatur von 25 auf 75 ppt erhöht wurde; Allerdings gab es keine signifikante Veränderung, wenn der Salzgehalt bei 30 °C verändert wurde, was auf eine signifikante Wechselwirkung zwischen Temperatur und Salzgehalt schließen lässt. Basierend auf dem Gewicht der verwendeten trockenen Ausgangszysten lag dieser Gesamtsauerstoffverbrauch zwischen 5,81 × 10–7 und 3,47 × 10–5 mg O2/h/mg Trockengewicht bei unterschiedlicher Temperatur und Salzgehalt, was mit dem Sauerstoffverbrauch vergleichbar ist von Artemia37 und anderen Krustentiereiern wie Anomalocera patersoni65 und Pontella mediterranea66, über die in früheren Studien berichtet wurde.

Sauerstoffverbrauch der Artemia-Zysten bei unterschiedlichen Temperaturen und Salzgehalten. (A) Gesamtsauerstoffverbrauch oder Gesamt-DDOC während des gesamten Schlüpfprozesses bei unterschiedlichen Temperaturen und Salzgehalten. (B) Sauerstoffverbrauchsrate (ROC) in verschiedenen Schlüpfstadien: (i) Hydratation, (ii) Differenzierung, (iii) Auflaufen und (iv) Schlüpfstadium. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) ausgedrückt. In jeder Datenkategorie (Gesamtsauerstoffverbrauch oder ROC in Hydratations- und Differenzierungsstadien) unterscheiden sich die Mittelwerte, die keine gemeinsamen Buchstaben über den Spalten aufweisen, erheblich voneinander (Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test, p < 0,05). . Bei verschiedenen getesteten Temperaturen wurde ein statistisch signifikanter ROC durch * (zweifaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test, p < 0,05) bzw. ** (einfaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test, p < 0,05) angegeben # zeigt einen statistisch signifikanten Gesamtsauerstoffverbrauch an (zweistufige ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test, p < 0,05).

Durch die Berücksichtigung des Sauerstoffverbrauchs in jeder der vier Phasen des Schlüpfens erhält man ein detaillierteres Verständnis der Auswirkungen von Temperatur und Salzgehalt auf den Schlüpfprozess. Unabhängig vom Salzgehalt stieg der ROC während der Hydratation signifikant an, wenn die Temperatur von 20 °C erhöht wurde [Abb. 4B(i)]. Auch der ROC nahm mit zunehmendem Salzgehalt zwischen 25 und 75 ppt deutlich ab, was eine geringere Aktivität entsprechend der längeren Dauer widerspiegelt (Abb. 3). Andererseits wurde die Stoffwechselrate nicht signifikant beeinflusst, obwohl sowohl der Salzgehalt als auch die Temperatur die Differenzierungsdauer verringerten [Abb. 4B(ii)]. Es wurde festgestellt, dass der ROC im Auflaufstadium erheblich von der Temperatur beeinflusst wird, nicht jedoch vom Salzgehalt auf dem Niveau von p = 0,05 (einfaktorielle ANOVA), wobei der ROC deutlich abnimmt, wenn die Temperatur von 25 auf 30 °C erhöht wird (Bonferroni, p < 0,05, Abb. 4B(iii)). Wir stellen fest, dass die statistische Signifikanz der Daten aufgrund der unvollständigen Emergenz unter einigen experimentellen Bedingungen mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test bewertet wurde (Abb. 3). Der verringerte Sauerstoffverbrauch bei erhöhter Temperatur kann auf physiologischen Stress hinweisen. Schließlich nahm der ROC im Schlüpfstadium im Vergleich zum Auflaufstadium ab und erreichte unabhängig vom Salzgehalt sein Maximum bei 25 °C, und der Salzgehalt hat in diesem Stadium keinen Einfluss auf den ROC. Ein ähnlicher Anstieg des Energiebedarfs beim Auflaufen und ein Rückgang nach dem Schlüpfen wurde bei anderen Krebstierarten wie Acartia tonsa67, Cherax quadricarinatus68 und Cancer pagurus69 beobachtet. In unserer Studie lag der Sauerstoffverbrauch pro Trockengewichtseinheit der Artemia-Zysten im Entstehungsstadium bei unterschiedlichen Temperaturen und Salzgehalten zwischen 7,98 × 10–7 und 2,5 × 10–5 mg O2/h/mg Trockengewicht. Basierend auf der Obergrenze ist die Sauerstoffaufnahme während der Entstehung einer Artemia-Zyste etwa 5,54-mal niedriger als bei großen Krebstieren (Cancer pagurus)69 und 0,43-mal höher als bei kleinen Krebstieren (Pontella mediterranea)66. Darüber hinaus wurde im Schlüpfstadium unter bestimmten Temperatur- und Salzgehaltsbedingungen ein negativer ROC beobachtet. Bei einem Salzgehalt von 25 ppt bei 20 °C und 30 °C könnte dies auf den sehr geringen Sauerstoffverbrauch der geschlüpften Artemia und die mögliche Permeation einer sehr geringen Menge Sauerstoff durch PDMS zurückzuführen sein (siehe Abb. 2B – Kontrollexperiment). Bei 0 ppt/30 °C wurde jedoch beobachtet, dass alle Nauplien nach dem Schlüpfen starben (keine Mobilität), möglicherweise aufgrund der kombinierten Wirkung von null Salzgehalt und hoher Temperatur, und aus unbekannten Gründen stieg die Sauerstoffkonzentration des Wassers währenddessen an diesmal. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass während des Schlüpfens bei einigen Zysten beobachtet wurde, dass sie Luftblasen freisetzten, die möglicherweise ursprünglich in der Zystenhülle eingeschlossen waren. Lebende Nauplien würden diesen zusätzlichen Sauerstoff aus Luftblasen verbrauchen; Da jedoch in diesem Fall keine lebenden Nauplien vorhanden waren, stieg der Sauerstoffgehalt des Brutwassers leicht an. Der genaue Grund für diesen erhöhten Sauerstoffgehalt ist jedoch unbekannt und bedarf weiterer Untersuchungen.

