In-vitro-cholesterinsenkende Aktivität von Ganoderma australe-Myzelien basierend auf Massenspektrometrie, Synchrotron Fourier

Apr 23, 2024

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13619 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Myzelien wurden aus einem thailändischen Wildpilz kultiviert, der anhand der Polymerasekettenreaktion (PCR) und morphologischen Analysen als Ganoderma australe identifiziert wurde. Die Myzelextrakte wurden mithilfe einer Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Methode (LC‒MS/MS) auf ihre Wirkstoffe untersucht. Dies ergab das Vorhandensein von Lovastatin und vorläufigen Verbindungen, einschließlich p-Cumarsäure, Nikotinamid, Gamma-Aminobuttersäure, Cholin, Nukleosiden, Aminosäuren und Sacchariden. Die Extrakte hatten konzentrationsabhängig eine hemmende Wirkung auf die Aktivität der HMG-CoA-Reduktase. Bei 2,5 mg/ml beeinträchtigten die G. australe-Extrakte die Lebensfähigkeit von HepG2-Sphäroiden nicht, ihre biochemische Zusammensetzung wurde jedoch verändert, wie durch Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) bestimmt. Das Lipidprofil der mit dem Myzelextrakt behandelten Sphäroide unterschied sich von dem der Kontrolle und der Behandlung mit 5 µM Lovastatin, was mit der Produktion von Cholesterin durch die Sphäroide korrespondierte. Das Myzel von G. australe erhöhte den Prozentsatz der Produktion von High-Density-Lipoprotein (HDL) auf 71,35 ± 2,74 %, verglichen mit den Kontroll- und Lovastatin-behandelten Sphäroiden (33,26 ± 3,15 % bzw. 32,13 ± 3,24 %). Diese Studie zeigte die überlegene Wirkung natürlicher Wirkstoffmischungen gegenüber reinem Lovastatin und die potenzielle Verwendung von Thailands wildem G. australe als funktionelles Lebensmittel zur Vorbeugung oder Linderung von Hypercholesterinämie.

Hypercholesterinämie ist einer der Hauptrisikofaktoren für Herz-Kreislauf-Erkrankungen1 und war 2019 der achtwichtigste Risikofaktor für die weltweite Mortalität2. Statine sind eine Gruppe von Arzneimitteln, die zur Behandlung von hohem Cholesterinspiegel und Herz-Kreislauf-Erkrankungen verschrieben werden3; Aufgrund ihrer Nebenwirkungen auf die Muskulatur wird ihr langfristiger Verzehr jedoch nicht empfohlen4. Dies macht eine alternative Behandlung mit Nutrazeutika zu einer vielversprechenden Option5, einschließlich der Verwendung von Pilzen als funktionelle Lebensmittel6, aufgrund des Vorhandenseins bioaktiver Verbindungen. Darüber hinaus gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass Speisepilze die Lipidprofile verbessern und das Risiko von Herz-Kreislauf-Erkrankungen verringern7.

Ganoderma ist eine Pilzgattung aus der Familie der Ganodermataceae und einer der wichtigsten Heilpilze für den Menschen weltweit8. Die Gattung Garnoderma enthält verschiedene Arten, die für medizinische Behandlungen eingesetzt werden, darunter zur Behandlung von Krebs9, Diabetes10, Immunmodulation11 sowie Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen12. Zu den bioaktiven Verbindungen, die mit solchen medizinischen Funktionen verbunden sind, gehören Triterpenoide, Polysaccharide, Sterol und Alkaloide13. Während die Artenvielfalt von Pilzen in Thailand untersucht wurde14, wurde noch nicht über die Identifizierung eines in Thailand natürlich gezüchteten Pilzes mit einer potenziellen Funktion bei der Behandlung von Hypercholesterinämie berichtet.

In diesem Zusammenhang wurde ein Wildpilz mit der Morphologie von Ganoderma spp. wurde gesammelt, hinsichtlich seines Myzels kultiviert und auf Artenebene identifiziert. Lovastatin und biologische Bestandteile der mit Ethanol extrahierten Myzelien wurden mittels hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) identifiziert. Sein potenzieller Einsatz zur Behandlung von Hypercholesterinämie wurde anhand der hemmenden Aktivität der HMG-CoA-Reduktase untersucht. Darüber hinaus wurden die Zytotoxizität, charakteristische funktionelle Gruppen (mittels FTIR) und die Cholesterinproduktion (basierend auf 3-D-Leberzellen) als Reaktion auf den Ganoderma australe-Myzelextrakt aufgeklärt.

Wildpilze wurden in der Trat Agroforestry Research and Training Station, Provinz Trat, Thailand (12° 23′ 34″ N, 102° 40′ 32″ E) gesammelt. Die Sammlung des Pilzes und die Durchführung der damit verbundenen experimentellen Forschung entsprachen den nationalen Richtlinien Thailands. Fruchtkörper wurden vorsichtig aus dem Substrat entnommen. Ihre morphologischen Eigenschaften wurden nach Luangharn et al.15 identifiziert und beschrieben. Ein Belegexemplar dieses Materials wurde zur öffentlichen Nutzung im Bangkok Forest Herbarium (BKF), Thailand, als T. Kaewgrajang & S. Mangkalad G1-09102018 (BKF, Trocken- und Spirituosensammlungen) hinterlegt.

Um eine Kultur zu erhalten, wurde das innere, nicht kontaminierte Gewebe der Pilzprobe auf Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) isoliert. Anschließend wurden Myzelien, die aus den übertragenen Pilzstücken ohne Kontamination wuchsen, auf neuem Agarmedium subkultiviert. Rein kultivierte Myzelien wurden auf mit Zellophan bedecktem PDA 7–10 Tage lang bei Raumtemperatur (25–33 °C) kultiviert, bevor die Pilzart untersucht und die Extraktion bioaktiver Komponenten unter Verwendung von etwa 200 Platten pro Charge durchgeführt wurde.

Die genetische Identität von Ganoderma australe wurde mithilfe der internen transkribierten Spacer-Region (ITS) bestätigt, die 18S, ITS1, 5.8S, ITS2 und einen Teil der 28S-rDNA umfasst. Die ITS-Region wurde unter Verwendung der Primer ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) und ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) und zuvor beschriebener PCR-Bedingungen amplifiziert16. Anschließend wurden die Nukleotidsequenzen mithilfe des MiSeq-Systems (Illumina) mit NGS-basierter Barcode-Taq-Sequenzierung (BTSeq™) analysiert. Die Artenidentität wurde auf der Grundlage einer Datenbanksuche mit dem BLASTN-Programm17 in der NCBI-Datenbank durchgeführt und die besten Übereinstimmungssequenzen wurden aus der Datenbank zur phylogenetischen Analyse zusammen mit Sequenzen aus der aktuellen Studie abgerufen. Die in der aktuellen Studie ermittelte Sequenz wurde in der NCBI-Datenbank unter der Zugangsnummer OP727592 hinterlegt.

Die Myzelien wurden von den Kulturplatten entfernt, 5 Stunden bei 50 °C getrocknet und mit Mörser und Pistill zermahlen. Einhundert Milligramm getrocknetes Myzel wurden mit 1 ml 95 %igem Ethanol gemischt und 24 Stunden lang bei 37 °C mit 180 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Die extrahierte Verbindung wurde nach 15-minütiger Kaltzentrifugation bei 8000 U/min gesammelt und durch Whatman-Papier Nr. 1 filtriert. Der Überstand wurde in einen Heißluftofen bei 60 °C gestellt, um jegliches Ethanol zu entfernen. Die getrockneten Extrakte wurden gewogen und dann zur weiteren Analyse in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst.

