Tandemduplizierte CYP82Ds katalysieren 14

May 20, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 875 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Triptolid ist ein wertvolles multipotentes Antitumor-Diterpenoid in Tripterygium wilfordii, und seine C-14-Hydroxylgruppe wird häufig zur Modifikation ausgewählt, um sowohl die Bioverfügbarkeit als auch die Antitumorwirksamkeit zu verbessern. Der Mechanismus für die Bildung der 14-Hydroxylierung bleibt jedoch unbekannt. Hier entdecken wir 133 kb tandemduplizierte CYP82Ds, die 11 Gene auf Chromosom 12 kodieren, und charakterisieren CYP82D274 und CYP82D263 als 14-Hydroxylasen, die das Stoffwechselnetz in der Triptolid-Biosynthese katalysieren. Die beiden CYP82Ds katalysieren die Aromatisierung von Miltiradien, von der wiederholt berichtet wurde, dass sie ein spontaner Prozess ist. In-vivo-Tests und Auswertungen der kinetischen Parameter von CYP82Ds weisen auf die signifikanteste Affinität zu Dehydroabietinsäure unter mehreren Zwischenprodukten hin. Die Vorstufe 14-Hydroxy-Dehydroabietinsäure wird erfolgreich von gentechnisch veränderten Saccharomyces cerevisiae hergestellt. Unsere Studie liefert genetische Elemente für die weitere Aufklärung der nachgeschalteten Biosynthesewege und der heterologen Produktion von Triptolid sowie der derzeit hartnäckigen Biosynthese anderer Sekundärmetaboliten vom 14-Hydroxy-Labdan-Typ.

Tripterygium wilfordii Haken. F., eine Heilpflanze, die auch als Lei Gong Teng bekannt ist, wird in China seit mehr als 500 Jahren (Ming-Dynastie, 1476 n. Chr.) zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen eingesetzt. Moderne pharmakologische Studien haben gezeigt, dass sie umfassend antitumor- und entzündungshemmend wirkt. und immunsuppressive Wirkung1,2. Die Wurzel ist der wichtigste medizinische Teil von T. wilfordii und enthält bis zu 415 chemische Bestandteile, darunter Terpenoide und Alkaloide3. Unter diesem reichen Schatz an Verbindungen leistet Triptolid (1) zweifellos einen wichtigen Beitrag zu den pharmazeutischen Eigenschaften4.

Triptolid, ein 18(4 → 3)-Abeo-Abietan-Diterpenoid mit einer Triepoxidgruppe und einer α,β-ungesättigten Lactoneinheit (Abb. 1a), wurde mit mehreren strukturbasierten künstlichen Derivaten, insbesondere durch Kohlenstoff-14 ( C-14)-Modifikationen, die zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit eingesetzt wurden, und einige der erzeugten Verbindungen wurden in klinische Studien aufgenommen (ClinicalTrials.gov), was zu einer enormen Nachfrage nach Triptolid führte. Allerdings beträgt der Gehalt an 1 in seiner natürlichen Pflanze nur 139 ng·g−1 Trockengewicht5, und der chemische Syntheseansatz weist aufgrund der stereochemischen Komplexität seiner Struktur (z. B. drei Epoxidgruppen, ungesättigtes Lacton) eine geringe Syntheseeffizienz und mehrere Schritte auf und neun Chiralitätszentren)6. Obwohl die kambialen meristematischen Zellen der pflanzlichen Gewebekulturtechnologie die Ausbeute auf 138,1 µg·g−1 7 gesteigert haben, scheinen Strategien der synthetischen Biologie, die auf der Aufklärung des Biosynthesewegs basieren, eine vielversprechendere, nachhaltigere und alternative Methode zu sein8,9 und waren erfolgreich angewendet, um die heterologe Erfassung potenzieller Zwischenprodukte und analoger Triptonide in Mikroorganismen zu erreichen10,11,12. Im Gegensatz dazu haben auch Naturstoffe wie Tripdiolid (2), Triptolidenol (3) und Triptriolid (4) das gleiche 18(4 → 3)-Abeo-Abietan-Gerüst und ähnliche Biosynthesewege wie 1 (Abb. 1a). mehrere pharmazeutische Eigenschaften13. Die Aufklärung des Biosynthesewegs von 1 wird letztendlich zu pharmazeutischen, wirtschaftlichen und ökologischen Vorteilen führen.

a Strukturen der wichtigsten bioaktiven Diterpenoide von T. wilfordii. b Vorgeschlagener Triptolid-Biosyntheseweg. Ein durchgezogener Pfeil stellt eine identifizierte Reaktion dar und ein gepunkteter Pfeil zeigt einen unbekannten Weg an. GGPP: Geranylgeranyldiphosphat. c Koexpressionsprofile von CYPs mit Genen im Triptolid-Biosyntheseweg. TwTPS7(v2), TwTPS27(v2) und CYP728B70 sind rot markiert. Die schwarzen Dreiecke zeigen Gene der CYP82D-Unterfamilie an, die mit identifizierten funktionellen Genen gehäuft sind. Die Gen-ID von CYP82D274 ist TW12G01155.1. Wurzelperiderm (RB), Wurzelphloem (RP), Wurzelxylem (RX), Stammgefäßbündel (PS), Stammperiderm (SB) und Blatt (L). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Kerngerüstcyclisierung und die funktionelle Dekoration in der Biosynthese von 1 werden durch zwei Arten von Diterpensynthasen initiiert, Klasse II TwTPS7(v2) und Klasse I TwTPS27(v2)5,14, die Geranylgeranyldiphosphat (GGPP) cyclisieren, um Olefin Miltiradien zu erzeugen ( 5) und katalysiert die Doppelbindungsumlagerung am C-Ring für die spontane Umwandlung in stabiles aromatisiertes Abietatrien (6)8,15, und CYP728B70 katalysiert dann die Carboxylierung an C-18, um Dehydroabietinsäure (7)16 zu erzeugen. Die zahlreichen nachgeschalteten Schritte von 7 zu 1 bleiben jedoch rätselhaft und sind hauptsächlich in C-14-Hydroxylierungs-, C-18-, 19-Lactonisierungs- und Triepoxidierungsprozesse unterteilt. Gemäß dem vorgeschlagenen Biosyntheseweg (Abb. 1b) tragen Cytochrom P450 (CYPs) mit Hydroxylierungs-, Epoxidierungs- und Isomerisierungsfunktionen17 höchstwahrscheinlich zur Biosynthese von 1 bei, das nachweislich aus einem minimalen Satz von vier Biosynthesekomponenten besteht von CYPs für die heterologe Produktion von Triptonid12.

Hier zeigen wir, dass CYP82D274 und CYP82D263 zusammen mit duplizierten CYP82Ds das C-14-Hydroxylierungsgitter in der Biosynthese von 1 durch genetische Manipulation in nativen Pflanzenzellen und funktionelle Charakterisierung in einem heterologen Wirt katalysieren. Die beiden CYP82Ds können auch die Aromatisierung von 5 umwandeln und die Produktion des geschwindigkeitsbestimmenden 7 fördern. In-vivo-Tests und kinetische Parameter deuten darauf hin, dass CYP82D274 7 auf dem Weg bevorzugt katalysiert und dadurch die Biosynthese von 1 vorantreibt. Das Zwischenprodukt 14-Hydroxy -Dehydroabietinsäure (11) wird erfolgreich de novo in Saccharomyces cerevisiae biosynthetisiert. Diese Studie bietet eine systematische Einführung in C-14-Hydroxylasen von Evolutionshypothesen und funktioneller Charakterisierung bis hin zur heterologen Biosynthese und ebnet damit den Weg für die Aufklärung des Biosynthesewegs von 1 und anderen 14-Hydroxyl-Labdan-/Abietan-Sekundärmetaboliten.

Pathway-Gene übernehmen gemeinsam die Biosynthese von Sekundärmetaboliten, und diese Gene weisen häufig ähnliche Expressionsmuster auf18,19,20; Daher ist die Koexpressionsanalyse einer der leistungsstärksten Ansätze für das erste Screening funktionsassoziierter Gene aus umfangreichen Transkriptomdaten. Um das CYP-Gen zu identifizieren, das für das Enzym kodiert, das für die Biosynthese von 1 verantwortlich ist, analysierten wir 416 CYPs im T. wilfordii-Transkriptom (NCBI SRA-Zugang SRP199495) verschiedener Pflanzengewebe auf Expressionskorrelation mit zuvor charakterisierten Biosynthesegenen, einschließlich TwTPS7(v2), TwTPS27(v2) und CYP728B70. Die Expressionsprofile in der Heatmap wurden in 67 Cluster gruppiert, und 38 Gene aus 16 CYP-Familien, darunter CYP71, CYP72, CYP76 und CYP82, zeigten das gleiche Muster einer wurzelperidermspezifischen hohen Expression und gruppierten sich mit identifizierten funktionellen Genen (Abb. 1c). Bemerkenswert ist, dass die zahlreichsten Gene, TW12G01155.1 (CYP82D274), TW12G01159.1, TW12G01162.1, TW12G01165.1 und TW12G01165.2, zur CYP82D-Unterfamilie gehörten, deren Familie Berichten zufolge an der Terpenoid-Biosynthese beteiligt ist21,22. Die zur CYP82D-Unterfamilie gehörenden Gene wurden als Kandidaten-CYPs für die weitere Analyse ausgewählt.

