Statistische Optimierung von P(3HB

Oct 09, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9005 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyhexanoat) [P(3HB-co-3HHx)] ist ein bakterielles Copolymer aus der Familie der Polyhydroxyalkanoate (PHAs), einem Biokunststoff der nächsten Generation. Unser Forschungsteam hat kürzlich einen neuen P(3HB-co-3HHx)-produzierenden Bakterienstamm entwickelt, Cupriavidus necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp. Dieser Stamm kann P(3HB-co-2 Mol-% 3HHx) unter Verwendung von rohem Palmkernöl (CPKO) als einzigem Kohlenstoffsubstrat produzieren. Allerdings wurde die Verbesserung der P(3HB-co-3HHx)-Copolymerproduktion durch diesen Stamm bisher nicht untersucht. Daher zielt diese Studie darauf ab, die Produktion von P(3HB-co-3HHx)-Copolymeren mit höheren 3HHx-Monomerzusammensetzungen mithilfe der Response-Surface-Methodik (RSM) zu verbessern. Drei wichtige Faktoren für die Produktion von P(3HB-co-3HHx)-Copolymeren, nämlich CPKO-Konzentration, Natriumhexanoat-Konzentration und Kultivierungszeit, wurden im Kolbenmaßstab untersucht. Als Ergebnis wurde unter Verwendung der RSM-optimierten Bedingung ein Maximum von 3,6 ± 0,4 g/L P(3HB-co-3HHx) mit 4 Mol-% 3HHx-Zusammensetzungen erhalten. Ebenso wurde die höhere 3HHx-Monomerzusammensetzung (5 Mol-%) erhalten, wenn die Fermentation in einem 10-L-Rühr-Bioreaktor vergrößert wurde. Darüber hinaus ähnelten die Eigenschaften des hergestellten Polymers denen des marktfähigen P(3HB-co-3HHx), sodass dieses Polymer für ein breites Anwendungsspektrum geeignet ist.

Die Plastikverschmutzung hat sich zu einer der kritischsten globalen Umweltherausforderungen entwickelt. Offensichtlich hat die COVID-19-Pandemie zu einem enormen Anstieg erdölbasierter Einwegkunststoffe beigetragen, beispielsweise Handschuhe, medizinische Schutzanzüge, Masken, Händedesinfektionsflaschen, Kunststoffe zum Mitnehmen, Lebensmittelbehälter und medizinische Testkits1,2. Diese herkömmlichen Kunststoffe sind nicht biologisch abbaubar und können viele Jahre lang auf Mülldeponien und im Meer verbleiben und die Bodenqualität, mikrobielle Aktivität, Fauna und Flora erheblich beeinflussen3. Durch den Eintritt in die Nahrungskette besteht eine Gefahr für die menschliche Gesundheit4. Aufgrund dieser Bedenken erfreuen sich biologisch abbaubare Kunststoffe mit geringen oder keinen Auswirkungen auf die Umwelt zunehmender Beliebtheit als Alternativen zu erdölbasierten Kunststoffen. Darüber hinaus wird erwartet, dass sie Teil künftiger Kreislaufwirtschaften sind, die dazu beitragen werden, Aspekte der Ziele für nachhaltige Entwicklung (SDGs) der Vereinten Nationen zu erreichen5,6.

Polyhydroxyalkanoate (PHAs) sind Polyester, die in der Natur als intrazelluläre Speicherverbindung produziert werden und von einigen Bakterien und Archaeen unter Stressbedingungen als Energiereserve angesammelt werden7,8. PHAs sind Thermoplaste mit Eigenschaften, die mit herkömmlichen erdölbasierten Polymeren wie Polypropylen (PP) und Polyethylen (PE) vergleichbar sind9,10. Interessanterweise zeigt das Polymer der PHA-Familie eine hervorragende biologische Abbaubarkeit, selbst wenn es Meerwasser ausgesetzt ist11, was PHAs zu einem vielversprechenden Ersatz für erdölbasierte Kunststoffe macht. PHAs werden anhand der Kohlenstoffzahlen in den Monomerbestandteilen in zwei Gruppen eingeteilt: kurzkettige PHAs (SCL-PHA, C3-C5), die aus 3–5 Kohlenstoffmonomeren bestehen, und mittelkettige PHAs (MCL). -PHA, C6-C14), die aus 6–14 Kohlenstoffmonomeren in den 3-Hydroxyalkanoat-Einheiten bestehen12,13.

Derzeit wurden mehr als 150 Arten von PHAs identifiziert14, darunter Homopolymere und Copolymere, beispielsweise Poly(3-hydroxybutyrat) [P(3HB]), Poly(3-hydroxybutyrat-co-4-hydroxybutyrat) [P(3HB-co -4HB)], Poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat) [P(3HB-co-3HV)], Poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyhexonat) [P(3HB-co-3HHx)] . Unter den PHA-Copolymeren ist Poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyhexanoat) [P(3HB-co-3HHx)] aufgrund seiner überlegenen Flexibilität und Ähnlichkeit mit verschiedenen gängigen erdölbasierten Polymeren bemerkenswert beliebt, was es zu mehr macht für praktische Anwendungen anwendbar als steifes P(3HB)-Homopolymer. 15, 16. Darüber hinaus ist P(3HB-co-3HHx) aufgrund seiner hervorragenden Biokompatibilität und biologischen Abbaubarkeit ein geeignetes Kandidaten-Copolymer für biomedizinische Anwendungen. 17

Dennoch wurden die kommerziellen Anwendungen von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs) durch die im Vergleich zu konkurrierenden petrochemischen Polymeren relativ hohen Herstellungskosten eingeschränkt. Daher ist die Verbesserung des Fermentationsmediums ein entscheidendes Forschungsgebiet, da sie erhebliche Auswirkungen sowohl auf das Zellwachstum als auch auf die Expression gewünschter Metaboliten hat und zur Gesamtproduktivität beiträgt18. Die Reaktionsoberflächenmethodik (RSM) ist ein statistischer Optimierungsansatz, der experimentelle faktorielle Designs wie das zentrale Verbunddesign (CCD) und das Box-Behnken-Design (BBD) verwendet, die wichtigsten Antwortoberflächendesigns zur Optimierung der Prozessausbeute, und spezifiziert das Verhalten der Reaktion im angegebenen Bauraum19,20. Beide Designs untersuchen die Interaktionswirkung von Elementen, die die Produktentwicklung wesentlich beeinflussen. CCD- und BBD-Versuchsläufe werden für RSM verwendet, um das mathematische Modell zu erstellen, das Prozessparameter mit Ergebnissen in Beziehung setzt21. BBD erfordert jedoch typischerweise weniger Designpunkte als CCD, was zu einem Regressionsmodell von schlechterer Qualität führen kann.