Der getrocknete Extrakt wurde in DMSO rekonstituiert, mit Ethanol verdünnt und vor der Analyse mit einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Analysator (HPLC) (Shimadzu und Hitachi) in der Umkehrphase mit einer C18-Säule (TOSOH) filtriert. Der Trennungsprozess wurde unter Verwendung von Puffer A (0,1 % Trifluoressigsäure (TFA)) und Puffer B (100 % Acetonitril und 0,1 % TFA) als mobile Phase durchgeführt. Bei einer konstanten Flussrate von 1 ml/min wurde Puffer B auf erhöht Der Wert stieg innerhalb von 4 Minuten auf 40 % und stieg dann während der nächsten 8 Minuten langsam auf 44 %, bevor er 2 Minuten lang schnell auf 64 % anstieg. Während der erwarteten Retentionszeit von Lovastatin stieg er 8 Minuten lang langsam auf 68 % an. Der Prozess wurde durch Erhöhen abgeschlossen Puffer B auf 100 % für 2 Minuten und Halten für 4 Minuten, bevor die Säule mit 100 % Puffer A für 5 Minuten erneut konditioniert wird. Das Profil wurde mit einem UV-Analysator bei λ = 240 nm bestimmt. Die Daten wurden mit der Primaide System Manager-Software erfasst. Die chromatographische Analyse wurde für den Lovastatin-Standard in verschiedenen Konzentrationen (Bereich 0,625–20 µM) und die Myzelextrakte mit 10 µg/ml aus drei verschiedenen kultivierten und mit Lovastatin versetzten Extrakten mit Endkonzentrationen von 20 µM Lovastatin und 8 µg/ml durchgeführt Extrakt. Die Menge an Lovastatin-Standard wurde aus der Kalibrierungskurve der Peakfläche bei einer Retentionszeit von 19,0 Minuten berechnet. Die Nachweisgrenze (LOD) wurde aus der Standardkurve unter Verwendung der Formel LOD = 3,3 × (σ/s) berechnet, wobei σ die SD des Achsenabschnitts und s die Steigung der Kurve ist.

HPLC-Fraktionen mit der gleichen Retentionszeit wie Lovastatin wurden aus 3,2 mg Rohextrakt gesammelt, einer Massenspektrometrieanalyse (micrOTOF-Q III) mit Elektrospray-Ionisation unterzogen und im positiven Polaritätsmodus unter den folgenden Bedingungen betrieben: m/z-Bereich 50–600 ; Kapillarspannung, 4500 V; Endplatten-Offsetspannung, − 500 V; Kollisionszelle RF, 100,0 Vpp; Zerstäuber, 0,3 bar; Heiztemperatur 180 °C; und Trockengasdurchflussrate: 4,0 l/min. Das Vorhandensein von Lovastatin in der Fraktion wurde außerdem mithilfe von MS/MS (SCIEX, X500R QTOF) im MRM-Modus (Multiple Reaction Monitoring) zur Aufnahme von Massenspektren bestätigt. Der angestrebte Vorläuferionenwert von Lovastatin betrug 405,26 Da und wurde unter Verwendung eines Ionenquellengases (20 psi), eines Kollisionsgases (7 psi) und eines Vorhanggases (25 psi) ionisiert. Die Flugzeit der Ionen wurde im positiven Polaritätsmodus unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: m/z-Scanbereich 100–450; Sprühspannung, 5500 V; Declustering-Potenzial, 80 V; und Akkumulationszeit 0,1 s. Die Isotopen- und Massenspektralmuster wurden mit Blindlösungsmittel und dem Lovastatin-Standard verglichen.

Die Biokomponenten im Ethanolextrakt von Myzelien wurden mittels LC-MS/MS bei NSTDA, Thailand, gemäß dem berichteten Protokoll analysiert18. Getrocknete Extrakte wurden in Methanol rekonstituiert und durch eine 0,22 µm PTFE-Membran filtriert, bevor die chromatographische Trennung durchgeführt wurde. Jede Probe (2 µl) wurde einer UHPLC unterzogen, die mit einer Hypersil GOLD™ VANQUISH™-Säule (100 × 2,1 mm, Partikelgröße: 1,9 µm mit einer Flussrate von 0,4 ml/min) ausgestattet war. Die Analyse wurde mit 5 % Acetonitril (ACN): 95 % H2O für 4 Minuten begonnen, gefolgt von einer Erhöhung auf 90 % ACN: 10 % H2O für 10 Minuten, die 4 Minuten lang beibehalten wurde. Anschließend wurde die mobile Phase 0,5 Minuten lang auf 5 % ACN: 95 % H2O umgestellt und 25 Minuten lang beibehalten.

Die Massenspektralanalyse wurde mit Orbitrap im Full-Scan-Modus durchgeführt. Der Massenbereich betrug 100–1500 m/z mit einer Auflösung von 120.000. Für den dd-MS2-Modus betrug die Auflösung 30.000 mit Kollisionsenergien (NCE Stepped) von 10, 30 und 50 sowohl für den positiven als auch für den negativen Ionisationsmodus.

Die Daten wurden mit der Software Compound Discoverer 3.1.0.305 mit einem ungezielten Metabolomics-Workflow analysiert. Die Primärspektren wurden mit den Datenbanken ChemSpider, Predicted Composition, Metabolika Pathway, mzCloud und mzVault abgeglichen. Verbindungen, die Übereinstimmungen mit 1–2 Datenbanken zeigten, wurden vorläufig identifiziert. Eine weitere Bestätigung wurde durch einen vollständigen Vergleich ihrer sekundären Massenspektren mit mzCloud, mzVault und einer hauseigenen Bibliothek (mzVault) erhalten, die Fragmentierungsmuster zuvor analysierter Standards enthält. Vorläufige bioaktive Verbindungen wurden durch den Vergleich von LC-MS- und MS/MS-Spektren mit mindestens drei der oben genannten Datenbanken identifiziert, wobei auch Literaturnachweise für ihr Vorkommen speziell in Pilzen berücksichtigt wurden.

Die Hemmung der De-novo-Cholesterinsynthese wurde mit einem HMG-CoA-Reduktase-Assay-Kit (Sigma-Aldrich) bestimmt. Verschiedene Konzentrationen von Myzelextrakt im Bereich von 0,0125–2,5 mg/ml wurden mit der Reaktionsmischung gemischt, die Puffer, NADPH, HMG-CoA und HMG-CoA-Reduktase enthielt.

Als Positivkontrolle wurde das im Kit enthaltene Pravastatin und als Negativkontrolle (NC) DMSO verwendet. Die Aktivität wurde anhand der NADPH-Reduktion überwacht, indem die Absorption bei 340 nm und 37 °C alle 10 s für 10 Minuten gemessen wurde. Die Aktivität jeder Reaktion wurde unter Verwendung desselben Zeitbereichs während der Anfangsgeschwindigkeit des gezeigten Enzyms berechnet (Aktivität = ∆A340/∆T). Anschließend wurde die Hemmung (%) der HMG-CoA-Reduktase mithilfe der folgenden Formel berechnet:

Die HepG2-Zelllinie wurde von ATCC erworben und in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Antibiotikum Penicillin-Streptomycin, kultiviert. Die Zellen wurden in einem mit 5 % CO2 befeuchteten Inkubator bei 37 °C gehalten. Bei der Subkultivierung wurden die Zellen durch Trypsinierung abgelöst. Die gut gewachsenen Zellen wurden geerntet und mit einer Dichte von 5000 Zellen pro Vertiefung in eine Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät und 48 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurde die Lebensfähigkeit von 2-D-HepG2-Zellen anhand des MTT-Assays bestimmt. Für die 3D-Sphäroiderzeugung wurden HepG2-Zellen mit 20.000 Zellen pro Vertiefung auf einer Platte mit rundem Boden und geringer Anhaftung gezüchtet. HepG2-Sphäroide bildeten sich und veränderten ihre Morphologie am 5. Tag der Kultur. Nachdem sich die Sphäroide gebildet hatten, wurden sie 48 Stunden lang mit Lovastatin und dem Myzelextrakt in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt. Anschließend wurde die Lebensfähigkeit der Sphäroide mit dem Presto-Blau-Assay untersucht. Die Auswirkungen der Behandlung mit Myzelextrakt auf das biologische Profil und die Cholesterinproduktion der Sphäroide wurden nach zweitägiger Inkubation untersucht.