Eine chromosomale Lokalisierungsanalyse aller CYP82D-Gene ergab, dass sie bei Chr06, Chr08, Chr11, Chr12, Chr15 und Chr19 lokalisiert waren. Eine weitere lokale BLAST-Analyse des gesamten Genoms unter Verwendung der Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen der CYP82D-Gene ergab einen Tandem-Duplikations-Gencluster bei Chr12, der 11 vollständige CYP82D-Gene mit einer Länge von 133 kb und 4 zusätzlichen unvollständigen CYP82D-Genresten enthielt (Abb. 2a). Diese Tandem-Duplikation von CYP82Ds trat in dynamischen Chromosomenregionen auf, die mit transponierbaren Elementen (TEs) angereichert waren, und wurde vermutlich durch die Duplikation und Neuanordnung von Long Terminal Repeat (LTR)-Elementen von Retrotransposons innerhalb von Chromosomen erzeugt. Eine phylogenetische Analyse orthologer CYP82D-Gene (Abb. 2b) ergab, dass sich alle TwCYP82Ds in sechs Kladen gruppierten und das Duplikationsereignis und die Neofunktionalisierung von Klade I und Klade II offenbar bei 26,52 MYA stattgefunden hatten, was mit dem Zeitpunkt des T vergleichbar war . wilfordii Whole-Genome Triplication (WGT)-Ereignis16. Die synonymen Substitutionsratenwerte (Ks) orthologer CYP82D-Gene zeigten, dass die spezifische Expansion der CYP82D-Gene über Tandem-Duplikation erfolgte (Supplementary Data 1).

a Chromosomenlokalisation der 133 kb großen tandemduplizierten CYP82Ds auf Chr12, die für 11 vollständige Gene kodieren. Die gleiche Farbe zeigt orthologe CYP82D-Gene an und die kleinen Dreiecke stellen die unvollständigen Genreste dar. b Phylogenetische Analyse der TwCYP82D-Gene. Der phylogenetische Baum wurde basierend auf der Maximum-Likelihood-Methode (1000 Bootstraps) erstellt. Die Zahlen stellen die vorhergesagte Divergenzzeit dar und WGT gibt das Verdreifachungsereignis des gesamten Genoms von T. wilfordii an.

Die Heatmap-Analyse der Gene in Clade I und Clade II mit den bekannten funktionellen Genen TwTPS7(v2), TwTPS27(v2) und CYP728B70 sowie dem Inhalt von 1 wurde durch Kombination der transkriptomischen Daten und der Metabolitenanalyse erreicht (ergänzende Abbildung 1). . 1 zeigte ein Verteilungsmuster der Wurzelperiderm- und Blattgewebe-spezifischen Expression. CYP82D274 und TW12G01165.1 in Klade I zeigten das gleiche hohe Expressionsmuster im Wurzelgewebe wie die zuvor charakterisierten Gene, wohingegen CYP82D263 in Klade II eine hohe Expression im Wurzelperiderm, Stammperiderm und Blättern zeigte. TW12G01158.1 wurde im Stängelperiderm und in den Blättern, insbesondere im Stängelperiderm, stark exprimiert. Darüber hinaus wurden TW12G01156.1 und TW12G01157.1 nicht entdeckt und angeblich durch Genredundanz während der Evolution selektiv zum Schweigen gebracht. Insbesondere TW08G01036.1 (CYP82D213) zeigte eine wurzelperidermale Expression, und CYP82D213 ist Berichten zufolge am letzten Schritt des analogen Triptonid-Biosynthesewegs beteiligt. Die Transkriptionsexpression der anderen fünf vollständigen CYP82D-Gene dieses Tandem-Duplikations-Genclusters wurde ebenfalls analysiert. In Klade V wurde TW12G01162.1 im Wurzel- und Stammperiderm stark exprimiert, wohingegen TW12G01159.1 eine Basendeletion an Position 44 in der kodierenden Region aufwies, was zum Abbruch der Proteintranslation an Position 26 führte. TW12G01164.1 in Klade VI war stark ausgeprägt im Stammperiderm exprimiert, wohingegen die Expression von TW12G01161.1 und TW12G01163.1 zu gering war, um nachgewiesen zu werden.

Von den aus den Transkriptomen entdeckten CYP82D-Genen wurden 11 kloniert (Ergänzungstabelle 1). Um die biochemische Aktivität der CYPs zu untersuchen, wurden diese 11 CYP82Ds in das Plasmid pESC-LEU integriert, das sowohl CYP als auch Cytochrom P450-Oxidoreduktase 3 aus T. wilfordii (TwPOR3) exprimiert, und dann in den Hefestamm BY4741 transformiert. Die Substratfütterung hat sich bei der Hefefermentation als wirksam erwiesen16,23; Somit wurde das Zwischenprodukt 7 in die Kulturen eingespeist und die Fermentationsprodukte extrahiert. Unter 11 CYP82Ds akzeptierten CYP82D274 und CYP82D263 7 als Substrat mit denselben drei Produkten bei m/z 330 (Abb. 3a und ergänzende Abb. 2). Das Hauptprodukt 11 wurde angereichert und als 14-Hydroxy-Dehydroabietinsäure (11) identifiziert, was unabhängig durch 1H-, 13C-, HSQC-, 1H-1H-COSY- und NOESY-NMR-Analysen (Pulverreinheit 98,23 %) bestätigt wurde (Ergänzende Abbildungen 3). -7 und Ergänzende Anmerkung 1). Das zusätzliche Nebenprodukt 13 wurde beim Vergleich mit dem authentischen Standard als 15-Hydroxy-Dehydroabietinsäure identifiziert (ergänzende Abbildung 8). Und eine weitere Optimierung der GC-MS-Detektion durch Erhöhung der MS-Auflösung ergab, dass CYP82D274 und CYP82D263 die Produktion eines weiteren Nebenprodukts, 12-Hydroxy-Dehydroabietinsäure (18)24, katalysierten, das mit 11 isomer ist und identische MS-Fragmente aufweist (ergänzende Abb . 9). Insgesamt können CYP82D274 und CYP82D263 7 zur Produktion von 11 katalysieren, indem sie die C-14-Hydroxylierung induzieren (Abb. 3b), wenn auch mit Promiskuität (C-12, C-15 usw.).

eine GC-MS-Analyse methylierter Produkte von CYP82D274 und CYP82D263, die Dehydroabietinsäure (7) in vivo oder in vitro katalysieren. Leerer Vektor (EV) bezeichnet Hefe, die mit einem leeren Vektor ohne CYP transformiert wurde. b Katalytischer Prozess in a. c Kinetische Profile von CYP82D274 und CYP82D263, die 7 in vitro katalysieren. Die Quantifizierung von 11 basierte auf der durch LC-TQ-MS/MS erhaltenen Standardkurve y = 0,7336x-0,014 (R² = 0,9994). Die Konzentration der CYPs wurde durch Messung des reduzierten CO-Differenzspektrums geschätzt. Kinetische Parameter wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse unter Verwendung des Michaelis-Menten-Modells berechnet. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung SD aus drei biologisch unabhängigen Replikaten dargestellt, und die schwarzen Kreise stellen die einzelnen Datenpunkte dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wie aus In-vitro-Enzymtests hervorgeht, konnten sowohl CYP82D274 als auch CYP82D263 ihre wichtigsten 14-Hydroxylase-Funktionen zeigen und 11 in Gegenwart von TwPOR3, NADPH, Substrat 7 und Cofaktoren erzeugen (Abb. 3a). Die Km-Werte von CYP82D274 und CYP82D263 betrugen zum optimalen Reaktionszeitpunkt 0,99 ± 0,17 μM bzw. 8,42 ± 1,89 μM (Abb. 3c und ergänzende Abb. 10a). Diese stationären kinetischen Parameter zeigten, dass CYP82D274 CYP82D263 hinsichtlich Substrataffinität und katalytischer Wirksamkeit deutlich überlegen war.

Um die entscheidende Rolle von CYP82D274 und CYP82D263 in der 1-Biosynthese weiter zu untersuchen, wurde RNA-Interferenz (RNAi) genutzt, um die Expression dieser beiden Gene in T. wilfordii-Suspensionszellen zu unterdrücken. Alle TwCYP82D-Nukleinsäuresequenzen im Genom zeigten eine hohe Identität von 69,61 %, hauptsächlich zwischen CYP82D274 und CYP82D263, mit einer Übereinstimmung von 81,41 %. Wir haben speziell ein 459-bp-Fragment (Nukleotide 459–917) von CYP82D274 und ein 498-bp-Fragment (Nukleotide 373–870) von CYP82D263 ausgewählt, um den binären Vektor pK7GWIWG2D (II) zu konstruieren, und diese durch Plasmidbeschuss in Suspensionszellen transformiert25. Die elektrophoretischen Banden des vektorspezifischen Fragments zeigten eine erfolgreiche Transformation an (ergänzende Abbildung 11a), und der Nachweis der Expression von CYP82D274 und CYP82D263 zeigte, dass sie erwartungsgemäß auf eine Störung gerichtet waren (Abb. 4d). Die Metabolitenprofilierung ergab, dass die Hemmungsrate von 1 60,37 % betrug und die Akkumulation von Triptophenolid (10), Triptobenzol D (8) und dem Direktprodukt 11 in den CYP82D274-RNAi-Zelllinien erheblich verringert wurde (Abb. 4d und ergänzende Daten 2). ). Insbesondere die Expression von CYP728B70, TwTPS27(v2) und TwTPS7(v2) wies gegensätzliche Veränderungen auf, bei denen es sich vermutlich um eine intergene Feedback-Regulation handelte. In den CYP82D263-RNAi-Zelllinien waren drei Metaboliten, 1, 10 und 8, signifikant verringert. Basierend auf den Hemmungsraten einzelner Metaboliten beobachteten wir darüber hinaus eine stärkere Hemmung der Metaboliten in CYP82D274-RNAi und CYP82D263-RNAi, je weiter der Signalweg stromabwärts fortschritt, was auf eine Kaskadenakkumulation von Metaboliten hindeutet.