Abbildung 5 zeigt die Schlüpfrate (geschätzt anhand von Gleichung (2)) von Artemia-Zysten in unserer Plattform bei unterschiedlichen Temperaturen und Salzgehalten. In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten deuten die Ergebnisse auf das Vorhandensein optimaler Bedingungen27,30 hin. Konkret stieg die Schlupfrate dramatisch an, als die Temperatur von 20 auf 25 °C anstieg, es gab jedoch keine signifikante Veränderung, als die Temperatur weiter anstieg. In ähnlicher Weise erhöhte sich die Schlupfrate, wenn der Salzgehalt von 0 auf 25 ppt bei 20 und 25 °C und 0–50 ppt bei 30 °C erhöht wurde, nahm jedoch anschließend mit zunehmendem Salzgehalt ab. Eine maximale Schlupfrate wurde bei einer Temperatur von 25 °C und einem Salzgehalt des Wassers von 25 ppt (76,85 ± 14,22 %) in Übereinstimmung mit dem gemessenen maximalen ROC beobachtet [Abb. 4(iv)]. Darüber hinaus deutete der gemessene ROC darauf hin, dass die sehr niedrigen Schlupfraten bei null Salzgehalt und 20 °C nicht unbedingt auf lebensfeindliche Bedingungen zurückzuführen sind (da wir Aktivität beobachten), sondern dass die 24-Stunden-Dauer unzureichend ist.

Berechnung der Schlüpfrate von Artemia auf dem Chip bei verschiedenen Wassersalzgehalten und -temperaturen. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) ausgedrückt. Mittelwerte, die über den Spalten nicht den gleichen Buchstaben haben, unterscheiden sich erheblich voneinander (Zweifaktorielle ANOVA mit Bonferroni, p < 0,05).

Der vorliegende Ansatz, bei dem der gesamte Schlupfprozess in Echtzeit überwacht wird, fördert auf einzigartige Weise das Verständnis der Beziehungen zwischen den abiotischen Parametern, den Phasenmerkmalen (Dauer, ROC) und der Schlupfrate. Um diese Parameter zu quantifizieren, haben wir eine Pearson-Korrelation implementiert. Wir stellen zunächst fest, dass der ROC zwar erheblich durch Temperatur, Salzgehalt oder beides beeinflusst wurde, jedoch nur der ROC im Schlüpfstadium einen statistisch signifikanten Zusammenhang (positive Korrelation) mit der Schlüpfrate aufwies. Andererseits korreliert nur die Differenzierungsdauer signifikant mit der Schlupfrate (negative Korrelation).