HepG2-Sphäroide, kultiviert in den Kontrollmedien, 2,5 mg/ml G. australe-Myzelextrakten und 5 µM Lovastatin, wurden für die Durchführung einer FTIR-Analyse vorbereitet. Nach 48-stündiger Inkubation wurden alle Proben mit kalter Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und der Überstand durch 5-minütige Zentrifugation bei 230 × g (noch zweimal wiederholt) und anschließend drei weitere Wiederholungen mit entionisiertem Wasser entfernt. Das Sphäroidpellet wurde zu 20 μl entionisiertem Wasser gegeben und vorsichtig mit einer Pipettenspitze resuspendiert, bevor es auf einem BaF2-Fenster mit 22 mm Durchmesser × 1,0 mm Dicke abgeschieden wurde (1–2 μl für jeden Tropfen) und in einem Exsikkator bei Raumtemperatur getrocknet Das mikrospektroskopische Synchrotron-FTIR-Experiment begann am Synchrotron Light Research Institute in Nakhon Ratchasima, Thailand, mit der Einheit Infrarotspektroskopie und Bildgebung BL4.1. Der Prozess wurde unter Verwendung eines Photonenenergiebereichs von 0,01–0,5 eV mit einem 36-fach-Schwarzschild-Objektiv und einem Bruker Vertex 70-Spektrometer in Verbindung mit einem Bruker Hyperion 2000-Mikroskop (Bruker Optics) und einem 100 µm schmalbandigen Quecksilber-Cadmium-Tellurid durchgeführt Detektor gekühlt mit flüssigem Stickstoff. Die FTIR-Spektraldatenerfassung wurde mit der Software OPUS 7.8 (Bruker Optics Ltd.) gesteuert. Die Proben wurden im Infrarot-Spektralbereich von 4000–800 cm−1 im Transmissionsmodus mit einer quadratischen Apertur von 10 × 10 µm analysiert. Das Spektrum jedes ausgewählten Probenbereichs wurde mit einer Auflösung von 6 cm-1 aufgezeichnet und stellte den Durchschnitt von 64 Scans dar. Aus jedem gemessenen Probenbild wurden mit dem OPUS-Programm geeignete FTIR-Spektren mit einer Amid-I-Bandenintensität im Bereich von 0,2–1,2 abs extrahiert und ausgewählt. Um biochemische Veränderungen in den drei Probengruppen zu beobachten, wurde die Software Unscrambler X 10.5 (CAMO Analytics) für die Hauptkomponentenanalyse (PCA) verwendet. Die Datenvorverarbeitung wurde unter Verwendung der Savitzky-Golay-Transformationsableitung (Ableitungsordnung: 2, Polynomordnung: 3, Glättungspunkte: 17, linke Punkte: 8, rechte Punkte: 8) durchgeführt und anschließend für die Spektralbereiche von 3000–2800 cm− konvertiert 1 (Lipide) und 1700–1112 cm−1 (Proteine ​​und Nukleinsäuren), basierend auf erweiterter multiplikativer Signalkorrektur für weitere PCA. Dreifache von einem Drittel der sekundär derivatisierten FTIR-Spektren aus der EMSC-Datenverarbeitung jeder Probengruppe wurden vor der Integration der Peakfläche durch das OPUS-Programm mit Unscrambler X reduziert.

Die Menge an Cholesterin wurde mit einem Cholesterin-Testkit – HDL und LDL/VLDL (Abcam) quantifiziert. Nach 48-stündiger Inkubation mit Lovastatin und dem Myzelextrakt wurden die Sphäroide geerntet und mit kaltem PBS gewaschen. Das Gesamtcholesterin wurde aus den Proben durch Zugabe von 100 µL Cholesterin-Assay-Puffer extrahiert und 10 Minuten lang bei 4 °C und 13.000 × g unter Verwendung einer kalten Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde zur Messung des Gesamtcholesterins gesammelt. Zur weiteren Quantifizierung von High-Density-Lipoprotein (HDL) wurde ein Volumen des Überstands mit 2× Präzipitationspuffer gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. HDL wurde aus dem Überstand nach 10-minütiger Zentrifugation bei 2000 × g bei Raumtemperatur gesammelt; Dieser Schritt wurde wiederholt. Fünfzig Mikroliter jeder Probe, einschließlich Cholesterinstandards, wurden mit 50 µL Cholesterin-Reaktionsmix gemischt, der Puffer, Cholesterinsonden, den relevanten Enzymmix und Cholesterinesterase enthielt. Die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei 37 °C unter Lichtschutz durchgeführt. Die Tandemabsorptionsniveaus von Cholesterin in der Gesamt- und HDL-Fraktion wurden bei 570 nm bestimmt. Die Menge an Cholesterin wurde aus der Steigung der Standardkurve berechnet und der HDL-Anteil am Gesamtcholesterin jeder Probe wurde als Prozentsatz dargestellt. Zur Analyse der Wirkung des 2,5 mg/ml-Extrakts im Vergleich zur Kontrolle und 5 µM Lovastatin wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet.

Für jeden Test wurden drei unabhängige Experimente mit drei verschiedenen Myzelkulturen durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad Prism-Software durchgeführt. Signifikante Unterschiede zwischen den Proben wurden bei p < 0,05 getestet, wie in jedem Ergebnis angegeben.

Das Probenexemplar in dieser Studie befand sich im jungen Stadium (Abb. 1a) und hatte einen Haufen von 2–2,5 cm Länge, 1,5–2,0 cm Breite und 0,5 cm Dicke. Pileus flabella bildete sich zur Unterdrückung. Die Pileusoberfläche war nicht laktiert, am Rand leicht weich und in der Mitte zum Rand hin konzentrisch gefurcht. Die Farbe des Haufens war bräunlich-gelb mit weißem Rand. Der Kontext bestand aus groben, losen Fibrillen. Die Röhre war 0,3–0,5 cm lang und braun. Die Stiele waren sitzend und breit angesetzt. Es gab 3–4 Poren/mm, subkreisförmig bis kreisförmig. Die Porenoberfläche war weiß. Das Hyphensystem war trimitisch; generative Hyphen waren 1,5–2,0 µm breit, dünnwandig, hyalin und verjüngten sich an Ästen mit Klemmverbindungen; Bindehyphen waren 1,5–2,5 µm breit, dickwandig und verzweigt; und Skeletthyphen waren 3,0–4,0 µm breit, dickwandig und nahezu fest. Basidiosporen waren größtenteils ellipsoid, 7,3–10 × 4,5–8,7 µm groß, doppelwandig mit einer bräunlich-orangefarbenen Innenwand, aber einer dunkelbraunen Außenwand, mit einem echinulierten, abgeschnittenen Ende (Abb. 1b).