eine MALDI-MSI-Analyse der Verteilung von Triptolid-Zwischenprodukten im Wurzelgewebe von T. wilfordii. DHB wurde als Matrix für die Metabolitenbildgebung im Positivionenmodus verwendet. Die Farben stellen den Intensitätsprozentsatz dar und jedes Bild ist unabhängig. b Relativer Gehalt an Diterpenoiden und relative Quantifizierung der Genexpression in mit 14-Hydroxy-Dehydroabietinsäure (11) gefütterten Zelllinien. Zellen, die nicht mit 11 gefüttert wurden, dienten als Negativkontrolle. Die P-Werte von Genen mit signifikanten Unterschieden in der Expression zwischen den Gruppen betrugen 0,0375, 0,0178, 0,0031, 0,0448 und 0,0294 in dieser Reihenfolge. c Metabolitenanalyse von 18O-markierten 11-behandelten Zellproben. 18O-11 wurde an T. wilfordii-Suspensionszellen verfüttert, die die Biosynthese von Vorläufern hemmten, und Wildtyp (WT) und unmarkierte 11-behandelte Zellen wurden als Negativkontrollen verwendet. 18O-11 wurde in Pflanzenzellen in 18O-Triptinin B (9) umgewandelt, und die Massenspektren markierter gegenüber unmarkierten Metaboliten werden bereitgestellt. d Relativer Gehalt an Diterpenoiden und relative Genexpression in CYP82D274- und CYP82D263-RNAi-Zelllinien. e Relativer Gehalt an Diterpenoiden in CYP82D274- und CYP82D263-überexprimierenden Zelllinien. Die mit entsprechenden leeren Vektoren beschossenen Zelllinien dienten in d und e als Kontrollen, und signifikante Unterschiede (P-Werte) bei Metaboliten zwischen den Gruppen sind in den Zusatzdaten 2 und 3 dargestellt. b, d, e Die relative Quantifizierung jedes Metaboliten war wird berechnet, indem jede Probe durch den durchschnittlichen Gehalt der Kontrollgruppe dividiert wird. Die relative Expression von Genen wurde mit der 2−△△Ct-Methode bestimmt. EFLα wurde als Housekeeping-Gen bestimmt und die entsprechende Kontrollgruppe als Referenzprobe zugewiesen. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (n = 3 biologisch unabhängige Replikate) dargestellt. ***P < 0,001, **P < 0,01 und *P < 0,05, bestimmt durch zweiseitigen Student-t-Test. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

CYP82D274 und CYP82D263 wurden auch in Pflanzenzellen spezifisch überexprimiert, was durch elektrophoretische Banden und Genexpression belegt wurde (ergänzende Abbildung 11). Eine gezielte Metabolitenanalyse zeigte, dass die Überexpression von CYP82D274 und CYP82D263 zu einem signifikanten Anstieg der Akkumulation von 1 und 10 sowie des Direktprodukts 11 führte (Abb. 4e und ergänzende Daten 3). Die Ergebnisse dieser In-vivo-Tests legen nahe, dass CYP82D274 und CYP82D263 als 14-Hydroxylasen an der 1-Biosynthese beteiligt sind.

Um direkte Beweise dafür zu liefern, ob 11 an der Biosynthese von 1 beteiligt ist, wurden massenspektrometrische Bildgebung und Metabolitenanalyse eingesetzt. Frühere Studien ergaben, dass 1 eine für Wurzelperidermgewebe spezifische Aufbaueigenschaft aufweist (ergänzende Abbildung 1). Die Verteilung der Metaboliten in frischen Wurzeln wurde gezielt mittels MALDI-TOF-MS untersucht und es wurde festgestellt, dass sich die bekannten Zwischenprodukte 6 und 10 im Periderm anreichern (Abb. 4a). Darüber hinaus zeigten die mutmaßlichen Zwischenprodukte 7 und 826, einschließlich der in dieser Studie entdeckten Verbindung 11, mit Carboxylgruppen ebenfalls eine hohe Verteilung in der Peridermregion, was ihre räumliche Korrelation verdeutlicht. Allerdings war 1 für die MALDI-MS-Bildgebung aufgrund des extrem geringen Gehalts der Verbindung, der Wahl des Mediums, des Ionenmusters und der Konkurrenz umgebender Ionen um Laserionisierungsmöglichkeiten nicht verfügbar.

In Kombination mit dem oben genannten Gewebeverteilungsmuster der Zwischenprodukte verfütterten wir 11 an T. wilfordii-Suspensionszellkulturen und stellten fest, dass die Gehalte von 1 und 10 im Vergleich zu den Werten in der Negativkontrolle um das 35,73- bzw. 35,60-fache erhöht waren (Abb . 4b und ergänzende Daten 4). Darüber hinaus wurde das katalytische Substrat 7 von CYP82D274 und CYP82D263 deutlich reduziert. Die Ergebnisse zeigten außerdem, dass alle Downstream-Pathway-Gene, von denen bekannt ist, dass sie an der 1-Biosynthese beteiligt sind (CYP82D274, CYP82D263, CYP728B70, TwTPS27(v2), TwTPS7(v2) und TwGGPS), in unterschiedlichen Anteilen eine Verringerung der Expression um das 0,42- bis 0,76-fache aufwiesen hatte keinen Einfluss auf Gene, die an den vorgelagerten MVA- und MEP-Signalwegen beteiligt sind (Abb. 4b). Um sicherzustellen, dass die oben genannten Veränderungen in den Metaboliten durch 11 verursacht wurden, wurde für eine tiefergehende Analyse eine stabile Isotopenmarkierung eingesetzt. Der Einsatz des MEP-Inhibitors Fosmidomycin und der Einsatz der Genkanone zur Unterdrückung von TwTPS7(v2) und TwTPS27(v2) hemmten die Biosynthese von Vorläufern, wohingegen der Auslöser anschließend die Expression nachgeschalteter Gene erhöhte, wie sich bei der Verabreichung von 18O-11 zeigte zu den Zellen. Obwohl der native Stoffwechselweg nicht vollständig gehemmt wurde und endogenes 1 und 10 die Bestimmung isotopenmarkierter Produkte störten, fanden wir immer noch den Peak von 18O-markiertem Triptinin B (9) (Abb. 4c), das durch CYP71BE weiter laktonisiert werden könnte um das erwartete Zwischenprodukt 1012 zu erzeugen. Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigten, dass 11, das eine Carboxylgruppe aufweist, als Vorstufe im späten Stadium der 1-Biosynthese dient.

Bei Überexpression von CYP82D274 und CYP82D263 wurde auch eine 0,69-fache Abnahme von 8 und eine 1,45-fache Zunahme von Ferruginol (15) beobachtet, was auf andere katalytische Prozesse dieser beiden Gene hinzuweisen schien (Abb. 4e und ergänzende Daten 3). . Die Fermentation von Hefestämmen, die CYP82D274 oder CYP82D263 enthielten, und die anschließende Inkubation mit dem Zwischenprodukt 8 ergaben, dass CYP82D274 drei hydroxylierte Produkte mit einer Ladung von m/z + 16 erzeugte (Abb. 5a). Die Retentionszeit und die Massenspektralfragmentierung für das Hauptprodukt entsprachen dem authentischen Standard für die Derivatisierung von 9 (ergänzende Abbildung 12), was darauf hindeutet, dass CYP82D274 eine C-14-Hydroxylierungsrolle bei der Katalyse der Bildung von 9 aus 8 spielte Die Inkubation von Substrat 5 führte außerdem zu zwei unterschiedlichen Verhältnissen von C-14- und C-12-hydroxylierten Produkten (Abb. 5b und ergänzende Abb. 13). Für CYP82D274 wurde das Hauptprodukt 14 als 14-Hydroxy-Abietatrien mit geringen Mengen an 15 (12-Hydroxy-Abietatrien oder Ferruginol, ergänzende Abbildung 14) identifiziert. Bei CYP82D263 wurde 5 in das hydroxylierte Hauptprodukt 15 umgewandelt, begleitet von Spuren von 14.

eine GC-MS-Analyse methylierter Produkte mit Triptobenzol D (8) als Substrat. b GC-MS-Analyse der katalytischen Produkte von Miltiradien (5) in manipulierter Hefe. Die Ergebnisse des Massenspektrums sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 12 und 13. c Relative Ausbeute an Abietatrien (6) in Spontankulturen, CYP82D274- und CYP82D263-Kulturen. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (n = 3 biologisch unabhängige Replikate) dargestellt. d Katalytischer Prozess des CYP82D274- und CYP82D263-Stoffwechselgitters für die Triptolid (1)-Biosynthese. Ein durchgezogener Pfeil stellt eine identifizierte Reaktion dar und ein gepunkteter Pfeil zeigt eine unbekannte Reaktion an. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Es wurde wiederholt berichtet, dass die Umlagerung der Doppelbindung im C-Ring des Olefins 5, um stabiles aromatisiertes 627 zu ergeben, ein spontaner Reaktionsprozess ist14,28,29,30. In unserer Studie transformierten wir Plasmide in die manipulierte Hefe BY-PS216, die 5 als Substrat selbst produzieren konnte. Das Vorhandensein eines Doppelpeaks für 5 und 6 in CYP82D274 und CYP82D263 im Vergleich zum Einzelpeak für 5 im EV (Abb. 5b) deutete darauf hin, dass CYP82D274 und CYP82D263 in der Lage waren, die Aromatisierung von 5 zu 6 zu katalysieren. Dennoch haben wir gezeigt das Vorhandensein spontaner Reaktionen mit geringen Mengen an 6 (Abb. 5c), und wenn die Ausbeute von 6 im EV mit 1,00 angenommen wurde, betrug die relative Ausbeute von 6 in CYP82D274 180,09 und die in CYP82D263 23,89. Dieser Befund legt nahe, dass CYP82D274 und CYP82D263 die Aromatisierung von 5 spezifisch und effektiv katalysieren können, während andere Gene in derselben CYP82D-Unterfamilie dies nicht können (ergänzende Abbildung 15).