Es wurden negative Korrelationen zwischen der Schlupfrate und der Hydratation sowie der Dauer des Differenzierungsstadiums und eine positive Korrelation zwischen der Schlupfrate und der Dauer des Schlupfstadiums beobachtet. Die Schlüpfrate war maximal, wenn die Temperatur und der Salzgehalt 25 °C bzw. 25 ppt betrugen. Bei niedrigerer oder höherer Temperatur oder höherem Salzgehalt unter den getesteten Bedingungen dauerte die Hydratations- und Differenzierungsphase länger und die Schlüpfphase war kürzer. Ebenso korreliert der Sauerstoffverbrauch positiv mit der Schlupfrate im Hydratations- und Schlupfstadium, jedoch negativ mit der Schlupfrate im Differenzierungsstadium. Bei einer Temperatur von 25 °C und einem Salzgehalt von 25 ppt war der Sauerstoffverbrauch im Hydratationsstadium vergleichsweise hoch, im Differenzierungsstadium niedriger und im Schlüpfstadium sehr hoch. Dieses Muster kehrte sich bei sehr niedrigen oder sehr hohen getesteten Temperaturen oder Salzgehalten um. Diese Ergebnisse zeigen, dass Temperatur und Salzgehalt den gesamten Schlüpfprozess erheblich beeinflussen. Die höchste Schlupfwahrscheinlichkeit wird bei diesen günstigen Temperatur- und Salzgehaltsbedingungen erreicht, wenn die Mehrheit der Zysten hydratisiert wird und während der Hydratationsphase in kürzerer Zeit wieder eine höhere Stoffwechselrate erreicht, während der Differenzierungsphase weniger Energie verbraucht und diese schneller abschließt. In diesem optimalen Zustand verbringen Zysten eine längere Zeit im Schlüpfstadium, was zu einer größeren Anzahl schlüpfender Zysten und einem höheren Sauerstoffverbrauch führt.

In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass die Messung der Stoffwechselraten in Echtzeit und der entsprechenden morphologischen Veränderungen ein tiefgreifendes, mechanistisches Verständnis darüber ermöglichen kann, wie abiotische Parameter den Schlüpfprozess von Artemia beeinflussen. Wir konzentrierten uns auf Temperatur und Salzgehalt (zwei wichtige Umweltparameter, die auch anfällig für den Klimawandel sind) und maßen das Atmungsverhalten, den Fortschritt des Schlüpfens sowie die daraus resultierende Anzahl geschlüpfter Artemia bei unterschiedlichen Temperatur- und Salzgehaltsniveaus über einen vorgegebenen Zeitraum hinweg. Obwohl Artemia-Lebensräume durch Hypersalinität eingeschränkt sind, kann diese Studie Aufschluss über die wahrscheinlichen Auswirkungen von Temperatur und Salzgehalt auf den Schlüpfprozess anderer weiter verbreiteter Krebstierarten geben.