Morphologie von Ganoderma australe (a) Fruchtkörper. (b) Basidiosporen. (c) Myzel auf PDA-Platten.

Die auf den PDA-Platten gewachsenen Myzelien waren in einem konzentrischen Ring baumwollartig (Abb. 1c). Die PCR-Produkte von 634 bp wurden einer NGS-basierten Barcode-Taq-Sequenzierung unterzogen. Basierend auf dem BLASTN-Programm (NCBI) hatten die Sequenzen der PCR-Fragmente eine Identität von 99,84 % bzw. 99,68 % mit den Sequenzen von Ganoderma australe LC084706.1 bzw. KJ654369. In Übereinstimmung mit der Morphologie der Fruchtkörper identifizierten die Sequenzierungsdaten des Myzels die Pilzprobe eindeutig als G. australe.

Die HPLC-Analyse des Lovastatin-Standards in verschiedenen Konzentrationen ergab eine Retentionszeit von 19,0 Minuten und einen LOD von 2,152 × 10–5 µM (0,009 ng/ml). Mit einer Extraktionsausbeute von 12,57 ± 2,34 % zeigten die drei unabhängig kultivierten Myzelextrakte ähnliche chromatographische Profile. Jede Extraktion zeigte eine große Peakfläche mit Retentionszeiten im Bereich von 4,0–5,5 und 7,0–9,0 min, was im Vergleich zur Blindkontrolle (siehe ergänzende Abb. S1) die Hauptverbindungen zu sein schien (Abb. 2a). Der Lovastatin-Standard wurde den Ethanolextrakten zugesetzt, um das Vorhandensein von Lovastatin zu untersuchen. Durch Vergleich der Retentionszeiten der Extraktpeaks mit dem Standard zeigt Abb. 2b die erhöhte Peakhöhe bei der genauen Retentionszeit von Lovastatin bei 19,0 Minuten (schwarzer Pfeil). Möglicherweise wurde Lovastatin vom Myzel von G. australe produziert. Daher wurde die Fraktion des Rohextrakts bei einer Retentionszeit von 19,0 Minuten zur weiteren Untersuchung mithilfe von Massenspektrometrietechniken gesammelt.

HPLC-Chromatogramme mittels UV-Detektion bei λ 240 nm. (a) Zehn Mikrogramm/ml Ethanolextrakt mit eingefügter Abbildung, die unterschiedliche Konzentrationen des Lovastatin-Standards zeigt. (b) Spike von 20 µM Lovastatin in 8 µg/ml Extrakten. Der schwarze Pfeil zeigt die Persistenz der Retentionszeit von Lovastatin bei 19,0 Minuten mit vergrößerter Peakfläche in dotierten Proben.

ESI-MS im positiven Modus wurde verwendet, um die Spektren der Fraktionen zu untersuchen, die bei derselben Retentionszeit wie der Lovastatin-Standard gesammelt wurden. Die berechneten Muster identifizierten chemische Formeln, darunter: (1) C24H36O5 mit m/z + 1 bei 405,2628 und einem Fehler von − 0,8 mDa, (2) C18H39NO3 mit m/z + 1 bei 318,2991 und einem Fehler von − 1,2 mDa und ( 3) C18H30O2 mit m/z + 1 bei 279,2304 und einem Fehler von 1,5 mDa. Die berechneten Formeln entsprachen möglicherweise denen von Lovastatin19, Phytosphingosin20 bzw. Linolensäure21 für diese Komponenten aus Ganoderma spp. Dennoch war die Intensität von Lovastatin aufgrund des Rauschens in der Spektralfraktion nicht klar. Daher wurde die Fraktion mittels HR-MS-Analyse im MRM-Modus weiter untersucht, um das Massenspektralmuster zu erhalten, das mit dem des Lovastatin-Standards verglichen wurde (Abb. 3a). Die Fraktion enthielt drei markante Peaks bei 405,2619, 285,1861 und 199,1483 Da (Abb. 3b), die mit Lovastatin übereinstimmten. Daher wurde der Schluss gezogen, dass Lovastatin in den mit Ethanol extrahierten G. australe-Myzelien vorhanden war, wenn auch in einer Spurenmenge der 3,2 mg Rohextrakt.

Massenspektralmuster (MS2). (a,b) QTOF im MRM-Modus-Analyse von (a) Lovastatin-Standard. (b) Fraktionen, die zur gleichen Retentionszeit wie Lovastatin gesammelt wurden. (c–f) Obitrap-Analyse eines Rohextrakts, der möglicherweise (c) p-Cumarsäure enthält. (d) Gamma-Aminobuttersäure (GABA). (e) Nicotinamid. (f) Cholin. Schwarze Rahmen stellen die drei obersten Peaks dar, die den Fragmentierungsmustern vorläufiger Verbindungen in Bibliotheken entsprechen.

Darüber hinaus wurden die Ethanolextrakte aus dem Myzel von G. australe mithilfe von LC-MS/MS-Methoden auf bioaktive Verbindungen untersucht. Die von LC/MS Orbitrab bereitgestellten Ergebnisse zeigten das Profil bioaktiver Verbindungen, die vollständig oder teilweise, zumindest die oberen drei Peaks, mit den Fragmentierungsmustern vorläufiger Verbindungen in Bibliotheken übereinstimmten. Sie wurden auch bei anderen Pilzen beobachtet (Tabelle 1), darunter eine Phenolsäure, ein Neurotransmitter, ein Vitamin, Aminosäuren, Saccharide, Nukleoside und Derivate. Beispielsweise sind die Massenspektralmuster von p-Cumarsäure, GABA, Nicotinamid und Cholin in Abb. 3c – f dargestellt. Darüber hinaus identifizierte die aktuelle Untersuchung andere Derivate von Biomolekülen, für die in der Literatur keine weiteren Berichte über diese Verbindungen in Pilzen gefunden wurden (Ergänzungsdaten).

Verschiedene Konzentrationen des Extrakts wurden auf ihre hemmende Wirkung auf die Aktivität der menschlichen HMG-CoA-Reduktase untersucht (Abb. 4). Die Enzymkinetik ergab mit 79,08 ± 1,72 % die höchste Hemmaktivität des 1 mg/ml-Extrakts gegenüber der (negativen) Kontrolle. Die Hemmung wurde jedoch verringert, wenn die Konzentration des Extrakts auf 2,0 und 2,5 mg/ml erhöht wurde, mit Hemmungsprozentsätzen von 71,90 ± 1,03 % bzw. 66,11 ± 0,72 %. Basierend auf der im Kit enthaltenen Positivkontrolle hatte 1 µM Pravastatin eine Hemmung von 84,32 ± 2,10 %. Die statistische Analyse zeigte, dass Myzelextrakte ab 0,50 mg/ml eine vergleichbare Hemmwirkung wie Pravastatin hatten. Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) des Myzelextrakts betrug 234,9 ± 1,6 µg/ml. Daraus konnte geschlossen werden, dass der Myzelextrakt eine konzentrationsabhängige Hemmwirkung gegen die zellfreie HMG-CoA-Reduktase bis zu 1 mg/ml des Extrakts aufweist. Die Aktivität des Extrakts auf die Lebensfähigkeit der Zellen und die Cholesterinproduktion durch Leberzellen wurde weiter untersucht.