Basierend auf diesen Ergebnissen kommen wir zu dem Schluss, dass CYP82D274 und CYP82D263 wichtige Hydroxylierungs- und Aromatisierungsprozesse katalysieren und über mehrere Wege zur Biosynthese von 1 beitragen (Abb. 5d).

Im vorherigen Abschnitt haben wir gezeigt, dass das breite Substratspektrum von CYP82D274 die gleichzeitige Katalyse verschiedener Substrate ermöglicht und dass CYP728B70 die Reaktion von 5 unter Bildung von 716 katalysiert. Durch die Fütterung von Stämmen, die CYP728B70 enthalten, mit 14 wurde festgestellt, dass die Fermentationsprodukte beides Abietatrien enthielten -14,18-Diol (ein CYP728B70-katalysiertes Zwischenprodukt, 19) und 11 (ergänzende Abbildung 16)31, was darauf hindeutet, dass der Biosyntheseweg kein linearer und spezifischer Weg ist, sondern dass die Produkte über mehrere Wege gemeinsam durch einen Stoffwechsel erzeugt werden Gitter, ein Phänomen, das auch bei Forskolin und Tanshinonen gefunden wurde32,33.

Angesichts eines Stoffwechselnetzes mit mehreren Substraten sind die Substrataffinität und die katalytische Effizienz der Enzyme sehr unterschiedlich und können durch kinetische Parameter widergespiegelt werden34. Wir fanden heraus, dass die Km-Werte von CYP82D274 und CYP82D263 für die Katalyse von 7 0,99 ± 0,17 μM und 8,42 ± 1,89 μM betrugen (Abb. 3c), was auf ihre höhere Empfindlichkeit gegenüber 7 hinweist. Wir führten auch mikrosomale Experimente mit CYP82D274 und CYP82D263 in Gegenwart von durch NADPH, ein Redoxpartner, Cofaktoren und die Substrate 5 und 8. Die Ergebnisse zeigten, dass nur CYP82D274 5 katalysieren konnte, um kleine Mengen von 14 mit einem Km von 47,30 ± 12,98 μM zu produzieren (ergänzende Abbildung 10b), das Zielprodukt jedoch unter den Bedingungen von katalytischem 8 oder CYP82D263-katalysiertem 5 nicht nachgewiesen. Darüber hinaus betrugen die Vmax-Werte von CYP82D274 für die Katalyse von 7 und 5 140,30 ± 5,10 umol Produkt·min−1·(mmol Protein) −1 und 44,08 ± 6,13 Umol Produkt·min−1·(mmol Protein)−1 zeigten diese kinetischen Parameter, dass CYP82D274 eine höhere Präferenz für Substrat 7 aufweist.

Um den unbekannten Biosyntheseweg von 1 weiter zu untersuchen, wurde zunächst selbst hergestellte gentechnisch veränderte Hefe konstruiert, um ausreichende Mengen des Vorläufers 11 für das Gen-Mining bereitzustellen. CYP82D274 und CYP82D263 wurden zusammen mit CYP728B70 exprimiert, was darauf hindeutet, dass Hefe in der Lage ist, mehrere CYPs gleichzeitig zu exprimieren, um 11 zu produzieren (Abb. 6a und ergänzende Abb. 17). Um eine hohe Ausbeute von 11 zu erreichen, wurden drei Funktionsmodule entworfen und auf Optimierung untersucht. Von mehreren Spezies abgeleitete Diterpen-Synthasen bestätigten, dass tSmKSL1-CfTPS1 (die Fusion von verkürzter ent-Kauren-Synthase-ähnlicher 1 aus Salvia miltiorrhiza und Terpen-Synthase aus Coleus forskohlii) die effizienteste 5-Biosynthese war10. Der GGPP-Hochertragsstamm BY-HZ1610, tSmKSL1-CfTPS1 (Modul I) und der aktivere CYP82D274 (Modul III) wurden für die Produktion von 11 ausgewählt. In diesem Abschnitt verwendeten wir Strategien der synthetischen Biologie zur Optimierung genetischer Elemente und Fahrwerksbelastungen.

eine GC-MS-Analyse methylierter Produkte in CYP82D274 und CYP82D263, koexprimiert mit CYP728B70. b Screening nach optimalen Kombinationen von CYP und TwPOR. Optimale Gene sind rot markiert. ND bedeutet nicht erkannt. c Ausbeute von 11 in den manipulierten Stämmen. Die Bilder zeigen die Biomasse haploider und diploider Stämme unter den gleichen Kulturbedingungen. Das Genotypschema ist in der Abbildung dargestellt, detaillierte Informationen finden Sie in der Ergänzungstabelle 3. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (n = 3 biologisch unabhängige Replikate) dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Optimierung der Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen CYP und seinem Redoxpartner POR zur Verbesserung der Elektronentransfereffizienz kann die schlechte Kopplung von CYP-Systemen mildern und die Terpenoidproduktion steigern35. Da Modul II (Generation 7) als geschwindigkeitsbegrenzender Schritt wirkte und die Endproduktausbeute behinderte, wurde dieses Modul zunächst für die genetischen Elemente optimiert. Ein Vergleich der Ausbeuten aus mehreren Artenquellen ergab, dass natives POR im Allgemeinen die höchste Effizienz des Elektronentransfers aufweist36,37. Zwölf Enzymkombinationen (Ergänzungstabelle 2) mit verkürztem oder nicht verkürztem CYP728B70 und repräsentativen TwPORs38 (ohne TwPOR2, eine hohe Identität von 98,73 % mit TwPOR1) wurden in den Stamm BY-ZY1 transformiert. Die LC-MS/MS-Quantifizierung der Ausbeute von 11 zeigte, dass TwPOR3 und TwPOR4 mit intaktem CYP728B70 die höchsten Ausbeuten unter den Kombinationen aufwiesen, vermutlich aufgrund von Unterschieden in der Elektronentransferkapazität, die mit der phylogenetischen Klade von POR verbunden sind (ergänzende Abbildung 18)39 . Keine der sechs Kombinationen mit verkürzten TwPORs detektierte das Endprodukt, was darauf hindeutet, dass die intakte Transmembrandomäne für den Elektronentransfer essentiell ist. Darüber hinaus zeigte verkürztes CYP728B70 verringerte Ausbeuten, was darauf hindeutet, dass die vollständigen Transitpeptide für die Peptidtranslokation und -faltung wichtig sind. TwPOR3, das biostabiler ist, wurde als Elektronenshuttle mit einer Ausbeute von 11 entsprechend 2,23 μg·L−1 ausgewählt (Abb. 6b). Ein weiterer Ersatz von CYP728B70 durch CYP720B4 aus Picea sitchensis führte zu einer 17,10-fachen Steigerung der Ausbeute auf 49,43 μg·L−1 (Abb. 6b).

Anschließend wurde eine Optimierung der Fahrwerksbelastung durchgeführt. Chromosomenintegration und -diploidisierung sind vielversprechende Strategien zur Verbesserung der Stabilität und Expression heterologer Gene und damit zur Verbesserung der Fermentationsfähigkeit40,41. Wir haben die optimalen Gene (dh tSmKSL1-CfTPS1, CYP82D274 oder Mutanten CYP720B4 und TwPOR3) in den diploiden Stamm BY-ZY2D (Ergänzungstabelle 3) und den haploiden Stamm BY-HZ16 eingeführt. Diploide Stämme weisen höhere Zellwachstumsraten, Zellerträge und Toleranzen gegenüber verschiedenen Belastungen auf als haploide Stämme42. In dieser Studie haben wir verschiedene haploide und diploide Stämme quantitativ inokuliert und bestätigt, dass die diploiden Stämme unter identischen Fermentationsbedingungen etwa zwei- bis dreimal mehr Biomasse aufwiesen als die haploiden (Abb. 6c). Der diploide Stamm BY-ZY16D, in dem tSmKSL1-CfTPS1 und CYP82D247L234M in das Hefechromosom integriert waren und der ein induzierbares Plasmid pESC-LEU::(CYP720B4 + TwPOR3) trug, hatte die höchste Ausbeute unter den verglichenen Stämmen und die Ausbeute von 11 entsprach 343,87 μg·L−1, was 1,34-mal (P < 0,05) höher war als der des WT-Stamms BY-ZY15D und 6,78-mal (P < 0,01) höher als der des haploiden Stamms BY-ZY12H desselben Genotyps (Abb. 6c).