In Übereinstimmung mit früheren Studien wurde beobachtet, dass extreme Salzgehalte (niedrig oder hoch) und niedrige Temperaturen das Schlüpfen von Artemia hemmen, was das Vorhandensein optimaler Brutbedingungen bestätigt26,27,28,29,30,31. Während sich diese früheren Studien jedoch hauptsächlich auf Endpunktmessungen der Schlupfrate konzentrierten, haben wir hier Beziehungen zwischen der Schlupfrate und dem Fortschritt des Schlupf- und Atmungsverhaltens während des Prozesses festgestellt. Wir zeigen beispielsweise, dass ein Schlüsselfaktor, der die Schlüpfbarkeit von Artemia in einem Zeitraum von 24 Stunden beeinflusst, die Dauer der Differenzierungsphase ist, die sich als umgekehrt proportional zur Schlupfrate erweist. Insgesamt nimmt die Differenzierungsdauer (blaue Balken, Abb. 3) mit zunehmendem Salzgehalt und erhöhter Temperatur ab, außer bei sehr hohen Salzgehalten. Basierend auf einem Verständnis des Differenzierungsstadiums ist es möglich, dass dieser Zusammenhang mit einer erhöhten Glycerinproduktion zusammenhängt, die den Schalenbruch beschleunigt, der den Beginn des Auflaufens kennzeichnet. Obwohl die Validierung dieser Hypothese zukünftiger Arbeit überlassen bleibt, veranschaulichen wir, dass die aktuellen Experimente wichtige Schwerpunktbereiche für das Verständnis der komplexen Beziehung zwischen Umwelt und Wassertiergesundheit hervorheben. Ein entscheidender Zusammenhang zwischen Temperatur, Salzgehalt und der Reaktivierung des ruhenden Zystenstoffwechsels wurde auch durch den Vergleich des Hydratationsverlaufs mit dem Van't-Hoff-Gesetz deutlich gezeigt.

Der vorliegende experimentelle Ansatz wurde durch die Entwicklung einer neuartigen mikrofluidischen Plattform mit integriertem Sauerstoffsensor ermöglicht, bei der physikalische Veränderungen in den Artemia-Zysten auch mithilfe eines optischen Mikroskops erfasst werden konnten. Eine präzise Umgebungskontrolle wird mithilfe einer Heizung mit Rückkopplungsschleife und einem automatischen Zählchip erreicht, um Fehler zu vermeiden, die mit dem Fehlen einer strengen Umgebungskontrolle und manuellen Berechnung der Schlupffähigkeit verbunden sind. Der weit verbreitete Einsatz automatisierter Systeme mit präziser Umgebungskontrolle bietet nicht nur einen tiefergehenden Einblick in biologische Prozesse, sondern standardisiert auch Experimente, was zu aussagekräftigeren Quervergleichen in der Literatur führt. Daher wird erwartet, dass der vorliegende Ansatz eine breitere Anwendbarkeit bei der Erforschung von Zooplankton und Fischlarven hat, auch unter verschiedenen abiotischen/biotischen Umweltbedingungen und Wasserkontaminanten.

Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Hoegh-Guldberg, O. & Bruno, JF Die Auswirkungen des Klimawandels auf die Meeresökosysteme der Welt. Wissenschaft 328, 1523–1528 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Shen, M. et al. (Mikro-)Plastikkrise: Nicht zu vernachlässigender Beitrag zu globalen Treibhausgasemissionen und Klimawandel. J. Sauber. Prod. 254, 120138 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Hegerl, GC & Cubasch, U. Treibhausgasinduzierter Klimawandel. Umgebung. Wissenschaft. Umweltverschmutzung. Res. 3, 99–102 (1996).

Artikel CAS Google Scholar

Lyman, JM et al. Starke Erwärmung des globalen oberen Ozeans. Natur 465, 334–337 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Nitzbon, J., Krinner, G., von Deimling, TS, Werner, M. & Langer, M. Quantifizierung des Permafrost-Kühlkörpers im Klimasystem der Erde. Vorabdruck unter https://essopenarchive.org/doi/full/10.1002/essoar.10511600.1 (2022).

Cazenave, A. & Llovel, W. Zeitgenössischer Anstieg des Meeresspiegels. Ann. Rev. Mar. Sci. 2, 145–173 (2010).

Artikel PubMed Google Scholar

Wadhams, P. & Munk, W. Meereserfrischung, Meeresspiegelanstieg, Meereisschmelze. Geophys. Res. Lette. 31, L11311 (2004).

Artikel ADS Google Scholar

Douville, H. et al. Veränderungen im Wasserkreislauf. 1055–1210 (Cambridge University Press, 2021).