Die rekombinanten PHA-produzierenden Stämme mit Genen, die für PHA-Syntheseenzyme aus verschiedenen Bakterien kodieren, wurden entwickelt, um PHAs mit kurzer bis mittlerer Kettenlänge (SCL-MCL) effektiver zu erzeugen22. Unsere Forschungsgruppe hat kürzlich einen neuen P(3HB-co-3HHx)-produzierenden Bakterienstamm entwickelt, C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp23,24. Dieser Stamm produzierte 3,1 ± 0,3 g/L P(3HB-co-3HHx)-Copolymer mit 2 Mol-% der 3HHx-Monomerzusammensetzung, wenn 10 g/L rohes Palmkernöl (CPKO) als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wurden24. Allerdings müssen ein optimales Kulturmedium und Bedingungen für die PHA-Produktion durch diesen Stamm verbessert werden, um die Ausbeute an P(3HB-co-3HHx) zu maximieren. Daher zielt diese Studie darauf ab, die Fermentationsbedingungen für C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp mithilfe von RSM zu optimieren, um die P(3HB-co-3HHx)-Produktion zu verbessern. Außerdem wurde die Fermentation in einem 10-l-Rührtank-Bioreaktor durchgeführt, um die P(3HB-co-3HHx)-Produktion zu steigern. Abschließend wurden die Eigenschaften dieses Polymers bewertet, um zu bestätigen, dass dieses Polymer für verschiedene Anwendungen vielversprechend ist.

Die optimale Mediumzusammensetzung und Kultivierungsbedingungen für die P(3HB-co-3HHx)-Produktion sowie die Interaktionseffekte jedes Parameters wurden mithilfe eines CCD-Designs mit drei Variablen und fünf Ebenen bestimmt. Zu den CCD-Variablen gehörten die CPKO-Konzentration, g/L(X1), die Natriumhexanoat-Konzentration, g/L(X2) und die Kulturzeit, h(X3). Die experimentellen Ergebnisse der P(3HB-co-3HHx)-Produktion und die vorhergesagten Reaktionen sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass die höchste P(3HB-co-3HHx)-Produktion (Durchlauf 6), 3,54 g/L, erreicht wurde, als Die Konzentration von CPKO, Natriumhexanoat und die Kultivierungszeit betrugen 15 g/L, 1,0 g/L bzw. 54 Stunden. Während die niedrigste P(3HB-co-3HHx)-Produktion (Durchlauf 3) 0,53 g/L betrug, betrugen die Konzentrationen von CPKO, Natriumhexanoat und die Kultivierungszeit 5 g/L, 3,0 g/L bzw. 42 Stunden. Die CCD-Experimentergebnisse mehrerer Regressionsanalysen wurden an ein Polynommodell zweiter Ordnung angepasst. Das folgende Modell wurde verwendet, um die P(3HB-co-3HHx)-Produktion anhand codierter Variablen anzupassen.

Dabei ist Y die P(3HB-co-3HHx)-Produktion und X1, X2 und X3 kodierte Werte für CPKO, Natriumhexanoat bzw. Kultivierungszeit.

Der F-Test und die ANOVA für das quadratische Antwortoberflächenmodell bestätigten die statistische Signifikanz der Gleichung. R2 = 0,9885 war der Bestimmungskoeffizient in der Regressionsgleichung dieser Studie (Tabelle 2). Infolgedessen kann dieses Modell etwa 98,85 % der Variabilität der abhängigen Variablen erklären; die restlichen 1,15 % wurden durch andere Faktoren beeinflusst. Während das modifizierte R2, das die Stichprobengröße und die Anzahl der Begriffe25 berücksichtigt, 0,9782 betrug. Die R2-Werte liegen konstant zwischen 0 und 1. Je höher der R2, desto einflussreicher ist das Modell und desto besser prognostiziert es die Reaktion21. P-Werte werden verwendet, um die Signifikanz jedes Koeffizienten zu bewerten, was zum Verständnis des Musters der gegenseitigen Wechselwirkungen zwischen den Variablen beiträgt26. Je stärker die Signifikanz des entsprechenden Koeffizienten27 ist, desto kleiner ist der P-Wert. Der F-Test und die entsprechenden P-Werte wurden geschätzt, wie in Tabelle 2 gezeigt. Das Modell zeigt an, dass die konstanten linearen (X1, X2, X3), quadratischen (X12, X22, X32) und Interaktionsterme (X1X3 und X2X3) sind signifikant (P < 0,05) (Tabelle 2). Da der P-Wert für alle Variablen (X1,

Der negative Polynomkoeffizient in Bezug auf die Interaktion in diesem Modell legt nahe, dass die Interaktion oppositionell ist. Der fehlende Fit-F-Wert von 1,26 (Tabelle 2) weist darauf hin, dass der fehlende Fit im Vergleich zum Standardfehler statistisch nicht signifikant ist. Die Wahrscheinlichkeit, dass dieser hohe F-Wert mit fehlender Anpassung auftritt, liegt bei 40,36 Prozent und ist auf Rauschen zurückzuführen.