Triptolid (1) ist in wässrigen Lösungsmitteln weitgehend unlöslich; Analysen der Korrelation zwischen chemischer Struktur und Bioaktivität deuten jedoch darauf hin, dass die charakteristische Wasserstoffbindung an der C-14-Position die Schlüsselfunktion für ihre Antitumorwirkung durch selektive Alkylierung von Thiolgruppen des enzymvermittelten Tumorwachstums ist13,43,44. Eine weitere Modifikation der C-14-Position, die das früheste und vielfältigste Ziel war, führt nicht nur zu einer Erhöhung der Wasserlöslichkeit45, sondern auch zu einer Steigerung der Antitumoraktivität und einer geringeren Toxizität44; Infolgedessen wurden verschiedene Verbindungen, z. B. Minnelid (ClinicalTrials.gov: NCT03129139) und 14-Succinyltriptolid-Natriumsalz (PG490-88), in klinische Studien aufgenommen. Der Biosyntheseweg von 1 in einheimischen Pflanzen ist nach mehreren Jahren zum ersten Schritt der Skelettmodifikation fortgeschritten5,14,16. In dieser Studie haben wir den Mechanismus für die 14-Hydroxylierungsbildung aufgedeckt und die Beteiligung von Carboxylgruppen am Biosyntheseweg von 1 nachgewiesen. CYP82D274 und CYP82D263 fungieren als 14-Hydroxylasen, um das Stoffwechselnetz in der 1-Biosynthese zu katalysieren und weisen eine bessere Affinität und katalytische Effizienz auf für mehrere Zwischenprodukte in Richtung 7 (Abb. 5d). Frühere pharmakologische Studien zur chemischen Synthese von 11, dem Hauptprodukt von CYP82D274, das 7 katalysiert, haben dessen geringe zytotoxische Aktivität gezeigt, insbesondere bei akuter T-Zell-Leukämie beim Menschen31. Mithilfe synthetischer Biologiestrategien wurde das Zwischenprodukt 11 erfolgreich in Hefe mit einer Schüttelkolbenausbeute von 343,87 μg·L−1 hergestellt, um nicht nur pharmakologisch aktive Produkte auf umweltfreundliche Weise zu erhalten, sondern auch die Gewinnung rätselhafter Signalweggene zu erleichtern.

Insbesondere CYP82D274 und CYP82D263 können die Aromatisierung von 5 zu 6 katalysieren (Abb. 5), ein Prozess, der zuvor als spontane Reaktion8,15,28 beschrieben wurde und zum weit verbreiteten Vorhandensein von Tanshinonen, Carnosinsäure, Carnosol, und andere Diterpenoide vom Labdan- oder Abietan-Typ. Wir haben gezeigt, dass funktionalisiertes CYP82D274 und CYP82D263 die Ausbeute des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms und damit die heterologe Produktion von Endprodukten steigern können (Abb. 6a). Man kann davon ausgehen, dass die Einführung von CYP82D274 und CYP82D263 in andere von 5 abgeleitete Stoffwechselwege den Zugang zu den Zielprodukten wirksam verbessern könnte. Darüber hinaus könnte die umfassende C-14-Hydroxylierungsfunktion von CYP82D274 effektiv das notwendige alternative genetische Element und synthetische Vorläufer für diese pharmakologisch wichtigen Naturstoffe und Derivate bereitstellen, beispielsweise Gerardianin A aus Isodon lophanthoides46.

CYP82D274 und CYP82D263, die in dieser Studie identifiziert wurden, befinden sich auf einem Tandem-Duplikationsgencluster auf Chr12, der 11 Gene der CYP82D-Unterfamilie enthält (Abb. 2a), die vermutlich aus LTRs des Retrotransposons (Klasse-I-Element) stammen, die durch intrachromosomale Replikationsumlagerungen erzeugt werden. Aufgrund der evolutionären Divergenz wird die folgende Hypothese vorgeschlagen. In Clade I produzierte die erste Duplikation von neofunktionellem CYP82D CYP82D274, und dann kam es zu einer Genduplikation und Übertragung von TW08G01036.1 (CYP82D213) über ein Transposon von Chr12 auf Chr08; Darüber hinaus erzeugte die Duplizierung von CYP82D274 TW12G01156.1, das sich dann duplizierte, um eine TW12G01165.1-Umordnung am anderen Ende des Tandem-Arrays zu erzeugen. Berichten zufolge übernimmt CYP82D213 im letzten Schritt von Triptonid12 die Triepoxidierungsfunktion, was darauf hindeutet, dass es nach der Trennung von CYP82D274 einer Neofunktionalisierung unterzogen wurde. In Clade II folgt die Duplikationsreihenfolge TW12G01157.1, TW12G01158.1 und CYP82D263 (ergänzende Abbildung 19).

Gene der CYP82D-Unterfamilie kommen häufig in der Flavonoid-Biosynthese vor. SbCYP82D1.1 in Scutellaria baicalensis fungiert als Flavon-6-Hydroxylase (F6H) bei der Katalyse von Chrysin, während SbCYP82D2 als Flavon-8-Hydroxylase (F8H) fungiert47. Ein Vergleich von acht orthologen Genpaaren von CYP82Ds in den Genomen von S. barbata und S. baicalensis ergab das Vorhandensein der F6H-Tandem-Gencluster SbaiCYP82D1-SbaiCYP82D7-SbaiCYP82D8 und SbarCYP82D1-SbarCYP82D6-SbarCYP82D8 auf Chr06 in beiden Arten mit chromosomalen Lokalisierungsabständen von <30 kb. Insbesondere CYP82D8 zeigte eine Gensyntenie zwischen den Arten, was auf eine konservierte und artspezifische Genentwicklung hinweist48. Zusätzlich zu Flavonoiden wurde berichtet, dass CYP82Ds an der Biosynthese von Furanocumarin, Isopimpinellin49, Lignan (-)−4'-Desmethylepipodophyllotoxin50 und Sesquiterpenoid Gossypol21 beteiligt sind. Sowohl CYP82D213 als auch die beiden in der vorliegenden Studie beschriebenen CYP82D-Gene sind an der Biosynthese von Diterpenoiden beteiligt, und die Konstruktion eines phylogenetischen Baums mit unterschiedlichen Funktionen (Abb. 7) ergab eine klare phylogenetische Differenzierung von CYP82Ds, die an verschiedenen Arten von Verbindungen beteiligt sind, was auch der Fall sein kann als Leitfaden für zukünftige Forschungsrichtungen zu CYP82Ds mit unbekannter Funktion verwendet werden.

Insgesamt wurden 61 CYP82Ds aus Flavonoiden, Furanocumarinen, Lignanen, Fettsäuren, Sesquiterpenoiden, Diterpenoiden usw. einbezogen und durch unterschiedliche Farben gekennzeichnet. Die phylogenetische Analyse wurde mit der MEGA 6.0-Software mit der Maximum-Likelihood-Methode (1000 Bootstraps) durchgeführt. Die beiden funktionellen CYP82Ds in dieser Studie sind mit roten Dreiecken markiert. Die GenBank-Zugangsnummern finden Sie in den Zusatzdaten 6.

Kürzlich wurde über einen minimalen Satz von vier Genen aus den Unterfamilien CYP71BE und CYP82D berichtet, die für die Bildung von Triptonid aus 5 erforderlich sind12, und diese stellen zweifellos eine alternative und einfache Möglichkeit dar, den Carboxylierungsschritt zu umgehen und Triptonid in heterologen Wirten zu erhalten. Allerdings bleibt unklar, ob es sich um einen reinen Biosyntheseweg oder um einen verzweigten Stoffwechselweg in den heimischen Pflanzen handelt. Hier haben wir die Beteiligung von Carboxylgruppen am Biosyntheseweg von 1 durch Experimente mit Pflanzenzellen bestätigt. Aus heutiger Sicht ist die C-18-Carboxylbildung der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, der für die extrem niedrigen Konzentrationen von 1 in T. wilfordii verantwortlich ist, und die Gattung Tripterygium enthält viele aktive Naturstoffe mit Carboxyl- oder Carbonylgruppen an C-18 oder C-18. 193,26. Die Verbesserung der Proteinaktivität ist für die Verbesserung der Ausbeute an Carboxyl-bezogenen Metaboliten von entscheidender Bedeutung. Der Mechanismus der Carboxylverschiebung muss auch für die Biosynthese von 1 untersucht werden.

Zusammenfassend deckte unsere Studie die Schlüsselenzyme für das C-14-Hydroxylierungs-Stoffwechselgitter von 1 auf, charakterisierte die Hydroxylierungs- und Aromatisierungsfunktionen von tandemdupliziertem CYP82D274 und CYP82D263 und erreichte erfolgreich die De-novo-Biosynthese des Vorläufers 11 in Hefe. Die Aufklärung des Bildungsmechanismus der C-14-Hydroxylierung liefert nicht nur wichtige genetische Elemente für die synthetische biologische Produktion von 1, sondern ist auch nützlich, um die Biosynthesewege anderer Verbindungen vom Labdan-Typ mit C-14-Hydroxylierung aufzudecken.

T. wilfordii-Suspensionszellen wurden in Murashige & Skoog (MS) mit Vitamin-Medium (Caisson Lab, USA) kultiviert, das 30 g·L-1 Saccharose mit 0,5 mg·L-1 Indol-3-buttersäure (IBA), 0,5 mg, enthielt ·L−1 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und 0,1 mg·L−1 Kinetin (KT), und der endgültige pH-Wert wurde auf 5,8 eingestellt. Suspensionszellen wurden bei 25 °C im Dunkeln unter Schütteln bei 120 U/min gezüchtet51. Insgesamt sieben vier Jahre alte T. wilfordii-Pflanzen (Nr. 164–170) wurden in der Stadt Taoyuan, Kreis Datian, Stadt Sanming, Fujian, China, gesammelt. Die geografischen Koordinaten waren E117°31′44″, N25°49′29″ und die Höhe betrug 908 m. Die chemischen Standards 7, 10 und 13 wurden von Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) und 9 und 15 von BioBioPha Co., Ltd. (Yunnan, China) bezogen. Verbindung 8 wurde freundlicherweise von Prof. Fei Li vom Kunming Institute of Botany der Chinesischen Akademie der Wissenschaften zur Verfügung gestellt und 5, 6, 11 und 14 wurden aus angereicherten Fermentationsprodukten isoliert.