Haddeland, I. et al. Globale Wasserressourcen, die durch menschliche Eingriffe und den Klimawandel beeinträchtigt werden. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. 111, 3251–3256 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Paget, CM, Schwartz, J.-M. & Delneri, D. Umweltsystembiologie des kältetoleranten Phänotyps bei Saccharomyces-Arten, die an das Wachstum bei unterschiedlichen Temperaturen angepasst sind. Mol. Ökologisch. 23, 5241–5257 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Singh, SK, Das, D. & Rhen, T. Phänotyp der embryonalen Temperaturprogramme bei Reptilien. Vorderseite. Physiol. 11, 35 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Putnam, HM, Davidson, JM & Gates, RD Die Versauerung der Ozeane beeinflusst die Methylierung der Wirts-DNA und die phänotypische Plastizität in umweltempfindlichen Korallen. Entwicklung Appl. 9, 1165–1178 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, HJ, Koedrith, P. & Seo, YR Ökotoxikogenomische Ansätze zum Verständnis molekularer Mechanismen der chemischen Umwelttoxizität unter Verwendung von wirbellosen Wassertieren und Daphnien-Modellorganismen. Int. J. Mol. Wissenschaft. 16, 12261–12287 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Camargo, WN et al. Bestimmung biologischer und physikalisch-chemischer Parameter von Artemia franciscana-Stämmen in hypersalinen Umgebungen für die Aquakultur in der kolumbianischen Karibik. Salzsystem. 1, 1–11 (2005).

Artikel Google Scholar

Rocha, GS, Katan, T., Parrish, CC & Gamperl, AK Auswirkungen von wildem Zooplankton im Vergleich zu angereicherten Rädertierchen und Artemia auf die biochemische Zusammensetzung der Larven des Atlantischen Kabeljaus (Gadus morhua). Aquakultur 479, 100–113 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

McCourt, RP Brine Shrimp Artenia Bibliography (Artennia Reference Centre, 1985).

Google Scholar

Browne, R. & Wanigasekera, G. Kombinierte Auswirkungen von Salzgehalt und Temperatur auf das Überleben und die Fortpflanzung von fünf Artemia-Arten. J. Exp. Mar. Biol. Ökologisch. 244, 29–44 (2000).

Artikel Google Scholar

Nunes, BS, Carvalho, FD, Guilhermino, LM & Van Stappen, G. Verwendung der Gattung Artemia in Ökotoxizitätstests. Umgebung. Umweltverschmutzung. 144, 453–462 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gajardo, GM & Beardmore, JA Die Salzgarnelen Artemia: An kritische Lebensbedingungen angepasst. Vorderseite. Physiol. 3, 185 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Vikas, PA et al. Einfluss von Salzstress auf biochemische Bestandteile und die ArHsp22-Genexpression in Artemia franciscana. Indischer J. Fisch. 63, 150–156 (2016).

Google Scholar

Wang, Z., Asem, A., Okazaki, RK & Sun, S. Das kritische Stadium für die Auslösung von Oviparität und embryonaler Diapause bei parthenogenetischer Artämie (Crustacea: Anostraca): Eine experimentelle Studie. J. Oceanol. Limnol. 37, 1669–1677 (2019).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Clegg, JS Freies Glycerin in ruhenden Zysten der Artemia salina und sein Verschwinden während der Entwicklung. Biol. Stier. 123, 295–301 (1962).

Artikel CAS Google Scholar

Liu, Y.-L., Zhao, Y., Dai, Z.-M., Chen, H.-M. & Yang, W.-J. Bildung der Diapausenzystenhülle bei Salzgarnelen, Artemia parthenogenetica, und ihre Widerstandsrolle bei Umweltstress. J. Biol. Chem. 284, 16931–16938 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lenz, PH & Browne, RA Ökologie der Artemia. in Artemia Biology 237–254 (CRC Press, 2018).

Arun, V. et al. Multi-Response-Optimierung des Artemia-Schlüpfprozesses mithilfe einer auf dem Split-Split-Plot-Design basierenden Response-Surface-Methodik. Wissenschaft. Rep. 7, 1–12 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Kumar, GR & Babu, D. Einfluss von Licht, Temperatur und Salzgehalt auf das Wachstum von Artemia. Int. J. Eng. Wissenschaft. Erfindung 4, 07–14 (2015).

Google Scholar

Hasan, MK & Rabbane, MG Auswirkungen von Temperatur und Salzgehalt auf die Entkapselung von Artemia-Zysten. Bangladesch J. Zool. 46, 197–204 (2018).