Um die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Parametern zu bewerten und den optimalen Wert jedes Parameters für eine maximale P(3HB-co-3HHx)-Produktion zu bestimmen, wurde die Reaktion zwischen CPKO(X1), Natriumhexanoat (X2) und der Kultivierungszeit CPKO (X3) aufgezeichnet wie in Abb. 1 dargestellt. Abbildung 1A zeigt die Wirkung von CPKO und Natriumhexanoat auf die P(3HB-co-3HHx)-Produktion. Die P(3HB-co-3HHx)-Produktion stieg, als die CPKO-Konzentration von 5,0 auf 15,0 g/L stieg. Bei einer niedrigeren CPKO-Konzentration (< 5,0 g/L) ging die P(3HB-co-3HHx)-Produktion zurück. Während die P(3HB-co-3HHx)-Produktion mit abnehmender Natriumhexanoat-Konzentration zunahm, von 3,0 auf 1,0 g/L. Bei einer höheren Natriumhexanoat-Konzentration (> 3,0 g/L) ging die P(3HB-co-3HHx)-Produktion dramatisch zurück.

Vom Modell beschriebene Reaktionsoberflächen- und Konturdiagramme, die die P(3HB-co-3HHx)-Produktion (g/L) als Wert von CPKO, Natriumhexanoat und die Kultivierungszeit durch C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp darstellen. Die kombinierte Wirkung von CPKO und Natriumhexanoat (A); CPKO und Kultivierungszeit (B); Natriumhexanoat und Kultivierungszeit (C).

Gemäß den RSM-3D-Diagrammen und 2D-Konturdiagrammen von CPKO(X1) und Kultivierungszeit(X2) bei der P(3HB-co-3HHx)-Produktion (Abb. 1B) wurde gezeigt, dass die P(3HB-co-3HHx) Die Produktion verbesserte sich erheblich, als CPKO von 5,0 auf 15,0 g/L erhöht wurde. Gleichzeitig wurde sie reduziert, als die CPKO-Konzentration auf unter 5,0 g/L sank. Außerdem stieg die Produktion von P(3HB-co-3HHx) an, wenn die Kultivierungszeit von 54 auf 42 Stunden verkürzt wurde. Dennoch nahm die P(3HB-co-3HHx)-Produktion mit zunehmender Kultivierungszeit (> 54 Stunden) dramatisch ab.

Die Wirkung von Natriumhexanoat und die Kultivierungszeit sind in Abb. 1C dargestellt. Die P(3HB-co-3HHx)-Produktion stieg mit abnehmendem Natriumhexanoat von 3,0 auf 1,0 g/L. Während die P(3HB-co-3HHx)-Produktion bei einer höheren Konzentration von Natriumhexanoat (> 3,0 g/L) dramatisch abnahm und mit zunehmender Zeitspanne von 42 auf 54 Stunden zunahm. Darüber hinaus nahm die P(3HB-co-3HHx)-Produktion ab, wenn die Kultivierungszeit weniger als 42 Stunden betrug.

Das Modell wurde für die drei Faktoren im Designraum verifiziert, um die Optimierungsvorhersagen zu validieren. RSM-optimierte Mediumzusammensetzung und -bedingungen wurden dreifach im 250-Kolben-Maßstab getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass unter den folgenden Bedingungen: CPKO, 14,4 g/L, Natriumhexanoat, 1,7 g/L und 43 Stunden Kultivierungszeit die maximale P(3HB-co-3HHx)-Produktion 3,63 ± 0,4 beträgt, bei 5,54 ± Es wurden 0,8 g/L DCW erhalten, was nahe der vorhergesagten P(3HB-co-3HHx)-Produktion von 3,55 g/L liegt. Die vorhergesagten und experimentellen Werte wurden verglichen und das Residuum berechnet. Der relative Unterschied zwischen dem tatsächlichen und dem vorhergesagten P(3HB-co-3HHx)-Produktionsniveau betrug 0,3 %. Infolgedessen sind die beobachteten Modelle sehr genau und die RSM-Analyse ist ein geeigneter Ansatz zur Vorhersage und Verbesserung des Fermentationsmediums und der Fermentationsbedingungen.

Die Batch-Kultivierung wurde in einem 10-Liter-Rührtank-Bioreaktor durchgeführt, um die Zellbiomasse und die P(3HB-co-3HHx)-Produktion von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp zu steigern. Die Fermentation wurde in einem Bioreaktor durchgeführt, der 6 l RSM-optimiertes Medium (CPKO, 14,4 g/l, Natriumhexanoat, 1,7 g/l) enthielt. Temperatur, pH-Wert, Belüftungsrate und Rührgeschwindigkeit wurden auf 30 °C, 6,8, 0,25 vvm bzw. 200 U/min festgelegt. Das Wachstum und die P(3HB-co-3HHx)-Produktion von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp stiegen während der 48-stündigen Fermentation langsam an. Wie in Abb. 2 zu sehen ist, nahm die Biomasse während der Fermentation allmählich zu. Wenn die Fermentationsdauer jedoch über das Optimum (42 h) hinaus verlängert wurde, wurden die P(3HB-co-3HHx)-Produktion und das Zellwachstum unterbrochen und der Abbau von P(3HB-co-3HHx) begann28. Die höchste Produktion von P(3HB-co-3HHx) erfolgte nach 42 Stunden, als der DCW 6,2 ± 0,3 g/L betrug; Die P(3HB-co-3HHx)-Produktion betrug 3,9 ± 0,3 g/L (Abb. 2). Außerdem ist zu beachten, dass der höhere Anteil an 3HHx-Monomeren (5 Mol-%) bei der Kultivierung von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp in einem 10-Liter-Rührtank-Bioreaktor erhalten wurde.

Batch-Fermentationsprofil von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp p in einem 10-l-Rührtank-Bioreaktor.