Der in dieser Studie verwendete ursprüngliche Hefestamm war BY-HZ16 (MATα; trp1Δ0; leu2Δ0; lys2Δ0; ura3Δ0; rox1Δ; yjl064wΔ; ypl062wΔ; erg9::Δ−218-−175; trp1::HIS3-PPGK1-BTS1/ERG20- TADH1-PTDH3-SaGGPS-TTPI1-PTEF1-tHMG1-TCYC1)10. Die manipulierten Hefestämme sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. Für die Klonierung und Plasmidkonstruktion wurde Escherichia coli Trans1-T1 (TransGen Biotech, China) verwendet. Die Shuttle-Vektoren waren pESC-LEU, pESC-TRP (Agilent Technologies, USA) und pYES2 (Invitrogen, USA). Das synthetische Dropout-Medium (SD) (FunGenome, China) wurde entsprechend dem Auxotroph und den getragenen Plasmiden ausgewählt. Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) und YPL-Medien bestanden aus 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton (OXOID, UK) und 2 % D-( + )-Glucose (Glc, Sigma-Aldrich, USA) für YPD oder 2 % D-( + )-Galactose (Gal, Inalco Sp A, Italien) für YPL.

Um mehr Chromosomeninformationen zu CYP82Ds zu erhalten, wurde die BioEdit-Software (Version 7.0.9.0) verwendet, um den offenen Leserahmen (ORF) von CYP82Ds aus dem gesamten Genom über die lokale BLAST-Funktion zu durchsuchen. Eine Sequenz mit einer „blastn“-Identität von mehr als oder gleich 99 % wurde als ein Gen betrachtet und Gene mit einer Ähnlichkeit von mehr als 50 % wurden aufgezeichnet. Jedes CYP82D wurde letztendlich durch Chromosomenlokalisierung identifiziert. Eine phylogenetische Analyse wurde mit der MEGA 6.0-Software durchgeführt, um die CYP82D-Sequenzen mithilfe der ClustalW-Funktion auszurichten, und die Maximum-Likelihood-Methode (1000 Bootstraps) wurde verwendet, um einen phylogenetischen Baum zu erstellen. Insgesamt wurden 3n verschiedene Websites entfernt und die Online-Konvertierungssoftware ALTER (http://www.sing-group.org/ALTER/) und die Software KaKs_Calculator 2.0 wurden zur Berechnung der nicht-synonymen Substitutionsraten (Ka) und synonymen Substitutionsraten ( Ks) und Ka/Ks in der Linux-Betriebssystemumgebung.

CYPs wurden aus der PFAM-Datenbank abgerufen und als Cytochrom P450 (PF00067) annotiert. Eine Heatmap der Genexpression wurde mit MultiExperiment Viewer (MeV, Version 4.9.0) und Java 8-Software erstellt. Die RPKM-Messungen des Wurzelperiderms, des Wurzelphloems, des Wurzelxylems, des Stammgefäßbündels, des Stammperiderms und des Blattes stammten aus früheren Gewebetranskriptomen (NCBI SRA-Nummer SRP199495, ergänzende Abbildung 20)16, und die Daten wurden normalisiert und hierarchisch verarbeitet Clusteranalyse mit Pearson-Korrelation. CYPs mit Genexpressionsprofilen, die denen von TwTPS7(v2), TwTPS27(v2) und CYP728B70 ähneln, wurden als Kandidaten-CYPs für die weitere Analyse ausgewählt. Die Kandidaten-CYPs wurden unter Verwendung von 2×Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs, USA) und cDNA der T. wilfordii-Wurzel als Matrize amplifiziert, die nach vollständiger Sequenzierung mit dem Transkriptom übereinstimmte (Supplementary Data 5).

Kandidaten-CYPs wurden in das Hochkopie-Plasmid pESC-LEU integriert, das TwPOR3 vom GAL1-Promotor und CYP vom GAL10-Promotor exprimierte (Supplementary Data 5). Die rekombinanten Plasmide wurden in den Hefestamm BY4741 transformiert und pESC-LEU mit TwPOR3 als leere Vektorkontrolle eingesetzt. Für den In-vivo-Assay wurde SD-Medium ohne Tyrosin und Leucin (SD-Trp-Leu) und 2 % Glc verwendet, um positive Stämme auszuwählen, und 2 % Gal wurden zu 20 ml SD-Trp-Leu für die Fermentation frischer Stämme hinzugefügt Zellen in einem Schüttler bei 30 °C und 200 U/min für 12 Stunden. Nach der Zufuhr von 7 oder 8 bis zu einer Endkonzentration von 50 μM wurde die resultierende Mischung weitere 48–60 Stunden lang fermentiert und anschließend wurde eine Ultraschallextraktion der Fermentationsprodukte mit einem gleichen Volumen Ethylacetat zweimal für jeweils 1 Stunde durchgeführt. Für den In-vitro-Test wurden Mikrosomen gemäß dem folgenden experimentellen Verfahren extrahiert. Der Basispuffer TE (pH 7,5) bestand aus 50 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA. Die Zellen wurden durch 3-minütige Zentrifugation bei 4000 × g gesammelt, in TEK (0,1 M KCl in TE) resuspendiert und 10 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugation gesammelt und in vorgekühltem TESB (0,6 M Sorbitol in TE) resuspendiert. Die Zellen wurden mit einem kryogenen Homogenisator (ATS, Kanada) für 3–5 Zyklen vollständig zerkleinert. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 12.000 × g wurden die Mikrosomen durch Zugabe von NaCl in einer Endkonzentration von 0,15 M und Polyethylenglykol PEG4000 in einer Endkonzentration von 0,1 g·mL−1 zum Überstand ausgefällt. Die Pellets wurden zur Konservierung und für katalytische Reaktionen in TEG (20 % (v/v) Glycerin in TE) resuspendiert32. Der enzymatische Assay wurde in einem 500-μL-System durchgeführt, das 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH), 4 mM Glucose-6-phosphat, 1 Einheit Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, 5 μM Flavinmononukleotid, 5 μM Flavinadenindinukleotid, 1 mM Dithiothreitol, 0,5 mg mikrosomales Protein und 100 μM Substrat, das 20 Stunden lang bei 30 °C unter Schütteln bei 100 U/min im Dunkeln inkubiert und dann mit 500 μL extrahiert wurde dreimal Ethylacetat. Die organischen Phasen sowohl der In-vivo- als auch der In-vitro-Proben wurden getrocknet, mit Methanol rekonstituiert und dann mit Trimethylsilyldiazomethan (Tokyo Chemical Industry, Japan) derivatisiert52. Die methylierten Proben wurden für die GC-TQ-MS/MS-Analyse mit Ethylacetat gelöst. Für die 5-katalysierte Reaktion wurde das Plasmid in gentechnisch verändertes Hefe-BY-PS2 transformiert (Ergänzungstabelle 3).

Stämme, die das Plasmid pESC-LEU::(CYP82D274 + TwPOR3) enthielten, wurden in 500 ml SD-Trp-Leu + 2 % Glc-Flüssigkeitsmedium inokuliert und bei 30 °C und 200 U/min bis zu einer OD600 von ~10 gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, gleichmäßig in zwanzig 2-L-Kolben mit 500 ml YPL und 100 μM Substrat 7 verteilt und dann 72 Stunden lang bei 30 °C und 200 U/min fermentiert. Anschließend wurden in einer sterilen Umgebung 15–20 g HP2MGL-Harz (Mitsubishi, Japan) in jeden Kolben gegeben und das Fermentationsprodukt weitere 24 Stunden lang in einem Schüttler bei 200 U/min extrahiert.

Zehn Liter Fermentationsbrühe wurden 5 Minuten lang bei 4000 × g zentrifugiert, und die Hefezellen und das Harz wurden gesammelt und in einem Ofen bei 40 °C getrocknet. Das achtfache Volumen an wasserfreiem Methanol wurde zugegeben und das katalytische Produkt durch Ultraschallbehandlung bei niedriger Temperatur für 30 Minuten extrahiert. Die Feststoffe wurden wiederholt extrahiert, bis der wasserfreie Methanolextrakt farblos war. Die Extrakte wurden filtriert, um Harz- und Zellreste zu entfernen, und unter Vakuum bei 40 °C eingedampft. Die Produkte wurden mit 4 ml Methanol in Chromatographiequalität gelöst und in eine semipräparative HPLC vom Typ Gilson 281 eingebracht, die mit einer H322-Pumpe, einem GX-281-Autosampler, einem 156-UV-Detektor mit zwei Wellenlängen und einer Trilution LC 2.1-Workstation verbunden war. Es wurde eine Xtimate C18-Säule (30 mm × 75 mm × 3,0 μm, Welch) mit 0,1 % Trifluoressigsäure-Wasser (mobile Phase A) und Acetonitril (mobile Phase B) verwendet. Die Gradientenelution wurde mit 50 % B begonnen und dann innerhalb von 8,0 Minuten auf 100 % B erhöht, die Flussrate wurde auf 25 ml·min−1 eingestellt und das Injektionsvolumen betrug 500 μl. Die Produktfraktionen wurden nach 7,4–7,8 Minuten gesammelt und gefriergetrocknet. Drei Milligramm Produktpulver wurden genau abgewogen und vollständig in 500 μl deuteriertem Aceton (C3D6O, InnoChem, China) gelöst. Zur Charakterisierung der chemischen Struktur wurden 1H-NMR (800 M), 13C-NMR (200 M), NOESY, HSQC und 1H-1H COSY mit einem Bruker Avance III HD (Bruker BioSpin, Deutschland) analysiert. Zur Analyse der Daten wurde die Software MestReNova 14 verwendet.