Artikel Google Scholar

Bahr, A., Isroni, W. & Maulida, N. Schlüpf- und Erntetechniken für Artemia-Zysten mit unterschiedlichen Auswirkungen des Salzgehalts im Distrikt Situbondo, Ost-Java Bd. 718, 012037 (IOP Publishing, 2021).

Google Scholar

Wasonga, A. & Olendi, R. Einfluss unterschiedlicher Salzgehalte auf die Schlüpfbarkeit und das Überleben von Salzgarnelen, Artemia salina (Linnaeus, 1758) aus Malindi, Kenia. Afr. J. Bildungswissenschaft. Technol. 3, 1–5 (2018).

Google Scholar

Sharahi, AR & Zarei, S. Gegenseitige Wirkung von Licht und Trübung auf das Schlüpfen von Artemia franciscana-Zysten. Int. J. Fauna Biol. Zucht. 3, 03–06 (2016).

Google Scholar

Ahmed, SU, Rahman, MA, Islam, MN & Kamal, M. Auswirkung der Entkapselung auf die Lebensfähigkeit und die Schlupfleistung von Artemia-Zysten bei unterschiedlichen Salzgehalten. Bangladesh J. Fisheries Res. 1, 67–74 (1997).

Google Scholar

Asil, S., Esmaeili Fereidouni, A., Ouraji, H. & Jani-Khalili, K. Der Einfluss von Licht (Intensität und Dauer) auf die Zystenschlüpfparameter und das Nauplienwachstum von Artemia urmiana (Günther 1890). (2023).

Emerson, DN Oberflächenatmung während des Schlüpfens eingekapselter Embryonen der Artemia salina. Biol. Stier. 132, 156–160 (1967).

Artikel PubMed Google Scholar

Emerson, D. Der Stoffwechsel schlüpfender Embryonen der Artemia salina. Fortfahren. South Dakota Acad. Wissenschaft. 42, 131–135 (1963).

Drinkwater, LE & Crowe, JH Hydratationszustand, Stoffwechsel und Schlüpfen von Mono Lake Artemia-Zysten. Biol. Stier. 180, 432–439 (1991).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Killen, SS et al. Richtlinien für Berichtsmethoden zur Schätzung der Stoffwechselraten durch aquatische intermittierende Flussrespirometrie. J. Exp. Biol. 224, 242522 (2021).

Artikel Google Scholar

Clegg, JS, Drinkwater, LE & Sorgeloos, P. Der Stoffwechselstatus von Diapause-Embryonen von Artemia franciscana (SFB). Physiol. Zool. 69, 49–66 (1996).

Artikel Google Scholar

Nielsen, P., Mortensen, J., Vismann, B. & Hansen, BW Physiologische Toleranz mariner Calanoid-Copepodeneier gegenüber Sulfid. März Ecol. Prog. Ser. 328, 171–182 (2006).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Hansen, BW & Drillet, G. Vergleichende Sauerstoffverbrauchsraten von subitanen und verzögert schlüpfenden Eiern des Calanoid-Copepoden Acartia tonsa (Dana). J. Exp. Mar. Biol. Ökologisch. 442, 66–69 (2013).

Artikel Google Scholar

Andrew, TE & Herzig, A. Die Atmungsrate der ruhenden Eier von Leptodora kindti (Focke 1844) und Bythotrephes longimanus Leydig 1860 (Crustacea, Cladocera) bei Umgebungstemperaturen. Oecologia 64, 241–244 (1984).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Qiu, W. & Nagl, S. Automatisierter miniaturisierter digitaler mikrofluidischer antimikrobieller Empfindlichkeitstest unter Verwendung eines in einen Chip integrierten optischen Sauerstoffsensors. ACS Sensors 6, 1147–1156 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Curto, VF et al. Konzept und Entwicklung einer autonomen tragbaren mikrofluidischen Plattform zur pH-Schweißanalyse in Echtzeit. Sens. Aktoren B Chem. 175, 263–270 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Lasave, LC, Borisov, SM, Ehgartner, J. & Mayr, T. Schnelle und einfache Integration optischer Sauerstoffsensoren in mikrofluidische Geräte auf Glasbasis. RSC Adv. 5, 70808–70816 (2015).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Hung, PJ et al. Ein neuartiges mikrofluidisches Design mit hohem Aspektverhältnis zur Bereitstellung einer stabilen und gleichmäßigen Mikroumgebung für das Zellwachstum in einem Säugetierzellkultur-Array mit hohem Durchsatz. Lab Chip 5, 44–48 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, J. et al. Ein mikrofluidisches Design zur Bereitstellung einer stabilen und einheitlichen In-vitro-Mikroumgebung für die Zellkultur, inspiriert von der Redundanzcharakteristik von Blattareolen. Lab Chip 17, 3921–3933 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Azuaje-Hualde, E. et al. Mikrotechnologien zur Kontrolle und Überwachung der Zellmikroumgebung. Mikromaschinen 8, 166 (2017).

