Eine Studie im Proteommaßstab zeigt, wie Kunststoffoberflächen und Bewegung die Proteinaggregation fördern

Oct 03, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1227 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Proteinaggregation in Biotherapeutika kann deren Aktivität und Wirksamkeit verringern. Es kann auch Immunreaktionen fördern, die für schwerwiegende Nebenwirkungen verantwortlich sind. Der Einfluss von Kunststoffmaterialien auf die Proteindestabilisierung ist nicht vollständig geklärt. Hier schlagen wir vor, die Auswirkungen der Materialoberfläche, der Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche und der Bewegung zu entfalten, um ihre jeweilige Rolle bei der Destabilisierung und Aggregation von Proteinen zu entschlüsseln. Wir analysierten die Wirkung von Polypropylen-, TEFLON-, Glas- und LOBIND-Oberflächen auf die Stabilität gereinigter Proteine ​​(Rinderserumalbumin, Hämoglobin und α-Synuclein) und auf einen Zellextrakt bestehend aus 6000 löslichen Proteinen während des Rührens (P = 0,1–1,2 W/ kg). Die Proteomanalyse ergab, dass Chaperonine, intrinsisch ungeordnete Proteine ​​und Ribosomen empfindlicher auf die kombinierten Auswirkungen von Materialoberflächen und Bewegung reagieren, während kleine metabolische Oligomere unter den gleichen Bedingungen geschützt werden konnten. Beobachtungen des Proteinverlusts in Verbindung mit Raman-Mikroskopie, dynamischer Lichtstreuung und Proteomik ermöglichten es uns, ein mechanistisches Modell der Proteindestabilisierung durch Kunststoffe vorzuschlagen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass der Proteinverlust nicht in erster Linie auf die Keimbildung kleiner Aggregate in Lösung zurückzuführen ist, sondern auf die Destabilisierung von Proteinen, die Materialoberflächen ausgesetzt sind, und deren anschließende Aggregation an der gescherten Luft-/Flüssigkeitsgrenzfläche, ein Effekt, der durch die Verwendung von LOBIND nicht verhindert werden kann Röhren. Es kann eine Anleitung zur Minimierung dieser nachteiligen Auswirkungen erstellt werden. Entfernen Sie eine der Komponenten dieses kombinierten Stresses – Material, Luft (auch teilweise) oder Bewegung – und die Proteine ​​bleiben erhalten.

Die Zahl proteinbasierter Therapeutika nimmt rasant zu. Allerdings sind Proteine ​​bei der Herstellung Belastungen ausgesetzt, die ihre Stabilität beeinträchtigen. Die Aggregation von Proteinen in Biotherapeutika kann deren Aktivität und Wirksamkeit verringern, kann aber auch Immunreaktionen fördern, die für schwerwiegende Nebenwirkungen wie allergische Reaktionen und Anaphylaxie verantwortlich sind1.

Es wurden verschiedene Strategien entwickelt, um die Proteinaggregation während der Biotherapeutika-Verarbeitung zu vermeiden, indem entweder die lokale Umgebung und der Prozess sorgfältig kontrolliert werden oder Aggregate vor der Probenahme entfernt werden. Die physikalischen und chemischen Faktoren, die die Stabilität von Proteinen bestimmen oder ihre Aggregation auslösen, sind seit langem Gegenstand pharmazeutischer und biochemischer Forschung. Es ist bekannt, dass Bewegung, Temperatur, pH-Wert und Ionenstärke die Proteinaggregation induzieren1,2,3.

Der Einfluss von Materialien auf die Proteinstabilität bei der Verarbeitung von Biotherapeutika wurde vergleichsweise weniger untersucht. Tatsächlich ist das aktuelle Bild seit langem das eines minimalen Verlusts von Proteinen durch Adsorption an Oberflächen, wo Protein/Material-Wechselwirkungen nur zu einer Oberflächenpassivierung führen würden, ohne die verbleibenden freien Proteine ​​in Lösung zu beeinträchtigen. Ab den 1970er Jahren zeigte Leo Vroman4,5, dass die Proteinadsorption kein statischer, sondern ein dynamischer Prozess ist, bei dem an der Flüssig-Fest-Grenzfläche zwischen freien und adsorbierten Proteinen je nach Proteinkonzentration und Affinität zur Oberfläche Austausche stattfinden. Dieses Modell kann nun durch den teilweisen Verlust der Proteinstabilität infolge schwacher Wechselwirkungen mit der Oberfläche und anschließender Freisetzung in die Lösung vervollständigt werden6, ein erster Schritt zu einer Fernwirkung von Grenzflächen.