Die CYP-Konzentration wurde durch Messung des reduzierten Kohlenmonoxid-Differenzspektrums unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten (450 gegenüber 490 nm) von 91 mM−1·cm−153 geschätzt. Es wurden Inkubationszeiten von 0,5 bis 8 Stunden verwendet. Die Km-Werte wurden unter Verwendung serieller Konzentrationen von 0,1 bis 100 μM für 7 und 5 bis 80 μM für 5 in 300-μL-Enzymtests bestimmt. Diese enthielten außerdem ~0,4 mg mikrosomales Protein, Tris-HCl (pH 7,5), NADPH und das oben erwähnte Regenerationssystem. Die Reaktionen wurden durch Substratzugabe gestartet und unter Schütteln 30 Minuten lang bei 30 °C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde die Extraktion dreimal mit 300 μL Ethylacetat beendet und die Extrakte mit einem Vakuumkonzentrator (Eppendorf Concentrator plus, Deutschland) vollständig getrocknet. Das Produkt 11 wurde unter Verwendung von 100 μl Methanol, gelöst für die LC-TQ-MS/MS-Analyse, quantifiziert, und das Produkt 14 wurde in 100 μl Ethylacetat zur Quantifizierung mittels GC-MS gelöst. Die Km-Werte wurden durch nichtlineare Regression mit GraphPad Prism Version 7 berechnet.

Die spezifischen Fragmente von CYP82D274 und CYP82D263 wurden durch Mehrfachsequenz-Alignment aller CYP82D-Nukleinsäuresequenzen in T. wilfordii ausgewählt. Die spezifischen Fragmente (Supplementary Data 5) wurden in die binären Vektoren pH7WG2D (für OE) und pK7GWIWG2D (für RNAi) eingefügt. Mithilfe der entwickelten Genkanonentechnologie25,52 wurden rekombinante Plasmide in Suspensionszellen transformiert, die 7 Tage lang vorkultiviert und dann weitere 7 Tage lang kultiviert wurden, um Proben zu sammeln. Die RNA-Extraktion und die reverse Transkription wurden mit dem Total RNA Extraction Kit (Promega, China) und dem FastQuant RT Kit (Tiangen Biotech, China)51 durchgeführt und die Genexpression wurde mit qRT-PCR (Supplementary Data 5) nachgewiesen. Zwanzig Milligramm gefriergetrocknetes Probenpulver wurden genau abgewogen, über Nacht bei 4 °C in 1 ml 80 % (v/v) Methanol eingeweicht und 1 Stunde lang bei 25 °C einer Ultraschallbehandlung mit 40 kHz unterzogen. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 13.000 × g wurde der Überstand durch eine mikroporöse 0,22-μm-PTFE-Membran filtriert, um die Proben für Q Exactive HF LC‒MS/MS zu erhalten.

Die Substratfütterung erfolgte durch Einweichen von 0,2 g Suspensionszellen mit 1 ml MS-Medium mit 0,8 mM 11 für 7 Tage vor der Probenahme, und die Negativkontrolle wurde mit einem gleichen Volumen MS-Flüssigkeit eingeweicht. Für den stabilen Isotopenmarkierungstest wurde 18O-11 erhalten, indem das obige mikrosomale Testsystem auf 600 ml erweitert und 16O2 vollständig durch 18O2 (Reinheit > 97 %) vor der Zugabe von Substrat 7 und nach einer Stunde Reaktion mit einem gleichen Volumen ersetzt wurde Ethylacetat wurde dreimal extrahiert und anschließend einer Produktanreicherung und -isolierung unterzogen. Das gereinigte 18O-11 wurde mittels LC-qTOF-MS bestimmt. Nach 5-tägiger Genkanonenbombardierung von TwTPS7 und TwTPS27-RNAi (Supplementary Data 5) wurden ~0,2 g Zellen 5 Tage lang in 1 ml MS-Medium mit 0,4 mM 18O-11 und 100 μM Fosmidomycin eingeweicht und dann nach 2 Tagen Proben entnommen Induktion mit 50 μM Methyljasmonat. Als Kontrollen wurden gleiche Konzentrationen von unmarkiertem 11 mit identischer Behandlung und WT-Zellen verwendet. Drei biologische Replikate jeder Gruppe wurden in das Experiment einbezogen. Die Metabolitenextraktion wurde wie oben beschrieben durchgeführt, mit Q Exactive HF LC‒MS/MS für quantitative Tests und LC-qTOF-MS für qualitative Tests.

Für die CYP-Koexpression wurden die rekombinanten Plasmide pESC-LEU::(CYP82Ds + TwPOR3) und pESC-TRP::(CYP728B70 + TwPOR3) zusammen oder getrennt chemisch in den Hefestamm BY-PS2 transformiert. Zur Selektion und Fermentation wurde ein entsprechendes auxotrophes Medium eingesetzt, die Produkte mit Ethylacetat extrahiert und per GC-MS nachgewiesen. Für das Screening von CYP- und POR-Kombinationen wurde das rekombinante Plasmid pYES2:: (PTDH3-tSmKSL1-CfTPS1-TTPI1-PADH1-CYP82D274-TPGI) unter Verwendung der homologen Rekombination des BY-HZ16-Stammes konstruiert (Supplementary Data 5), ​​um BY-ZY1 zu erzeugen Beanspruchung. Verkürzte Transitpeptide (50 Aminosäuren am N-Terminus, vorhergesagt von TargetP Server v2.0) oder vollständiges CYP728B70 wurden an der Multiple Cloning Site (MCS) 1 konstruiert, und eine verkürzte Transmembrandomäne (67 Aminosäuren für TwPOR1 und 46 Aminosäuren für TwPOR3 und TwPOR4, vorhergesagt von TMHMM Server v2.0) oder vollständiges TwPOR wurde bei MCS2 von pESC-LEU integriert (Supplementary Data 5). Zwölf Enzymkombinationen (Ergänzungstabelle 2) wurden in den Stamm BY-ZY1 transformiert. Zur Optimierung des Chassis-Stammes wurden die haploiden Stämme BY4741H (Ergänzungstabelle 3) und BY-HZ16 in die jeweiligen Medien eingeimpft und 24 Stunden bei 30 °C und 200 U/min inkubiert. Die beiden Stämme wurden in SD-His-Trp, ergänzt mit 2 % Glc-Flüssigmedium, bei gleicher OD gemischt und weitere 24 Stunden lang kokultiviert. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen gesammelt und auf SD-His-Trp mit 2 % Glc-Feststoffplatten beschichtet und 72 Stunden lang bei 30 °C inkubiert, und die monoklonalen Stämme wurden ausgewählt. Der neu konstruierte diploide Stamm wurde identifiziert und BY-ZY2D genannt. Die Module tSmKSL1-CfTPS1 und CYP82D274 (oder Mutanten) wurden geklont und mithilfe der modularisierten zweistufigen Chromosomenintegrationstechnik54 unter Verwendung von Ura3 als Selektionsmarker in den Chromosom-Locus YPRCΔ15 des haploiden Stammes BY-HZ16 und des diploiden Stammes BY-ZY2D integriert (ergänzende Abb. 21 und ergänzende Daten 5). Anschließend wurde pESC-LEU::(CYP720B4 + TwPOR3) chemisch transformiert, um BY-ZY11H zu ZY14H (haploide Stämme) und BY-ZY15D zu ZY18D (diploide Stämme) zu erzeugen (Ergänzungstabelle 3). Zur quantitativen Inokulation wurde der Samenstamm in 20 ml frisches Medium mit einer quantitativen OD von 0,1 überführt und drei biologische Replikate jeder Gruppe in das Experiment einbezogen. Das Produkt wurde mit einem gleichen Volumen n-Hexan extrahiert und in 100 μl Methanol für LC-TQ-MS/MS gelöst.

Die Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung (MALDI-MSI) ist eine markierungsfreie Technik zur Bildgebung von Gewebeproben, die die Lokalisierung bekannter oder unbekannter biologischer Moleküle in einem räumlichen Bereich innerhalb subzellulärer Kompartimente ermöglicht. Die Probe wird gerastert, während ein Laser als stationäre Ionisationsquelle verwendet wird, und das Massenspektrum wird zur Aufzeichnung und Umwandlung der Ionensignalintensität und zum anschließenden Zeichnen der XY-Koordinate verwendet, wodurch die räumliche Verteilung des interessierenden Ions zur Visualisierung ermöglicht wird55,56. Zur Kartierung der Zielmoleküle in der Wurzel von T. wilfordii wurde MALDI-MSI mit hoher Abdeckung eingesetzt. Die frische Wurzel wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und dann über 8 Stunden lang bei –80 °C gehalten. Das Wurzelgewebe wurde auf einem Kryostat-Mikrotom (CM3050S, Leica Biosystems, Deutschland) in einer Umgebung von –20 °C kryogeschnitten und an der leitfähigen Seite eines mit Indiumzinnoxid (ITO) beschichteten Glasobjektträgers (Bruker, Deuschland). Der Glasobjektträger wurde in einem Vakuumexsikkator aufbewahrt und 30 Minuten lang getrocknet. Anschließend wurde nach dem Vorexperiment 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) als Matrix im Positivionenmodus ausgewählt und mit einem HTXTM-Sprayer (HTX Technologies, USA) gleichmäßig auf die Oberfläche des Objektträgers gesprüht. MALDI-MSI wurde mit einem timsTOF fleXTM-Massenspektrometer (Bruker) durchgeführt und die Parametereinstellungen waren wie folgt. Die Laserfrequenz und die akkumulierten Schüsse wurden auf 10.000 Hz bzw. 500 Schüsse eingestellt, die räumliche Auflösung betrug 50 μm und das Zielprofil betrug 18,70 μm. Die Rohdaten der Massenspektren wurden über den m/z-Bereich von 200–1000 erfasst. Zur Analyse der MALDI-Bilddaten und zur Visualisierung der m/z-Werte wurden ein Bruker SCiLS Lab 2020a-Instrument und die MetaboScape-Software verwendet.