Hemmung der zellfreien HMG-CoA-Reduktaseaktivität durch G. australe-Myzelextrakt. Der Ethanolextrakt wurde in DMSO in einem Konzentrationsbereich von 0,0125–2,5 mg/ml gelöst. DMSO wurde als Negativkontrolle und Pravastatin als Positivkontrolle verwendet. Die verringerten NADPH-Raten wurden aus der Verringerung der spektrophotometrischen Absorption bei 340 nm berechnet. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der Negativkontrolle in Abwesenheit von Verbindungen dargestellt. Balken geben den Mittelwert ± SEM von Dreifachexperimenten an. Es wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest zum Vergleich mit der Pravastatin-Kontrolle durchgeführt. Werte mit Buchstaben, die nicht mehr als einmal vorkommen, unterscheiden sich signifikant voneinander (p < 0,0001).

In 2D und 3D kultivierte HepG2-Zellen wurden verwendet, um die Wirkung von Myzelextrakten auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu untersuchen. Nur Konzentrationen des Extrakts von 0,08 mg/ml und Lovastatin von 2,5 und 5,0 µM verringerten die Lebensfähigkeit von 2-D-HepG2-Zellen nicht signifikant (Abb. 5a). Im Gegensatz dazu wurde die Zelllebensfähigkeit von Sphäroiden bei allen in diesem Experiment hergestellten Konzentrationen durch den Extrakt oder durch Lovastatin bei 2,5 und 5 µM nicht wesentlich beeinträchtigt (Abb. 5b). Darüber hinaus waren die Formen der 3D-HepG2-Sphäroide ähnlich und bei allen Proben größer als 1 mm (Abb. 5c). Die Ergebnisse zeigten, dass der in einer Konzentration von 2,5 mg/ml verwendete Myzelextrakt keine sphäroide Toxizität aufwies. Daher wurde die maximale Konzentration des Myzels, die in dieser Forschung hergestellt werden konnte, verwendet, um die Wirkung von Sphäroiden auf die Cholesterinproduktion zu untersuchen.

Lebensfähigkeit von HepG2-Zellen und Morphologie ihrer Sphäroide. (a) Lebensfähigkeit von 2-D-HepG2-Zellen. (b) 3D-Sphäroide, dargestellt als Prozentsatz der Werte von Zellen/Sphäroiden, die mit Kontrollmedien kultiviert wurden. Zellen und Sphäroide wurden mit verschiedenen Konzentrationen des Extrakts und 2,5 und 5 µM Lovastatin 48 Stunden lang kultiviert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM von drei einzelnen Extraktionen (n = 3) ausgedrückt, mindestens in dreifacher Ausfertigung für jeden Test. Statistische Unterschiede wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey analysiert. Werte mit Buchstaben, die nicht mehr als einmal vorkommen, unterscheiden sich signifikant voneinander (p = 0,0004). (c) Bilder von HepG2-Sphäroiden: 48 Stunden lang mit Medienkontrolle (links), 2,5 mg/ml Myzelextrakt (Mitte) und 5 µM Lovastatin (rechts) kultiviert, aufgenommen unter einem Lichtmikroskop.

Die 70-, 61- und 83-FTIR-Spektren der Kontroll-, Myzelextrakt- und Lovastatin-Behandlung wurden in einem 2D-Score-Diagramm getrennt (Abb. 6a). PC-1 (27 %) unterschied die Kontrolle von der Myzelbehandlung, PC-3 (9 %) zeigte jedoch einen Unterschied zwischen der Lovastatin-Behandlung und den anderen Proben. PCA wurde verwendet, um die Variation der biochemischen Verbindungen aufzudecken (Abb. 6b). Die PC1- und PC3-Analyse ergab, dass sich die Kontrolle von den anderen durch Beladungen bei den Peaks 2927 und 2855 für Lipide und 1656 und 1627 für Amid I unterschied, während Lovastatin bei den Peaks 1380 und 1238 durch unterschiedliche Mengen an Cholesterin und Nukleinsäuren vom Myzel getrennt war PC3 bzw. Darüber hinaus wurden die sekundären Derivatspektren analysiert, um die Differenzierung der drei wichtigsten biochemischen Moleküle Proteine ​​und Nukleinsäuren (Abb. 6c) und Lipide (Abb. 6d) zu identifizieren.

FTIR-Spektren von HepG2-Sphäroiden. (a) Score-Diagramm von PC1 und PC3. (b) PCA-Beladungsdiagramme im Spektralbereich von 1000–3000 cm−1. (c) Spektren der zweiten Ableitung von Protein- und Nukleinsäureregionen in 1000–1700 cm−1. (d) Lipidregionen in 2800–3000 cm−1. (e) Peakfläche der Sekundärspektren. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung einer Zwei-Wege-ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey durchgeführt, um verschiedene Funktionsgruppen jeder Probe dreifach zu analysieren. Werte mit Buchstaben, die nicht mehr als einmal vorkommen, unterscheiden sich signifikant voneinander (p < 0,0001). Sphäroide, die 48 Stunden lang mit Kontrollmedium, 2,5 mg/ml Myzelextrakt und 5 µM Lovastatin behandelt wurden, sind in Blau, Grün bzw. Rot dargestellt.

Die Mittelwerte der Spektren der zweiten Ableitung in Nukleinsäureregionen (1500–1000 cm−1) sind in Abb. 6c dargestellt. Die drei verschiedenen Proben hatten Absorptionsbanden bei ähnlichen Wellenzahlen von 1462, 1388, 1235 und 1167 cm−1, jedoch mit unterschiedlichen Intensitäten. Die Proteinregion (1700–1500 cm–1) zeigte starke Absorptionen bei 1743, 1653, 1633, 1543 und 1516 cm–1 (Abb. 6c). Die meisten dieser Wellenzahlen entsprechen der Schwingung funktioneller Gruppen, die in 2D-HepG2-Zellen und 3D-menschlichem Gewebe berichtet wird. Die Wellenzahl von 1235 cm−1 zeigte die asymmetrische Schwingung der Phosphodiesterbindungen von Nukleinsäuren22,23. Die Ergebnisse zeigten, dass das Myzel, die Kontrolle und Lovastatin Intensitäten aufwiesen, die von hoch bis niedrig reichten. Die Wellenzahl 1743 cm−1, die der Streckung von C=O in Proteinen24 und Lipiden22,25 entspricht, hatte bei der Myzelbehandlung eine ähnliche Intensität wie bei der Lovastatin-Behandlung, war jedoch höher als bei der Kontrolle. Die Wellenzahl 1653 cm-1 repräsentierte die Streckung der Amid-I-Region der α-Helix22,26, während 1633 cm-1 die Schwingung der Amid-I-Region der β-Faltblätter in 2-D-HepG222 und Gewebe27 zeigte. Die spektralen Änderungen der beiden letztgenannten Wellenzahlen in der aktuellen Studie zeigten, dass sowohl mit Myzel als auch mit Lovastatin behandelte Sphäroide eine Verringerung des Proteins in der α-Helix-Struktur aufwiesen, Konformationsänderungen an den β-Faltblättern jedoch nur in den mit Arzneimitteln behandelten Proben auftraten. Alle drei Sphäroidproben hatten ungefähr die gleiche Intensität bei 1543 cm−1, was der Schwingung von Amid II28,29 entsprach.

Der Lipidspektralbereich bei etwa 3000–2800 cm−1 zeigte Schwingungen der C–H-Gruppe. Der spektrale Durchschnitt der drei Proben zeigte hohe Absorptionspeaks bei 2925 und 2852 cm−1 (Abb. 6d). Die Wellenzahl bei 2925 cm−1 bezog sich auf eine asymmetrische Schwingung von CH2 in Lipiden25,30; 2852 cm−1 war die symmetrische Streckschwingung von CH225,27, die sowohl in 2-D-HepG2 als auch in menschlichem Gewebe beobachtet wurde. Die mit G. australe-Myzel behandelten Sphäroide hatten höhere Intensitätspeaks bei 2852 und 2925 cm−1 als die Kontroll- und Lovastatinproben, was auf einen relativ hohen Anteil an Lipiden schließen lässt.