Das extrahierte P(3HB-co-5 Mol-% 3HHx)-Copolymer, hergestellt aus C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp, wurde durch 1H-NMR, FTIR, DSC und TGA charakterisiert, um die strukturellen und thermischen Eigenschaften des Copolymers für weitere Anwendungen zu verstehen. Das 1H-NMR wurde durchgeführt, um das Vorhandensein von 3HHx-Monomer in dem vom Stamm C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp synthetisierten Copolymer zu überprüfen. Abbildung 3 zeigt die 1H-NMR-Bande von H4, die den C4-Methylengruppen entspricht, und die 1H-NMR-Bande von H6, die der C6-Methylgruppe entspricht, was auf die Bildung des P(3HB-co-3HHx)-Copolymers15,24,29 hinweist . Die Monomeranteile des Copolymers wurden anhand des Intensitätsverhältnisses der Methylkomponenten im 1H-Spektrum berechnet30. Die Werte der erzeugten 3HHx-Monomerfraktionen waren mit einer Abweichung von 1 Mol-% geringfügig höher als die durch Gas-GC-Analyse beobachteten Werte.

Protonen-Kernspinresonanzspektroskopie (1H-NMR)-Spektrum von P(3HB-co-3HHx), hergestellt von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp in einem 10-L-Rührtank-Bioreaktor.

FTIR-Absorptionsspektren wurden im Bereich von 4000–400 cm−1 gescannt. Die FTIR-Spektren des von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp synthetisierten Copolymers sind in Abb. 4 dargestellt. Der Hauptabsorptionspeak von P(3HB-co-3HHx) wurde im Spektrum bei 1720,98 cm−1 beobachtet, was entspricht zur Streckschwingung der Carbonyl (C=O)-Esterbindung31,32. Während die asymmetrische C-O-C-Streckschwingung den Absorptionspeak bei 1269,35 cm − 133 verursacht, werden die C-H-Streckschwingung und die -CH-Gruppe durch die anderen charakteristischen Banden bei 2976,37 cm−1 und 1221,72–1375,09 cm−1 dargestellt bzw.34,35. Für die amorphe Phase wurden die C-O- und C-C-Streckschwingungen einer Reihe von Absorptionsbanden im Bereich von 1179,79 bis 606,08 cm−133 zugeordnet.

Abgeschwächte Totalreflexions-Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (ATR-FTIR)-Spektrum von P(3HB-co-3HHx), erzeugt von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp in einem 10-L-Rührtank-Bioreaktor.

Die thermischen Eigenschaften des von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp hergestellten P(3HB-co-5 Mol-% 3HHx)-Copolymers wurden mittels DSC und TGA analysiert. Abbildung 5 zeigt das Thermogramm der Schmelztemperatur (Tm) und der Glasübergangstemperatur (Tg) und Abbildung 6 zeigt die Abbautemperaturen (Td) des Copolymers. Die Werte wurden ab dem zweiten Erhitzen aufgezeichnet, um den thermischen Verlauf der vorherigen Proben zu eliminieren. Das Thermogramm des extrahierten Copolymers ergab zwei Schmelztemperaturen (Tm1 und Tm2) bei etwa 129 und 144 °C (Abb. 5). Die Tc-, Tg- und Td-Werte des Copolymers lagen bei etwa 89, 1,6 (Abb. 5) bzw. 260,6 °C (Abb. 6).

Differential Scanning Calorimetry (DSC)-Analyse von P(3HB-co-3HHx), produziert von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp, in einem 10-L-Rührtank-Bioreaktor.

Thermogravimetrische Analyse (TGA) von P(3HB-co-3HHx), produziert von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp, in einem 10-L-Rührtank-Bioreaktor.

PHAs sind biologisch abbaubare Polymermaterialien, die aus Bakterien und Archaeen unter Stressbedingungen wie nährstofflimitierenden Konzentrationen von Stickstoff, Phosphor, Schwefel oder Sauerstoff und überschüssigen Kohlenstoffquellen hergestellt werden7,8,36. Offenbar gewinnen PHAs sowohl in der wissenschaftlichen Gemeinschaft als auch in der Wirtschaft zunehmend an Bedeutung. Dadurch ist es möglich, synthetische Polymere wieder aufzufüllen und letztlich die angestrebte Kreislaufwirtschaft zu etablieren. P(3HB-co-3HHx) ist ein praktischer Typ von PHA-Copolymer. Es hat eine niedrigere Schmelztemperatur und Kristallinität als P(3HB)-Homopolymer, was auf die lange Seitenkette der 3-Hydroxyhexanat-Einheit (3HHx) zurückzuführen ist37. Die Copolymere bestehen aus 5–15 Mol-% 3HHx und verfügen über elastische Eigenschaften, die sie für verschiedene Anwendungen geeignet machen38.