Jüngste Studien haben gezeigt, dass die destabilisierende Wirkung von Fest-Flüssig-Grenzflächen auf die Proteinstabilität tiefgreifender ist als zunächst angenommen und durch Rühren verstärkt werden kann. Synergistische Effekte von Strömung und Oberflächen auf die Antikörperaggregation wurden bereits beschrieben7,8. Andere Studien betonten die Rolle von Luftblasen9,10. Diese Beobachtungen legen nahe, dass sowohl die Feststoff-Flüssigkeits-Grenzfläche als auch die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Bewegung Schlüsselfaktoren sind, wenn es um die Wirkung eines neuartigen Prozesses oder Materials bei der Herstellung von Biotherapeutika geht. Es fehlt jedoch die mechanistische Beschreibung, die die beteiligten Prozesse und das Zusammenspiel zwischen den verschiedenen Schnittstellen und der Bewegung auf die Proteinstabilität erklären könnte. Darüber hinaus wurden die meisten experimentellen Studien mit einzelnen gereinigten Proteinen durchgeführt, was die Rolle von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Beteiligung verschiedener Proteine, die mögliche Assoziation und Dissoziation von Proteinkomplexen an Grenzflächen11 und die Unterschiede in der Proteinempfindlichkeit gegenüber diesen Belastungen nicht erklären kann.

Hier schlagen wir vor, die Auswirkungen der verschiedenen Akteure – Materialoberfläche, Luft-/Flüssigkeitsgrenzfläche, Bewegung – zu entfalten, um ihre Rolle bei der Proteinaggregation zu entschlüsseln. Wir haben diese Analyse von gereinigten Modellproteinen auf einen Zellextrakt ausgeweitet, der aus Tausenden verschiedener Proteine ​​besteht, um die Proteine ​​zu identifizieren, die am empfindlichsten gegenüber dieser Art von kombiniertem Stress sind.

In dieser Studie analysierten wir die oberflächeninduzierte Destabilisierung gereinigter Proteine ​​und einer komplexen Mischung löslicher Proteine ​​durch Kontakt mit Kunststoffoberflächen in wässriger Lösung. Polypropylen (PP), Polyfluorethylen (PTFE oder TEFLON) und ein Referenzfläschchen aus Borosilikatglas, die üblicherweise für Arzneimittelverpackungen und Proteinmanipulationen verwendet werden, wurden ausgewählt, um die kombinierte Wirkung von Oberflächen und Bewegung auf die Proteinaggregation zu untersuchen. Wir haben auch Protein LOBIND-Röhrchen (EPPENDORF) einbezogen, die die Proteinadsorption auf Oberflächen reduzieren sollen, um die bei anderen Kunststoffen beobachteten Auswirkungen auf dieses Material zu vergleichen.

Zunächst analysierten wir die Auswirkungen der Kunststoffoberfläche und der Bewegung auf drei verschiedene gereinigte Proteine. Wir haben uns für Rinderserumalbumin (BSA), Schweinehämoglobin (Hb) und menschliches α-Synuclein (α-syn) aufgrund ihrer unterschiedlichen Struktur und thermischen Stabilität entschieden (siehe Tabelle S1 und S2). Hb ist ein tetrameres Hämoprotein, das sich in Erythrozyten befindet und Sauerstoff bindet. Aufgrund seiner relativ hohen Stabilität wird es gemäß Nordes Definition der Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen als „harte Proteine“ klassifiziert12. BSA ist ein zirkulierendes Monomerprotein, das verschiedene Arten von Biomolekülen und Arzneimitteln im Blutkreislauf transportiert und aufgrund seiner Fähigkeit, seine Konformation bei der Adsorption neu zu ordnen, als „weiches Protein“ klassifiziert werden kann13. α-syn wurde aufgrund seiner Tendenz zur Aggregation ausgewählt. Die Aggregation von α-syn wurde mit der neurodegenerativen Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht14. Es handelt sich um ein intrinsisch ungeordnetes Protein (IDP), das in seinem nativen Zustand teilweise entfaltet ist. Anschließend untersuchten wir die Proteinaggregation mit einem Zellextrakt (YPE, Yeast Protein Extract). Lösliche Proteine ​​wurden aus Saccharomyces cerevisiae extrahiert. YPE besteht aus Tausenden löslicher Proteine ​​mit einem hohen Dynamikbereich und wurde durch Proteomik vollständig charakterisiert15,16,17.