Abbildung 6e zeigt die Peakfläche der Sekundärspektren jeder Probe, die Bandenzuordnungen für asymmetrische und symmetrische CH2-Streckung (2936–2912 bzw. 2863–2842), Carbonylgruppen (1754–1733) und Amid I (1670–1619) aufwiesen. , symmetrische Streckung (1469–1438) und Biegung (1404–1368) von Cholesterin CH2 und CH331,32 sowie asymmetrische Phosphat-Streckgruppen in DNA und RNA (1255–1208). Die Analyse ergab, dass nur die asymmetrische CH2-Streckung des Myzelextrakts signifikant höher war als die der Kontrolle. Die symmetrische CH2-Streckung des Myzelextrakts und die Cholesterin-Streckung der Lovastatin-Behandlung waren tendenziell höher als bei den anderen Proben. Da Cholesterin eine Art Lipid und das Produkt des Mevalonat-Stoffwechselwegs ist, wurden es und sein Subtyp HDL weiter quantifiziert.

Die Leberzellen wurden in einer 3D-Kugelform gezüchtet. Nach 48-stündiger Inkubation mit 2,5 mg/ml Extrakt und 5 µM Lovastatin wurde das von den Sphäroiden produzierte Cholesterin entestert und die Menge des Gesamtcholesterins gemessen. Anschließend wurde HDL vor der Quantifizierung anhand seiner Dichte vom Gesamtcholesterin in allen Proben abgetrennt. Der HDL-Gehalt wurde anhand der Standardkurve berechnet und als Prozentsatz des Gesamtcholesterins für einzelne Proben dargestellt. Die Sphäroide, die 48 Stunden lang mit 2,5 mg/ml Myzelextrakt behandelt wurden, erhöhten den HDL-Prozentsatz signifikant auf 71,35 ± 2,74 % im Vergleich zur Kontrolle (33,26 ± 3,15 %), wie in Abb. 7 dargestellt. Überraschenderweise veränderte sich nicht nur 5 µM Lovastatin Der HDL-Prozentsatz des Gesamtcholesterins erreichte während der Inkubation einen HDL-Prozentsatz von 32,13 ± 3,24 %, es erhöhte jedoch auch die Menge des Gesamtcholesterins auf 6,11 ± 0,50 µg. Allerdings war die Gesamtmenge an Cholesterin im Myzelextrakt und in der Kontrolle ungefähr gleich (3,32 ± 0,47 µg bzw. 3,25 ± 0,93 µg). Dementsprechend zeigten die Ergebnisse die Wirkung der Myzelextraktion auf die Steigerung der HDL-Produktion in 3D-Leberzellmodellen.

Cholesterinproduktion durch HepG2-Sphäroide. 3-D-Zellen wurden mit Kontrollmedium, 2,5 mg/ml Myzelextrakt und 5 µM Lovastatin 48 Stunden lang kultiviert. Der HDL-Gehalt wird als Prozentsatz des Gesamtcholesterins jeder einzelnen Probe dargestellt. Balken geben den mittleren Prozentsatz ± SEM jeder Probe an. Drei einzelne kultivierte Myzelien wurden dreifach untersucht. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey durchgeführt. Werte mit Buchstaben, die nicht mehr als einmal vorkommen, unterscheiden sich signifikant voneinander (p = 0,0004).

Unsere morphologische Identifizierung ergab, dass die meisten Merkmale des Exemplars denen von G. australe ähnelten, wie von Luangharn et al.15 beschrieben, mit Ausnahme der blassgrünen Farbe der Porenoberfläche, die stattdessen mit dem von Yamashi beschriebenen jungen Fruchtkörper übereinstimmte und Hirose33. Bellemain et al. berichteten, dass es sich bei der erhaltenen Myzelsequenz, die die ITS1-5.8S-ITS2-Sequenzregion abdeckt, möglicherweise um einen Pilz-DNA-Barcode handelt. Somit kann die Sequenz dieser Probe eindeutig zur Pilzidentifizierung herangezogen werden. Es zeigte eine hohe Ähnlichkeit mit G. australe (> 99 %), das aus südostasiatischen Ländern stammt, darunter Malaysia (LC084706.1)33 und Indonesien (KJ654369). Daher wurde die Pilzprobe anhand der morphologischen Merkmale und der molekularen Identifizierung als G. australe identifiziert.

Ganoderma australe gehört zur Gattung Ganoderma, deren medizinische Funktionen und die Produktion von Lovastatin durch das Myzel von G. lucidum, das mit Ethanol19 extrahiert wurde, ähnlich wie in der aktuellen Arbeit, vielfach beschrieben wurden. Die Identifizierung von Lovastatin im Myzelextrakt von G. australe erfolgte zunächst durch Vergleich der Retentionszeiten der Probenpeaks mit der Standardverbindung. Die Peakfläche des Rohextrakts war höher als der LOD der Technik, was zur Spiking-Methode führte, bei der der Probe Standardlösungen von Lovastatin als interne Standards zugesetzt wurden. Das potenzielle Vorhandensein von Lovastatin in der Probe zeigte sich als Anstieg der Peakhöhe bei entsprechender Retentionszeit. Daher wurde eine Massenanalyse durchgeführt.

Die Tandem-Massenspektralmuster der Fraktion belegten ursprünglich das Vorhandensein von Lovastatin im Myzel von G. australe, das mit Ethanol extrahiert wurde, obwohl es Spuren dieser Verbindung enthielt. Verschiedene Teile des Pilzes (z. B. Fruchtkörper) und unterschiedliche Substrate oder Fermentationsmethoden könnten verwendet werden, um die Menge an produziertem Lovastatin zu erhöhen35.

Die Biokomponentenprofile des G. australe-Myzels wurden ebenfalls untersucht. Die meisten der identifizierten Verbindungen haben pharmazeutische Wirkung und kommen in Pilzen vor. Beispielsweise sind Polysaccharide in Garnoderma spp. vorhanden, und über ihre biologischen Aktivitäten, wie z. B. antioxidative, antitumorale und antimikrobielle Aktivitäten, wird ausführlich berichtet36. Im Extrakt der aktuellen Studie wurden jedoch vorläufig nur Monomere und Disaccharide gefunden, möglicherweise weil in diesem Protokoll weniger hydrophiles Lösungsmittel zur Extraktion der bioaktiven Inhaltsstoffe verwendet wurde. Darüber hinaus spielen Nukleoside eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Immunantwort und sind in Pilzen vorhanden37,38. Die aktuellen Biokomponentenprofile zeigten viele Nukleoside und ihre Derivate. Palmitinsäure (C16), Linolsäure (C18) und Ölsäure (C18) sind die wichtigsten Fettsäuren, die bei der Erdölextraktion der Fruchtkörper von G. australe39 vorkommen. In der aktuellen Studie wurde berichtet, dass möglicherweise nur Linolensäure (C18), ein Omega-3-Lipid, im Myzel von G. australe vorhanden ist, möglicherweise weil während der Extraktion ein polares Lösungsmittel verwendet wurde. Das Vorhandensein dieser Verbindungen sollte im Vergleich zu ihren Standards weiter untersucht werden. Darüber hinaus wurden kürzlich Alkaloide40 und Meroterpenoide41 in den Fruchtkörpern von G. australe entdeckt, die mit einer anderen organischen Verbindung (Ethylacetat) extrahiert wurden. Nicotinamid, GABA und Cholin sind bioessentielle Bestandteile des Menschen und kommen möglicherweise im Myzel von G. australe vor, wie in der aktuellen Arbeit berichtet. Darüber hinaus wird p-Cumarsäure als Ergänzung zur Linderung von Hyperlipidämie eingesetzt42,43 und wurde auch in der aktuellen Arbeit gefunden. Somit trägt es möglicherweise zu den medizinischen Funktionen des G. australe-Myzels bei.