GC-TQ-MS/MS wurde auf einem Agilent 7890B GC-System durchgeführt, das mit einem 7000 C GC/MS Triple Quad ausgestattet war. Für die DB-5MS-Kapillarsäule (15 m × 0,25 mm × 0,1 μm) wurde eine Splitless-Injektion bei 250 °C durchgeführt. Die Temperatur des GC-Ofens wurde nach folgendem Programm eingestellt: Eine Anfangstemperatur von 50 °C wurde 1 Minute lang aufrechterhalten, gefolgt von einem Anstieg auf 200 °C mit einer Geschwindigkeit von 40 °C·min−1, also einem Anstieg auf 240 °C C mit einer Geschwindigkeit von 20 °C·min−1, ein Anstieg auf 246 °C mit einer Geschwindigkeit von 1,5 °C·min−1 und ein Anstieg auf 300 °C mit einer Geschwindigkeit von 40 °C·min−1, wobei die Endtemperatur 3 Min. gehalten wird. Für die DB-5MS-Säule (30 m × 0,25 mm × 0,1 μm) war das Ofentemperaturprogramm wie folgt: 50 °C isotherm für 1 Minute, erhöht auf 240 °C bei 50 °C·min−1, erhöht auf 255 °C bei 1,5 °C·min−1, auf 300 °C bei 50 °C·min−1 erhöht und 1 Minute lang auf der Endtemperatur gehalten. Als Trägergas wurde Helium mit einer Flussrate von 1 mL·min−1 verwendet. Die Einlasstemperatur wurde auf 300 °C eingestellt, die Ionenfallentemperatur betrug 250 °C, die Elektronenenergie betrug 70 eV und die Spektren wurden über einen Bereich von 10–400 m/z aufgezeichnet. Für die Datenanalyse wurde die Software Qualitative Analysis (B.07.00) verwendet.

LC-TQ-MS/MS wurde mit einem Agilent 1290 Infinity LC Tandem QTRAP 6500 MS (AB SCIEX) durchgeführt. Wir verwendeten eine ACQUITY UPLC HSS T3-Säule (2,1 mm × 100 mm × 1,8 μm, Waters) mit 0,1 % Ameisensäure-Wasser als mobile Phase A und Acetonitril als mobile Phase B. Es wurde eine Flussrate von 0,3 ml·min−1 verwendet , und das Gradientenprogramm war wie folgt: 0–1 Minute, 40 % B; 2–3 Min., 90 % B; und 5–6 Minuten, 40 % B. In jedem Lauf wurden 3 μl der Probe analysiert und die Säulentemperatur betrug 40 °C. Die quantitativen Ionen für das Multiple Reaction Monitoring (MRM) 11 betrugen 315 und 269 m/z.

Q Exactive HF LC-MS/MS (Thermo Scientific) wurde auf einer ACQUITY UPLC HSS T3-Säule (2,1 mm × 100 mm × 1,8 μm, Waters) mit 0,1 % Ameisensäure-Wasser als mobile Phase A und Acetonitril als mobile Phase B durchgeführt Es wurde eine Flussrate von 0,4 ml·min−1 verwendet und das Gradientenprogramm war wie folgt: 0–4 Minuten, 30–34 % B; 4–8 Min., 34–52 % B; 8–12 Min., 52 % B; 12–23 Min., 52–77 % B; und 23–26 Minuten, 90 % B. In jedem Lauf wurden 2 μl der Probe analysiert und die Säulentemperatur betrug 40 °C. Bei Anwendung der Mutterionen-Quantifizierungsmethode wurde für verschiedene Metaboliten entweder der positive oder der negative Ionenmodus verwendet.

LC-qTOF-MS (Waters) wurde auf einer ACQUITY UPLC HSS T3-Säule (2,1 mm × 100 mm × 1,8 μm, Waters) mit 0,1 % Ameisensäure-Wasser als mobile Phase A und Acetonitril als mobile Phase B durchgeführt. Das Gradientenprogramm war wie folgt: 0–0,5 min, 20 % B; 0,5–21 Min., 20–85 % B; 21–23 Min., 85–100 % B; 23–26 Min., 100 % B; 26–27 Min., linearer Abfall von 100 auf 20 % B; und 27–30 min, isokratische 20 % B. Die Flussrate wurde auf 0,4 ml·min−1 eingestellt. Massenspektren wurden im Positiv-/Negativionenmodus über einen Scanbereich von m/z 50–1200 mit einer Scanzeit von 0,2 s aufgenommen. Die MS-Einstellungen waren wie folgt: Auflösungsanalysatormodus; normaler Dynamikbereich; Rampenkollisionsenergie 10-50 V; Kegelspannung 40 V. Für die Datenanalyse wurde MassLynx v4.2 verwendet.

Primer (Supplementary Data 5), ​​cDNA und Reagenzien wurden gemäß den Anweisungen von TransStart Top Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) hinzugefügt. QuantStudio5 (Applied Biosystems) wurde verwendet, um die Expression von Genen zu testen, und jede Reaktion wurde dreimal wiederholt. Die gemischten Reagenzien wurden zunächst 30 s lang bei 94 °C aktiviert, dann erfolgte die Denaturierung 5 s lang bei 94 °C, gefolgt von 15 s langem Annealing bei 56 °C und einer 10 s langen Verlängerung bei 72 °C. Dieser Vorgang wurde 45 Zyklen lang wiederholt, gefolgt von der Dissoziationsphase. Als Housekeeping-Referenzgen wurde EFLα (Supplementary Data 5) verwendet. Die relative Expression von Genen wurde mit der 2-ΔΔCt-Methode57 analysiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Genom- und Transkriptomsequenzdaten sind unter NCBI BioProject PRJNA542587 verfügbar. Die vollständigen Sequenzen von CYP82D274 (Zugang XP_038717985) und CYP82D263 (Zugang XP_038716720) sind in der GenBank hinterlegt. Die Datenbanken von TargetP v2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0) und TMHMM v2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? Für Datenanalysen werden TMHMM-2.0) verwendet. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Prof. Juan Guo vom National Resource Center for Chinese Materia Medica für das Schreiben und die experimentelle Anleitung. Wir danken Dr. Pengfei Li und Kairong Wu von Bruker (Beijing) Scientific Technology Co., Ltd für MALDI-MSI. Wir danken Dr. Yaqiu Zhao vom National Resource Center for Chinese Materia Medica für die Unterstützung bei der isotopenmarkierten Verbindung. Wir danken Dr. David Nelson von der University of Tennessee für die Zuweisung der CYP-Nomenklatur. Wir danken Prof. Fei Li vom Kunming Institute of Botany für die Bereitstellung chemischer Standards. Diese Arbeit wurde vom National Key R&D Program of China (2020YFA0908000) an LH und WG, dem Innovation Team and Talents Cultivation Program der National Administration of Traditional Chinese Medicine (ZYYCXTD-D-202005) an WG, der National Natural Science Foundation von, unterstützt China (82204547), das Schlüsselprojekt auf zentraler Regierungsebene: Die Fähigkeit zur nachhaltigen Nutzung wertvoller Ressourcen der chinesischen Medizin (2060302) und die Grundlagenforschungsfonds für die zentralen öffentlichen Wohlfahrtsforschungsinstitute (ZZXT202206) an WG und Yi.Z.

Verstorben: Wei Gao.

Staatliches Schlüssellabor für Dao-di-Kräuter, Nationales Ressourcenzentrum für chinesische Materia Medica, Chinesische Akademie der Chinesischen Medizinischen Wissenschaften, Peking, China

Yifeng Zhang, Jie Gao, Ping Su, Yujun Zhao und Luqi Huang

Schule für Traditionelle Chinesische Medizin, Capital Medical University, Peking, China

Yifeng Zhang, Jie Gao, Lin Ma, Xiaoyi Wu, Yuan Liu, Yan Yin, Huan Zhao, Yun Lu, Jiadian Wang und Wei Gao

Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Peking, China

Yifeng Zhang & Wei Gao

Schlüssellabor für neuartige Targets und Arzneimittelstudien zur neuronalen Reparatur der Provinz Zhejiang, Medizinische Fakultät, Zhejiang University City College, Hangzhou, China

Lichan Tu

Fakultät für Pharmazie, Hangzhou Normal University, Hangzhou, China

Tianyuan Hu

Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, Capital Medical University, Peking, China

Dan Li & Yuru Tong

Hochschule für Biotechnologie und Bioingenieurwesen, Technische Universität Zhejiang, Hangzhou, China

Jiawei Zhou

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Yi.Z., WG und LH haben die Studie konzipiert und initiiert. Yi.Z., JG, LM, Y.Liu, JZ, Y.Lu und JW führten die Experimente durch. LT führte die phylogenetische Analyse durch. Yu.Z., YT und HZ stellten die Ressourcen und Materialien zur Verfügung. Yi.Z., XW und PS analysierten die quantitativen Daten. DL führte die NMR-Analyse durch. TH, und YY etablierte Hefestämme verwendet. Yi.Z. und WG hat das Manuskript geschrieben. WG und LH überarbeiteten das Manuskript.

Korrespondenz mit Wei Gao oder Luqi Huang.

Yi.Z., JG, LM und WG sind Erfinder chinesischer Erfindungspatente (Anmeldenr. CN202210059108.2 und CN202210059174.X), die sich auf die in der Arbeit beschriebenen Cytochrom-P450-Enzyme beziehen. Andere Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Young Jin Lee und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, Y., Gao, J., Ma, L. et al. Tandemduplizierte CYP82Ds katalysieren die 14-Hydroxylierung in der Triptolid-Biosynthese und Vorläuferproduktion in Saccharomyces cerevisiae. Nat Commun 14, 875 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36353-y

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Eingegangen: 02. August 2021

Angenommen: 27. Januar 2023

Veröffentlicht: 16. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36353-y

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