Zuvor haben Han et al. berichteten, dass die Wildtyp-Stämme Aeromonas spp. über die PHA-Synthase P(3HB-co-3HHx) aus Pflanzenölen und Fettsäuren produzieren können, was eine einzigartig breite Substratspezifität für (R)-3-Hydroxyacyl-CoAs von aufweist C4-C639. In dieser Studie wurde das P(3HB-co-3HHx)-Copolymer durch C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp23,24, einen neu entwickelten Bakterienstamm, synthetisiert und die P(3HB-co-3HHx)-Produktion verbessert RSM. Die Ergebnisse zeigten, dass die höchsten 3,6 ± 0,4 g/L P(3HB-co-4 Mol-% 3HHx) unter Verwendung der RSM-optimierten Bedingungen im Kolbenmaßstab erhalten wurden. Außerdem wurde die 3HHx-Monomerzusammensetzung bei der Kultivierung von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp im 10-Liter-Bioreaktor während der 48-stündigen Fermentation auf 5 Mol-% erhöht. Dieses Ergebnis ähnelte dem von Ouyang et al.40 erzielten Ergebnis. Sie führten Schüttelkolbenexperimente durch, um P(3HB-co-3HHx) aus Aeromonas hydrophila zu produzieren, wobei die Monomerzusammensetzung von 15 % im Wildtyp auf 3–12 % im Rekombinantentyp gesteuert werden konnte, indem das Verhältnis von Gluconat zu Laurin grundsätzlich geändert wurde Säure im Kulturmedium in 48 Stunden Fermentation. Die in Cupriavidus sp. untersuchte P(3HB-co-3HHx)-Produktion. Volova et al.22 berichteten, dass C. eutrophus B10646 erhebliche Biomasseausbeuten (5,6 g L−1) und einen hohen Gehalt an Polymer (60–75 %), einschließlich eines hohen 3HHx-Molanteils, produzieren könnte richtige Wachstumsbedingungen. Allerdings können die physikalisch-chemischen und mechanischen Eigenschaften von P(3HB-co-3HHx)-Copolymeren durch Anpassen des 3HB/3HHx-Verhältnisses verändert werden. Außerdem fanden Kawashima et al.41 heraus, dass die Region stromabwärts von phaP1Re eine vorteilhafte Stelle für die Integration von Genen war, die während der PHA-Akkumulation in R. eutropha überexprimiert werden. Die Ergebnisse zeigten auch, dass die Polymerisationseigenschaften der PHA-Synthase durch die Art des Phasins beeinflusst wurden, das auf der Oberfläche des PHA-Granulats koexistierte und das resultierende PHA-Polymer (3HB-co-3HHx) veränderte. Der Austausch von Phasin ist eine innovative technische Methode zur Steuerung der Zusammensetzung von PHA-Copolyestern. Darüber hinaus untersuchten Murugan et al.42 Palmolein (PO) und Fructose als Kohlenstoffquellen für die Biosynthese von P(3HB-co-3HHx) durch den rekombinanten C. necator Re2058/pCB113. Schüttelkolbenkulturen mit 5 g/L PO als einziger Kohlenstoffquelle ergaben ein Zelltrockengewicht (CDW) von 5,13 g/L, 67 % PHA/CDW und ein Copolymer mit 27 Mol-% 3HHx. P(3HB-co-3HHx) mit 4–15 Mol-% 3HHx-Monomer hatte Molekulargewichte im Bereich von 5,47–6,85 × 105 Da, was mindestens dem Doppelten der zuvor gemeldeten Werte entspricht.

In dieser Studie wurde RSM unter Einsatz von CCD eingesetzt, um die Produktion von P(3HB-co-3HHx) im Kolbenmaßstab zu verbessern. Das Ergebnis zeigt, dass unter den folgenden Bedingungen: CPKO, 14,4 g/L, Natriumhexanoat, 1,7 g/L und 43 Stunden Kultivierungszeit die maximale P(3HB-co-3HHx)-Produktion von 3,63 ± 0,4 erreicht wurde, was nahezu der Fall ist Das RSM sagte eine P(3HB-co-3HHx)-Produktion von 3,55 g/L voraus. Diese Ergebnisse bewiesen die Genauigkeit des RSM-Modells für die P(3HB-co-3HHx)-Produktion. Darüber hinaus kann das optimierte Medium im Vergleich zum nicht optimierten Zustand die Produktion der Monomerzusammensetzung P(3HB-co-3HHx) und 3HHx um das 1,2- bzw. Zweifache verbessern. Auf dieser Grundlage war die Verbesserung der P(3HB-co-3HHx)-Produktion geringfügig vorhanden, die 3HHx-Monomerzusammensetzung wurde jedoch durch RSM erfolgreich verbessert. Zuvor wurde berichtet, dass RSM eine wirksame Methode zur Verbesserung der PHA-Biosynthese durch viele Mikroorganismen ist43,44,45,46,47. Der Einsatz von RSM zur Verbesserung der P(3HB-co-3HHx)-Produktion war jedoch begrenzt.

Über die Anwendung der Batch-Fermentation durch verschiedene Bakterien zur Steigerung der PHA-Biosynthese im Bioreaktor wurde berichtet48,49,50,51,52. Allerdings kann in dieser vorliegenden Studie die P(3HB-co-3HHx)-Produktion mit diesem Ansatz nicht gesteigert werden. Lediglich die Zusammensetzung des 3HHx-Monomers wurde auf 5 Mol-% erhöht, was möglicherweise mit der verkürzten Erntezeit zusammenhängt. Darüber hinaus sind Batch-Kultivierungen einfach zu betreiben, weisen jedoch aufgrund der begrenzten Konzentration der Kohlenstoff- und Stickstoffvorräte zu Beginn der Fermentation eine geringe intrinsische Produktivität auf53. Im Gegensatz dazu erzeugt die Fed-Batch-Fermentationsmethode eine hohe Zellkonzentration, verbessert die Produktivität und verringert die Substrat- oder Endprodukthemmung54.

In dieser Studie wurde das P(3HB-co-3HHx)-Copolymer mit 5 Mol-% 3HHx-Monomerzusammensetzung durch den manipulierten Stamm C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp unter Verwendung von CPKO und Natriumhexanoat als Kohlenstoff bzw. Vorläufer synthetisiert . Das Copolymer wurde extrahiert und charakterisiert, um die strukturellen und thermischen Eigenschaften des Copolymers für die weitere Verwendung zu verstehen. Das 1H-NMR-Spektrum bestätigte die Existenz von 3HHx-Monomer in P(3HB-co-3HHx)-Copolymeren, die von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp synthetisiert wurden. Es ähnelte den 1H-NMR-Spektren von Wong et al.30 und Bhubalan et al.55. Außerdem enthält dieses Polymer gemäß der Berechnung der 3HHx-Monomerzusammensetzung aus 1H-NMR-Spektren 5–6 Mol-% 3HHx-Monomer, ähnlich den Ergebnissen der GC-Analyse. Die FTIR-Spektren des Copolymers zeigten den charakteristischen Absorptionspeak von P(3HB-co-3HHx)-Copolymeren bei 1720,98 und 1269,35 cm−1, der der Streckschwingung der Carbonylesterbindung (C=O) und der asymmetrischen C–O– entspricht. C-Streckschwingung bzw.31,32. Diese Ergebnisse zeigten, dass es sich bei dem hergestellten Copolymer um P(3HB-co-3HHx) handelte.