Triterpenoide sind eine der am besten untersuchten Verbindungen, die in Garnoderma spp. enthalten sind. Kürzlich wurden viele neue Triterpenoide vom Lanostan-Typ in G. australe-Extrakten aus Myzelien44 und Fruchtkörpern45,46,47 unter Verwendung von Alkohol und Ethylacetat identifiziert. Einige dieser Verbindungen zeigten eine antituberkulose Wirkung, eine mäßige Hemmung der Stickoxidproduktion und eine signifikante Hemmwirkung auf die Aktivität der α-Glucosidase. Darüber hinaus hat ein Triterpenoid-Metabolit, 7-Oxo-Ganodersäure Z (C30H46O4), eine hemmende Wirkung auf die HMG-CoA-Reduktase48, das geschwindigkeitsbestimmende Enzym bei der De-novo-Cholesterinsynthese. Die aus den Fruchtkörpern von G. lucidum mit 95 % Ethanol extrahierte reine Verbindung hatte einen IC50-Wert von 22,3 µM. Dies führt zu der Hypothese, dass der G. australe-Myzelextrakt eine hemmende Wirkung gegen die HMG-CoA-Reduktase haben könnte.

Menschliches Cholesterin wird hauptsächlich täglich von der Leber synthetisiert49 und durch Rückkopplungshemmung im geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des durch HGM-CoA-Reduktase katalysierten Stoffwechselwegs gesteuert. Daher sind alle Verbindungen mit einer hemmenden Wirkung auf die HMG-CoA-Reduktaseaktivität für die Verwendung bei der Behandlung von Hypercholesterinämie von Interesse. Folglich wurde in der aktuellen Studie die Wirkung des Myzelextrakts auf die Hemmung des menschlichen Enzyms in vitro, die Lebensfähigkeit von Leberzellen und die Produktion von Cholesterin durch 3-D-Leberzellen beobachtet. Das Ergebnis des In-vitro-HGM-CoA-Reduktase-Assays zeigte, dass der G. australe-Myzelextrakt bei 0,5 mg/ml (50 µg in einer Reaktion) eine Hemmung von 58,69 % zeigte, was höher war als die Hemmwirkung von 23 Heilpflanzen bei gleicher Menge in der In-vitro-Reaktion50.

In Ganoderma spp. sind bioaktive Verbindungen vorhanden. die eine hemmende Wirkung auf die HMG-CoA-Reduktase haben, wie z. B. Lovastatin19, Lanostan-Triterpene51 und 7-Oxo-Ganoderin Z48. Obwohl Lanostane in den Myzelien44 und Fruchtkörpern45 von G. australe identifiziert wurden, wurde in keiner dieser Arbeiten die hemmende Wirkung von G. australe auf das Enzym untersucht. Die aktuelle Studie zeigte die konzentrationsabhängige Hemmung der zellfreien HMG-CoA-Reduktase durch G. australe-Myzelextrakt. Obwohl die maximale Hemmung bei 1 mg/ml auftrat, zeigte die Konzentration des Rohextrakts bei 2 und 2,5 mg/ml eine leicht verringerte Hemmung, was auf die Streuung des Lichts durch Partikel und die Verringerung des Absorptionswerts auf 340 nm zurückzuführen sein könnte. Das Vorhandensein von Lovastatin und vorläufiger p-Cumarsäure (nachgewiesen mittels LC‒MS) deutete auf eine solche hemmende Wirkung des Myzelextrakts auf das Cholesterin-geschwindigkeitsbegrenzende Enzym hin.

Die Wirkung des G. australe-Myzelextrakts auf die Lebensfähigkeit von 2-D- und 3-D-HepG2 wurde vor der Untersuchung biochemischer Profile und der Cholesterinproduktion beobachtet. Obwohl 2,5 mg/ml des Extrakts die Proliferation von Monolayer-HepG2 reduzierten, hatte diese Konzentration keinen Einfluss auf die Proliferation der Zellen in 3D-Form, was möglicherweise auf die unterschiedliche Absorption der Biokomponenten durch verschiedene Zellmodelle zurückzuführen ist; Daher wurde die maximale Konzentration für die weitere Analyse verwendet. Die HepG2-Sphäroide spiegelten die dreidimensionale Form der Leber und die physiologischen Funktionen besser wider als diejenigen in Monoschichtkulturen. Zu diesen Funktionen gehören die Entgiftung52, die Produktion von Cholesterin53 und die Produktion von Apolipoproteinen (ApoE und ApoA-I)54. Die Ergebnisse deuten auf die mögliche Verwendung von G. australe-Myzelextrakt zur Untersuchung der Cholesterinproduktion mithilfe eines 3D-Lebermodells hin.

Die FTIR-Analyse lieferte Informationen auf molekularer Ebene anhand von Schwingungsspektren, die spezifisch für die funktionellen Gruppen und Bindungstypen eines Moleküls waren. HepG2-Sphäroide wurden in der aktuellen Arbeit ursprünglich mittels FTIR untersucht. Die meisten der erhaltenen Spektren hatten ungefähr die gleichen Wellenzahlen wie für 2-D-HepG222,25,28 und menschliches Gewebe, das eine 3-D-Umgebung darstellt, die diesem Sphäroidmodell ähnelt26,27,29,30. Die Konformationsänderung von Proteinen von α-Helix zu β-Faltblättern, die bei der Lovastatin-Behandlung auftrat, wurde auch in HepG2-Zellen beobachtet, die mit Pravastatin, einem chemisch modifizierten natürlichen Statin, behandelt wurden22. Im Nukleinsäurebereich jeder Probe zeigten ähnliche Wellenzahlen, aber unterschiedliche Peakintensitäten trotz der unterschiedlichen Nukleinsäurekonzentrationen die gleichen Komponenten. Die Lebensfähigkeit der behandelten Sphäroide ließ darauf schließen, dass ein solcher Effekt wahrscheinlich nicht auf die DNA-Proliferation unter Laborbedingungen zurückzuführen ist. Daher kam es möglicherweise zu einer veränderten Genexpression.

Insgesamt kann die FTIR-Spektroskopie zur Differenzierung der Lipidprofile behandelter G. australe-Sphäroide verwendet werden. Es wurde gezeigt, dass der Myzelextrakt im Vergleich zur Kontrolle und Lovastatin die Menge an Lipiden erhöhte, die von HepG2-Sphäroiden produziert wurden. Cholesterin ist neben Fettsäuren und Phospholipiden (ein Bestandteil der Zellmembran) eine Art Lipid, das hauptsächlich von Hepatozyten produziert wird. Daher wurden Schwingungen funktioneller Cholesteringruppen bewertet. Reagenzienfreies LDL und HDL weisen Fingerabdruckbanden bei 2852 bzw. 2926 cm−1 für die Lipid-CH-Schwingung auf, ähnlich dem aktuellen Bericht. Obwohl sie im Proteinbereich liegen, waren die Peaks bei 1735 und 1739 cm−1 mit der Schwingung von C=O verbunden, die in reagensfreiem LDL bzw. HDL zu finden ist55. Diese Peaks lagen in der aktuellen Arbeit bei 1743 cm−1, konnten jedoch nicht zur Differenzierung der Schwingung des Esters von LDL, HDL oder Protein verwendet werden. Die verschobenen Wellenzahlen könnten von den unterschiedlichen Methoden der Gewebepräparation56 und der Größe der Proben (z. B. 2D oder 3D der Melanomzellen)57 herrühren.