Artikel PubMed Central Google Scholar

Asif, A., Kim, KH, Jabbar, F., Kim, S. & Choi, KH Echtzeitsensoren für die Live-Überwachung von Krankheiten und Arzneimittelanalysen im Mikrofluidikmodell des proximalen Tubulus. Microfluid Nanofluid 24, 43 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T. & Gijs, MA Mikrofluidisches System für die Kultur von Caenorhabditis elegans und Messungen der Sauerstoffverbrauchsrate. Lab Chip 20, 126–135 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rahman, M. et al. NemaLife-Chip: Ein auf Mikropillen basierendes mikrofluidisches Kulturgerät, das für Alterungsstudien an kriechenden C. elegans optimiert ist. Wissenschaft. Rep. 10, 1–19 (2020).

Artikel ADS Google Scholar

Gokce, SK et al. Ein Mikrofluidik-Chip mit mehreren Fallen, der Längsschnittstudien zur Nervenregeneration bei Caenorhabditis elegans ermöglicht. Wissenschaft. Rep. 7, 1–12 (2017).

Artikel MathSciNet Google Scholar

Rohde, CB, Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M. & Yanik, MF Mikrofluidiksystem für On-Chip-Hochdurchsatzsortierung und -screening ganzer Tiere mit subzellulärer Auflösung. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. 104, 13891–13895 (2007).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mondal, S. et al. Groß angelegte Mikrofluidik, die ein hochauflösendes Hochdurchsatz-Screening des Polyglutamin-Aggregationsmodells von Caenorhabditis elegans ermöglicht. Nat. Komm. 7, 1–11 (2016).

Artikel MathSciNet Google Scholar

Akagi, J. et al. Fisch auf Chips: Mikrofluidisches Array lebender Embryonen für beschleunigte In-vivo-Angiogenese-Assays. Sens. Aktoren B Chem. 189, 11–20 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Akagi, J. et al. Fisch auf Chips: Automatisierte mikrofluidische Arrays lebender Embryonen. Procedia Eng. 47, 84–87 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G.-J. & Chen, Z. Fish-on-a-chip: Mikrofluidik für die Zebrafischforschung. Lab Chip 16, 1106–1125 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Grover, WH, Ivester, RH, Jensen, EC & Mathies, RA Entwicklung und Multiplexsteuerung von verriegelnden Pneumatikventilen unter Verwendung mikrofluidischer logischer Strukturen. Lab Chip 6, 623–631 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, Y., Tseng, T.-M. & Schlichtmann, U. Tragbares automatisiertes All-in-One-Mikrofluidiksystem (PAMICON) mit 3D-gedrucktem Chip unter Verwendung eines neuartigen Flüssigkeitskontrollmechanismus. Wissenschaft. Rep. 11, 1–10 (2021).

Google Scholar

Li, Z., Dey, P. & Kim, S.-J. Mikrofluidischer Einzelventiloszillator für die Blutplasmafiltration. Sens. Aktoren B Chem. 296, 126692 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Dey, P., Li, Z. & Kim, S.-J. Pulsierender mikrofluidischer Blutplasmafiltrationschip. Frühlings- und Herbstkonferenz der Korean Society of Mechanical Engineers 1458–1460 (2019).