Die thermischen Eigenschaften des von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp hergestellten P(3HB-co-5 Mol-% 3HHx)-Copolymers wurden mittels DSC und TGA analysiert. Das DSC-Thermogramm des extrahierten Copolymers ergab zwei Schmelztemperaturen (Tm1 und Tm2) bei etwa 129 und 144 °C. Es sind zwei Schmelztemperaturen für mcl-PHAs nachweisbar, die möglicherweise auf die Bildung zweier unterschiedlicher Kristallphasen (Phase I und Phase II) zurückzuführen sind56. Die Tc-, Tg- und Td-Werte des Copolymers betrugen 89, 1,6 bzw. 260,6 °C. Diese Ergebnisse ähneln den zuvor von Murugan et al.42 untersuchten Ergebnissen. Sie haben berichtet, dass die Tm und Tg von P(3HB-co-4 Mol-% 3HHx), hergestellt aus C. necator Re2058/pCB113, 164 bzw. –1 °C betrugen.

Das P(3HB) Td wurde bei 280 °C56,57,58 angegeben. Das Td-Copolymer in dieser Studie war aufgrund des Einbaus des 3HHx-Monomers niedriger. Im Allgemeinen hatten P(3HB-co-3HHx)-Copolymere eine niedrigere Tm und Td als P(3HB), obwohl zwischen diesen Eigenschaften und den 3HHx-Molfraktionen kein erkennbarer Zusammenhang bestand22.

In dieser Studie wurde die Produktion der P(3HB-co-3HHx)-Copolymere durch einen manipulierten Stamm von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp mithilfe von RSM verbessert. Unter optimalen RSM-Bedingungen kann dieser Stamm 3,6 ± 0,4 P(3HB-co-3HHx) mit 4 Mol-% 3HHx-Zusammensetzungen produzieren. Im Vergleich zum nicht optimierten Zustand kann das optimierte Medium die Produktion der Monomerzusammensetzung P(3HB-co-3HHx) und 3HHx um das 1,2- bzw. Zweifache verbessern. Interessanterweise wurde außerdem die 3HHx-Monomerzusammensetzung auf 5 Mol-% erhöht, wenn die Fermentation in einem 10-l-Rührtank-Bioreaktor durchgeführt wurde, was 2,5-fach höher war als im nicht optimierten Zustand. Die Ergebnisse der funktionellen Gruppe und der chemischen Struktur bestätigten, dass es sich bei dem Polymer um P(3HB-co-3HHx) handelte, und die thermischen Eigenschaften des hergestellten Polymers waren denen von industriellem P(3HB-co-3HHx) ähnlich.

Der rekombinante Stamm C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp wurde wie von Trakunjae et al.24 beschrieben kultiviert. Kurz gesagt, der Bakterienstamm wurde auf nährstoffreichem (NR) Agar, ergänzt mit 50 µg/ml Kanamycin, 24 Stunden lang bei 30 °C kultiviert. Anschließend wurden drei vollständige Schleifen einer Bakterienkolonie in NR-Medium, ergänzt mit 50 µg/ml Kanamycin, übertragen, um das Bakterieninokulum vorzubereiten. Danach wurden die Inokulumflaschen 8 Stunden lang oder bis die optische Dichte (OD600) 4 erreichte, bei 30 °C unter Schütteln mit 200 U/min inkubiert.

Das 3 % v/v C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp-Inokulum wurde in das P(3HB-co-3HHx)-Produktionsmedium überführt. Das Mineralmedium (MM) für die P(3HB-co-3HHx)-Produktion bestand aus 0,45 g/L K2SO4, 4,6 g/L Na2HPO4, 4,0 g/L NaH2PO4, 0,54 g/L CO(NH2)2 [ Harnstoff], 0,39 g/L MgSO4, 0,062 g/L CaCl2 und 1 ml/L Spurenelementlösung (TE)59. Die TE-Lösung bestand aus ZnSO4·7H2O, 2,4 g/L; FeSO4·7H2O, 15 g/L; MnSO4·H2O, 2,4 g/L, und CuSO4·5H2O, 0,48 g/L, gelöst in 0,1 M HCl. Der pH-Wert von MM wurde vor der Sterilisation auf 6,8 eingestellt. CPKO, Natriumhexanoat und CaCl2 wurden getrennt 20 Minuten lang bei 121 °C sterilisiert. Währenddessen wurden Harnstoff und TE-Lösung mit einem 0,2 µm sterilen Membranfilter filtriert und dem sterilisierten Medium in der erforderlichen Konzentration zugesetzt. Die P(3HB-co-3HHx)-Biosynthese von C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp wurde 48 Stunden lang bei 30 °C unter Schütteln mit 200 U/min durchgeführt.

Die Bakterienzellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 8.000 U/min und 4 °C geerntet. Danach wurden die Zellpellets mit destilliertem Wasser (DW) gewaschen, gefolgt von einer gemischten Lösung aus DW und Hexan im Verhältnis 1:1, um die Ölrückstände zu entfernen. Als nächstes wurden die Zellpellets erneut mit DW gewaschen, um die Hexanreste zu entfernen, und in eine vorgewogene Bijoux-Flasche überführt. Anschließend wurden die Flaschen mit den Bakterienzellpellets über Nacht bei –20 °C eingefroren und mit einem Gefriertrockner bis zur vollständigen Trocknung lyophilisiert. Abschließend wurde das Gewicht der lyophilisierten Zelle in g/L aufgezeichnet. Gleichzeitig wurden der PHA-Gehalt und die Monomerzusammensetzung mittels Gaschromatographie (GC)-Analyse untersucht.

RSM, eine praktische Modellierungsmethode, ist eine Reihe statistischer und mathematischer Werkzeuge zur Erstellung von Experimenten und zur Optimierung der Einflussprozessvariablen60. In dieser Studie wurde die Produktion von P(3HB-co-3HHx)-Copolymeren mithilfe des RSM auf Basis des Central Composite Design (CCD) verbessert. Es wird üblicherweise verwendet, um ein Polynom zweiter Ordnung für die Antwortvariablen zu konstruieren, ohne dass eine vollständige faktorielle Versuchsplanung erforderlich ist.