In den aktuellen Experimenten erhöhte das Myzel im Vergleich zur Kontrolle den HDL-Anteil bei gleichbleibendem Gesamtcholesteringehalt deutlich. In dieser Studie wurde eine erhöhte Menge an Gesamtcholesterin beobachtet, die durch die Lovastatin-Inkubation produziert wurde, ähnlich dem beobachteten Trend einer vergrößerten Peakfläche um die Cholesterinstreckung im FTIR-Ergebnis. Dies könnte auf den Effekt der homöostatischen Erholung im Anschluss an die Hemmwirkung von Lovastatin zurückzuführen sein, da die Aktivität der HMG-CoA-Reduktase durch Rückkopplungshemmung gesteuert wird58. Vergleichsweise war der Cholesteringehalt erhöht, wenn HepG2-Sphäroide länger als 22 Stunden mit 1 µM Lovastatin inkubiert wurden; Allerdings wurde eine verringerte Cholesterinmenge beobachtet, wenn die Sphäroide für einen kürzeren Zeitraum (4 Stunden) mit 10 μM Lovastatin behandelt wurden59.

HDL ist aufgrund seiner Funktion beim umgekehrten Cholesterintransport und seines Nutzens für den Herz-Kreislauf-Schutz zum interessanten Cholesterin geworden60. Unter solchen Umständen erhöhte die Mischung natürlicher Verbindungen im G. australe-Myzelextrakt die HDL-Produktion durch die behandelten Sphäroide; Dies war insbesondere wirksamer als reines Lovastatin. Weitere Experimente sollten durchgeführt werden, um festzustellen, ob dieses Ergebnis mit der unterschiedlichen Genexpression und Proteinproduktion von Apoproteinen, die sich unterschiedlich aus HDL und anderem Cholesterin zusammensetzen, korrespondiert. Beispielsweise sollten ApoE und ApoA-I (ein Apoproteinbestandteil von HDL) berücksichtigt werden, die im Sphäroidmodell54 stark exprimiert werden.

Obwohl bekannt ist, dass dreidimensionale Modelle den Nachteil der Monoschicht-Zellkultur bei der Nachahmung der Gewebefunktion überwinden, sollte eine weitere Untersuchung des In-vivo-Modells die mögliche Behandlung von Hypercholesterinämie durch funktionelle Lebensmittel untersuchen. Beispielsweise wurden hydroalkoholischer Myzelextrakt61 und organischer Phasenextrakt62 von G. lucidum mit Futter gemischt, um fettreiche Mäuse mit einer Konzentration von 0,5–1,0 % bzw. Hamster mit einer Konzentration von 2,5–5,0 % zu behandeln. In der aktuellen Arbeit wurden 2,5 mg/ml, vergleichbar mit 0,25 %, des Myzelextrakts zur Behandlung von HepG2-Sphäroiden verwendet, was auf eine sichere Dosis für weitere Experimente in Tiermodellen hinweist. Darüber hinaus linderte die Behandlung mit p-Cumarsäure, einer vorläufigen Verbindung, die in der aktuellen Arbeit im Myzel von G. australe gefunden wurde, die Wirkung von Hypercholesterin in vivo42,43.

Zusammenfassend konnten die Biokomponenten des G. australe-Myzelextrakts erstmals nachgewiesen werden. Der Extrakt hatte eine hemmende Wirkung auf die Aktivität eines menschlichen Enzyms, das die Cholesterinrate begrenzt, möglicherweise durch Lovastatin und p-Cumarsäure im Myzelextrakt. Die biochemischen Profile der 3D-Leberzellen veränderten sich bei der Behandlung mit Lovastatin und dem Myzelextrakt. Die mit dem Myzel behandelten Sphäroide zeigten ein ausgeprägtes Lipidprofil. Darüber hinaus stieg der Anteil von HDL am Gesamtcholesterin im Vergleich zur Kontrolle und zu reinem Lovastatin, was auf eine positive Wirkung hindeutet und auf eine mögliche Behandlung von Hypercholesterinämie mit natürlichen Verbindungsmischungen aus in Thailand gesammelten G. australe-Myzelien hindeutet.

Die Autoren erklären, dass alle Daten, die die Ergebnisse dieser Forschung stützen, in diesem Artikel verfügbar sind.

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Dieses Forschungsprojekt wurde finanziell von der Agricultural Research Development Agency (öffentliche Organisation) Thailands (ARDA) unterstützt; International SciKU Branding (ISB), Fakultät für Naturwissenschaften, Kasetsart University, Thailand; das Büro des Ministeriums für Hochschulwissenschaft, Forschung und Innovation; und die wissenschaftliche Forschung und Innovation Thailands im Rahmen des Kasetsart University Reinventing University Program 2021. Wir möchten Herrn Anucha Tara, dem Leiter der Agroforst-, Forschungs- und Ausbildungsstation Trat, für die Erleichterung der Probenentnahme danken.

Abteilung für Biochemie, Fakultät für Naturwissenschaften, Kasetsart-Universität, Bangkok, 10900, Thailand

Sudthirak Wongkhieo, Wanthongchai Tangmesupphaisan, Jeeraprapa Siriwaseree, Kiattawee Choowongkomon und Napachanok M. Swainson

Abteilung für Mikrobiologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Kasetsart-Universität, Bangkok, 10900, Thailand

Yaovapa Aramsirirujiwet & Prissana Wiriyajitsomboon

Abteilung für Waldbiologie, Fakultät für Forstwirtschaft, Kasetsart-Universität, 50 Ngamwongwan Rd, Lat Yao, Chatuchak, Bangkok, 10900, Thailand

Tharnrat Kaewgrajang

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Saifa Pumlofa & Atchara Paemanee

Abteilung für Forschungseinrichtungen, Synchrotron Light Research Institute (öffentliche Organisation), 111 University Avenue, Muang District, Nakhon Ratchasima, 30000, Thailand

Buabarn Kuaprasert

Heart Science Centre, Magdi Yacoub Institute, Harefield, Großbritannien

Adrian H. Chester

National Heart and Lung Institute (NHLI), Imperial College London, London, Großbritannien

Adrian H. Chester

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SW war für das Leberzellmodell und den Test verantwortlich. WT bereitete den Extrakt vor, führte HPLC und einen zellfreien Test durch. TK sammelte und identifizierte die Morphologie des Wildpilzes G. australe. YA und PW kultivierten das Myzel. TK und NMS analysierten die Arten der gesammelten Proben. SP, AP und NMS führten HRMS durch und analysierten biochemische Verbindungen. JS, NMS und BK führten eine FTIR-Analyse durch. KW und AHC stellten theoretisches Wissen zur Verfügung und gestalteten und korrigierten den Artikel. NMS entwarf Experimente, analysierte Daten und schrieb den Artikel. Alle Autoren haben zur endgültigen Form dieses Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Napachanok M. Swainson.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Wongkhieo, S., Tangmesupphaisan, W., Siriwaseree, J. et al. In-vitro-cholesterinsenkende Aktivität von Ganoderma australe-Myzelien basierend auf Massenspektrometrie, Synchrotron-Fourier-Transformations-Infrarotanalyse und Leber-Sphäroid-Bioaktivität. Sci Rep 13, 13619 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40861-8

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Eingegangen: 17. Januar 2023

Angenommen: 17. August 2023

Veröffentlicht: 21. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40861-8

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