Rao, H.-X., Liu, F.-N. & Zhang, Z.-Y. Vorbereitung und Sauerstoff-/Stickstoffpermeabilität der vernetzten PDMS-Membran und der PDMS/Tetraethoxysilikon-Hybridmembran. J. Mitglied Wissenschaft. 303, 132–139 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Shiku, H. et al. Sauerstoffdurchlässigkeit von oberflächenmodifiziertem Poly(dimethylsiloxan), charakterisiert durch elektrochemische Rastermikroskopie. Chem. Lette. 35, 234–235 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Clegg, JS & Trotman, CN Physiologische und biochemische Aspekte der Artemia-Ökologie. in Artemia: Basic and Applied Biology 129–170 (Springer, 2002).

Clegg, JS Die Kontrolle der Entstehung und des Stoffwechsels durch externen osmotischen Druck und die Rolle von freiem Glycerin bei der Entwicklung von Zysten von Artemia salina. J. Exp. Biol. 41, 879–892 (1964).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shin, S. & Kim, AS Temperatureinfluss auf die Vorwärtsosmose. in osmotisch angetriebenen Membranprozessen – Ansatz, Entwicklung und aktueller Stand; InTech: London, Großbritannien 87–110 (2018).

Romano, G., Ianora, A. & Miralto, A. Atmungsphysiologie in Sommer-Diapause-Embryonen des neustonischen Ruderfußkrebses Anomalocera patersoni. Beschädigen. Biol. 127, 229–234 (1996).

Artikel Google Scholar

Romano, G., Ianora, A., Santella, L. & Miralto, A. Atmungsstoffwechsel während der embryonalen Subitan- und Diapausenentwicklung in Pontella mediterranea (Crustacea, Copepoda). J. Comp. Physiol. B 166, 157–163.

Artikel CAS Google Scholar

Nielsen, P., Larsen, LH, Ramløv, H. & Hansen, BW Atmungsraten von subitanen Eiern eines marinen Calanoid-Copepoden: Überwacht durch Nanorespirometrie. J. Comp. Physiol. B 177, 287–296 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Garcı́a-Guerrero, M., Villarreal, H. & Racotta, IS Einfluss der Temperatur auf den Lipid-, Protein- und Kohlenhydratspiegel während der Entwicklung von der Eiextrusion bis zum Jugendstadium von Cherax quadricarinatus (Decapoda: Parastacidae). Vergleichende Biochemie. Physiol. Teil A Mol. Integr. Physiol. 135, 147–154 (2003).

Naylor, JK, Taylor, EW & Bennett, DB Sauerstoffaufnahme sich entwickelnder Eier von Cancer pagurus (Crustacea: Decapoda: Cancridae) und daraus resultierendes Verhalten der eiertragenden Weibchen. J. Mar. Biol. Assoc. VEREINIGTES KÖNIGREICH. 79, 305–315 (1999).

Artikel Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wird von der National Science Foundation unterstützt (Preisnummer: 2038484, Jahr: 2020). Die Diagramme wurden mit OriginPro 2022b (https://www.originlab.com/) erstellt. Schaltpläne wurden mit Biorender (https://biorender.com/) erstellt.

Fakultät für Maschinenbau und Werkstofftechnik, Florida International University, 10555 W Flagler St, Miami, FL, 33174, USA

Preyojon Dey & Alicia Boymelgreen

Abteilung für Fischerei, Tier- und Veterinärwissenschaften, University of Rhode Island, Kingston, RI, 02881, USA

Terence M. Bradley

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

PD: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, formale Analyse, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf. TB: Konzeptualisierung, Betreuung, formale Analyse, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Finanzierungseinwerbung. AB: Konzeptualisierung, Supervision, formale Analyse, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Finanzierungsbeschaffung.

Korrespondenz mit Alicia Boymelgreen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Dey, P., Bradley, TM & Boymelgreen, A. Der Einfluss ausgewählter abiotischer Faktoren auf den Schlüpfprozess von Artemia durch Echtzeitbeobachtung von Sauerstoffveränderungen in einer mikrofluidischen Plattform. Sci Rep 13, 6370 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32873-1

Zitat herunterladen

Eingegangen: 24. Januar 2023

Angenommen: 04. April 2023

Veröffentlicht: 19. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32873-1

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.