In dieser Studie wurden drei wichtige Faktoren verwendet, nämlich CPKO (g/L) (X1), Natriumhexanoat (g/L) (X2) und Kultivierungszeit (h) (X3). Jede Variable wurde basierend auf dem CCD-Design auf fünf Ebenen (1,68, 1, 0, + 1 und + 1,68) kodiert, um die Eigenschaften der Reaktionsoberfläche im optimalen Bereich zu definieren. Insgesamt wurden zwanzig Fermentationsläufe gemäß Gl. entworfen. (1), einschließlich fünf wiederholter Fermentationsläufe an den Mittelpunkten.

Dabei ist k die Anzahl der unabhängigen Variablen und n0 die Anzahl der Wiederholungen von Experimenten am Mittelpunkt

Die kodierten und tatsächlichen Werte der signifikanten Faktoren sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Designmatrix der getesteten Fermentationsläufe ist in Tabelle 1 dargestellt. Die Durchschnittswerte wurden aus dreifachen Versuchsläufen angegeben. Für die statistische Analyse der Ergebnisse wurde die Software Design-Expert v7.0.0 (Stat-Ease, Inc. MN, USA) verwendet. Die experimentellen Ergebnisse des CCD-Designs wurden durch mehrere Regressionstechniken an eine Polynomgleichung zweiter Ordnung angepasst, wie in Gl. (2).

wobei Y die vorhersagbare gemessene Reaktion ist; Xi und Xj sind die unabhängigen Variablen; β0 stellt den Achsenabschnitt dar; und βi, βii und βlj sind die Regressionskoeffizienten des Modells61. Das generierte Modell für drei unabhängige Variablen ist in Gl. dargestellt. (3).

wobei Y die vorhergesagte Reaktion der P(3HB-co-3HHx)-Produktion (g/L) ist; β1, β2 und β3 sind lineare Koeffizienten; β11, β22 und β33 stellen quadratische Koeffizienten dar; β12, β13 und β23 sind Interaktionskoeffizienten; X1, X2 und X3 stellen kodierte Werte von CPKO (X1), Natriumhexanoat (X2) und Kultivierungszeit (X3) dar.

Die Werte der drei getesteten Faktoren CPKO, Natriumhexanoat und Kultivierungszeit wurden zufällig aus dem Designraum ausgewählt, um die P(3HB-co-3HHx)-Produktion durch C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp in einem Schütteln zu verifizieren Kolbenmodell. In diesem Experiment befanden sich die anderen Komponenten des Mediums in festen Konzentrationen.

Die Fermentation wurde in einem 10-l-Rührtank-Bioreaktor (Modell MDFT-N-10L, Marubishi, Japan) durchgeführt, um die Produktion von P(3HB-co-3HHx) durch C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp zu verbessern. Die 3 % v/v des Bakterieninokulums wurden in den Bioreaktor überführt, der 6 l optimiertes Medium enthielt. Die Batch-Kultivierung wurde bei 30 °C mit einem anfänglichen pH-Wert und Rührgeschwindigkeiten von 6,8 bzw. 200 U/min durchgeführt. Der pH-Wert der Kulturbrühe wurde während der Fermentation durch Zugabe von HPO3 oder NaOH unter Verwendung eines pH-Reglers auf pH 6,8 gehalten. Der Luftdurchsatz wurde auf 0,25 VVM festgelegt. Die Zellbiomasse und die P(3HB-co-3HHx)-Produktion wurden alle 6 Stunden während der 48-stündigen Fermentation bewertet. Die Fermentationen wurden dreifach durchgeführt und Durchschnittswerte ermittelt.

Die 10 g gefriergetrockneter Zellen wurden in 1 l Chloroform gelöst und 3–5 Tage bei Raumtemperatur gerührt, um die P(3HB-co-3HHx)-Copolymere zu extrahieren. Anschließend wurden die Zelltrümmer durch Filtrieren der Bakterienzellsuspension mit Filterpapier (Whatman Nr. 1) entfernt. Danach wurde die in P(3HB-co-3HHx) gelöste Chloroformlösung mit einem Rotationsverdampfer auf etwa 100 ml eingedampft. Anschließend wurde die eingedampfte Lösung tropfenweise zu 100 ml eiskaltem Methanol gegeben und 1 h gerührt. Abschließend wurde das gereinigte Polymer durch Filtration unter Verwendung einer 0,45-µm-PTFE-Membran abgetrennt und 3–5 Tage lang an der Luft getrocknet44, bevor es für weitere Experimente verwendet wurde.

Die Protonenkernresonanzspektroskopie (1H-NMR) ist eine einfache Technik zur Untersuchung der PHA-Polymerzusammensetzung. In dieser Studie wurden die gereinigten P(3HB-co-3HHx)-Copolymere in deuteriertem Chloroform (CDCl3) bei 25 mg/ml gelöst, um sie für die NMR-Analyse zu verwenden. Das 1H-NMR im Lösungszustand wurde mit einem Jeol JNM-ECZ-400R/S1-Spektrophotometer (JEOL, Ltd., Tokio, Japan) mit einer Resonanzfrequenz von 500 MHz durchgeführt. Die chemischen Verschiebungen wurden auf das Tetramethylsilan (TMS) bezogen. Gleichzeitig wurde Adamantan als externer Standard verwendet.

Die funktionellen Gruppen gereinigter P(3HB-co-3HHx)-Copolymere wurden durch Fourier-Transformations-IR-Spektroskopie (FTIR) nachgewiesen. Die FTIR-Analyse wurde mit einem FTIR-Spektrometer (Thermo Scientific Nicolet IR200, Waltham, MA, USA) durchgeführt. Die 128 Scans wurden im Modus der abgeschwächten Totalreflexion (ATR) erstellt. Außerdem wurden die Spektren im Bereich von 4000 bis 400 cm−1 mit einer Auflösung von 4 cm−1 erreicht.

Die gereinigten P(3HB-co-3HHx)-Copolymere wurden mittels Differentialscanningkalorimetrie (DSC) und thermogravimetrischer Analyse (TGA) auf ihre thermischen Eigenschaften analysiert. Die DSC-Analyse wurde mit DSC25 (TA Instruments, New Castle, DE, USA) unter Verwendung einer Stickstoffflussrate von 30 ml/min analysiert. Etwa 3–5 mg gereinigte P(3HB-co-3HHx)-Copolymere wurden in eine Tzero Aluminium Hermetic-Pfanne gefüllt, abgedeckt und mit einer Heizrate von 15 °C/min von 25 auf 200 °C erhitzt. Die geschmolzenen Proben wurden dann 2 Minuten lang bei 200 °C gehalten und dann schnell auf –40 °C reduziert. Abschließend wurden sie wiederholt mit einer Heizrate von 15 °C/min von −40 auf 200 °C erhitzt. Die Schmelztemperatur (Tm), die Kristallisationstemperatur (Tc) und die Glasübergangstemperatur (Tg) wurden anhand des DSC-Thermogramms erfasst und analysiert. Für die TGA-Analyse wurden etwa 5 mg der gereinigten P(3HB-co-3HHx)-Copolymere in eine Aluminiumpfanne gefüllt und mit dem Pyris 1 TGA-Gerät (Perkin Elmer, USA) analysiert. Die Heiztemperatur wurde unter einer Stickstoffatmosphäre mit einer Heizrate von 20 °C/min auf 30 bis 900 °C eingestellt.

Die Bestimmung von DCW wurde von Trakunjae et al.24 modifiziert. Kurz gesagt wurde 1 ml Zellkultursuspension in die vorgewogenen Eppendorf-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 8.000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurden die geernteten Zellen mit destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt von einer gemischten Lösung aus DW und Hexan im Verhältnis 1:1, um die Ölrückstände zu entfernen. Dann mit DW gewaschen, um Hexanreste zu entfernen, und 10 Minuten lang bei 8.000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurden die erhaltenen Zellpellets über Nacht bei –20 °C eingefroren und mit einem Gefriertrockner 2–3 Tage lang lyophilisiert. Abschließend wurden die Eppendorf-Röhrchen mit lyophilisierten Zellen gewogen, um die Stabilität zu überprüfen, und der DCW in g/L berechnet.

Der PHA-Gehalt und die Monomerzusammensetzung wurden mithilfe der Methanolyse-Technik nach Braunegg et al.62 analysiert. Kurz gesagt, 15–20 mg lyophilisierte Zellen wurden in das Reagenzglas gegeben, gefolgt von 2 ml Chloroform und Methanolyselösung (Mischung aus 85 % v/v Methanol und 15 % w/v H2SO4). Die Röhrchen wurden 180 Minuten lang auf 100 °C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Danach wurde 1 ml DW in die Röhrchen gegeben und 1 Minute lang mit einem Vortex-Mischer kräftig gemischt. Das chloroformreiche PHA in der unteren Schicht wurde mit einer Weidepipette gesammelt. Anschließend die Wasserrückstände mit Na2SO4 entfernen. Die Mischlösung aus 500 ml chloroformreicher PHA-Lösung und 500 ml 0,2 % (v/v) Caprylmethylester (CME) (interner Standard) wurde für die GC-Analyse vorbereitet. Die Analyse wurde mit Shimadzu GC-2014 plus (Shimadzu, Japan) durchgeführt, das mit einer Restek RTX-1-Säule (Restek, USA) und einem Flammenionisationsdetektor (FID) ausgestattet war. Die 2,0 µL der vorbereiteten Probenlösung wurden in das GC-Gerät injiziert. Als Trägergas für die GC-Analyse wurde Stickstoff verwendet. Außerdem wurden die Injektor- und Detektortemperaturen auf 270 °C bzw. 280 °C eingestellt.

Alle experimentellen Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler beschrieben. Die statistische Analyse wurde mit der Software SPSS Statistics 17.0 (SPSS für Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt. Experimentelle Antworten wurden mithilfe einer Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) untersucht. Die linearen, quadratischen und Interaktionsregressionskoeffizienten jedes Modellterms wurden unter Verwendung des F-Werts bei einer Wahrscheinlichkeit (P) < 0,05 berechnet. Darüber hinaus wurde die statistische Signifikanz jedes Termes im Polynom analysiert und alle Koeffizienten mit der Software Design-Expert® v7.0.0 (Stat-Ease, Inc. MN, USA) untersucht.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten. Korrespondenz und Materialanfragen sind an C. Trakunjae oder P. Vaithanomsat zu richten.

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Diese Arbeit wurde vom Kasetsart University Research and Development Institute (KURDI) mit der Fördernummer FF(KU)28,65 finanziell unterstützt.

Kasetsart Agricultural and Agro-Industrial Product Improvement Institute (KAPI), Kasetsart University, Bangkok, 10900, Thailand

Chanaporn Trakunjae, Antika Boondaeng, Waraporn Apiwatanapiwat, Phornphimon Janchai und Pilanee Vaithanomsat

Forschungslabor für Ökobiomaterialien, School of Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia USM, 11800, Penang, Malaysia

Bald Zher Neoh & Kumar Sudesh

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Konzeptualisierung, Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, CT; Überprüfung und Bearbeitung, CT, PV und KS; Projektverwaltung und Fördermittelakquise, PV und CT; Methodik und Datenanalyse, CT, SZN, AB, WA und PJ Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Pilanee Vaithanomsat.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Trakunjae, C., Boondaeng, A., Apiwatanapiwat, W. et al. Statistische Optimierung der Produktion von P(3HB-co-3HHx)-Copolymeren durch Cupriavidus necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp und Charakterisierung seiner Eigenschaften. Sci Rep 13, 9005 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36180-7

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Eingegangen: 14. Februar 2023

Angenommen: 29. Mai 2023

Veröffentlicht: 02. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36180-7

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