Die Proteinlösungen wurden bei 6 °C in Röhrchen aus jedem dieser vier Materialien gemischt, die an einem rotierenden Rad befestigt waren, um den Proteinverlust als Funktion der mechanischen Energie und Leistung pro Lösungsmasse zu überwachen. Die verstärkte gravitationsgetriebene Bewegung wurde gewählt, um die der Probe zugeführte Energiemenge genau zu quantifizieren. Die Leistung, ausgedrückt in Watt pro Flüssigkeitsmasseneinheit, lag zwischen 0,12 W/kg und 1,2 W/kg. Dieser experimentelle Aufbau ermöglicht es uns, die Kolmogorov-Prinzipien 18,19 anzuwenden, um die Scherspannung in Lösung zu quantifizieren und gleichzeitig das Luft- und Flüssigkeitsvolumen in den Proben zu variieren. Diese Bedingungen imitieren mäßigen Stress (niedrige Temperatur, neutraler pH-Wert, physiologische Ionenstärke) in Gegenwart von zwei verschiedenen Grenzflächen (Luft/Flüssigkeit und Fest/Flüssigkeit) unter Rühren, Bedingungen, die häufig für die Proteinzubereitung und -handhabung verwendet werden.

Der Versuchsaufbau zur Überwachung des Proteinverlusts während des Rührens der Proteinlösung in PP-, Glas-, TEFLON- und LOBIND-Röhrchen mit einem rotierenden Rad ist in Abb. 1A dargestellt. Alle Experimente wurden in 100 mM Phosphatpuffer, pH 7, bei 6 °C durchgeführt. Zunächst haben wir den Proteinverlust gereinigter Proteine ​​als Funktion des Röhrchenmaterials mit und ohne Rühren bei 3 U/min gemessen (Abb. 1B). Die Proteinkonzentration wurde nach dem Rühren gemessen, um den entsprechenden Proteinverlust zu berechnen. Mithilfe von Fluoreszenz- und UV-Vis-Spektroskopie wurden die Anfangs- und Endkonzentrationen von BSA, Hb bzw. α-syn gemessen.

(A) Schema des Versuchsaufbaus zur Messung des Proteinverlusts beim Rühren gereinigter Proteinlösungen mit einem rotierenden Rad. Die Drehzahl reichte von 0 bis 3 U/min, was einer Leistung von 0 bis 0,12 W/kg entspricht. Es wurden Röhrchen aus PP, Glas, TEFLON, LOBIND verwendet. Dargestellt ist eine konische PP-FISHERBRAND-Röhre. (B) Proteinverlust von BSA-, Hb- und α-syn-Lösungen, gemessen in PP-, Glas-, TEFLON- und LOBIND-Röhrchen nach 24 Stunden bei 6 °C ohne (grau) und mit Rühren bei 3 U/min (grün) auf einem rotierenden Rad. Die anfängliche Proteinkonzentration betrug C0 = 0,1 g/L (V = 10 ml). Signifikante Unterschiede werden mithilfe des Tukey-Tests „ehrlich signifikante Differenz“ ermittelt, der aus der Varianzanalyse (Anova) erstellt wurde (*** p-Wert < 0,001; ** p-Wert < 0,01). Um den Effekt der Proteinnatur zu beobachten, werden nur die Unterschiede bei 3 U/min gezeigt, alle statistischen Ergebnisse sind in Tabelle S3 verfügbar.

Der Proteinverlust für Hb- und α-syn-Lösungen wird bei allen getesteten Materialien mit Ausnahme der LOBIND-Röhrchen durch Bewegung ausgelöst. Tatsächlich wurde bei PP, TEFLON und Glas ohne Rühren kein Hb-Verlust gemessen (innerhalb der Nachweisgrenze), während bei PP unter Rühren ein Hb-Verlust von bis zu 7 % gemessen wurde. In ähnlicher Weise wurde bei allen Materialien ein geringer oder kein α-Syn-Verlust beobachtet (< 1 % ohne Rühren), während er bei PP, TEFLON und LOBIND auf 9 % und bei Glas auf 16 % anstieg. Die unterschiedlichen Ausmaße des Proteinverlusts legen nahe, dass α-syn im Vergleich zu Hb bei mäßiger Bewegung empfindlicher auf Destabilisierung reagiert und dass dieser Effekt je nach Material verstärkt werden kann.

Für BSA ist ein anderer Trend zu beobachten, da der Proteinverlust mit und ohne Rühren für PP- (3 %), TEFLON- (< 1 %) und LOBIND- (1–2 %) Röhrchen ähnlich bleibt. Im Gegensatz dazu wird ein dramatischer Effekt des Rührens beobachtet, wenn BSA-Lösungen mit Glas in Kontakt kommen, wobei der BSA-Verlust durch Rühren von 6 auf 17 % ansteigt.

Insgesamt sind die hier beobachteten Proteinverluste für gereinigte Proteine ​​unter Rühren sowohl protein- als auch oberflächenabhängig. Der Grad des Proteinverlusts kann für PP als BSA < Hb < α-syn eingestuft werden, während für die anderen Oberflächen unterschiedliche Trends beobachtet werden. Da jedes Material je nach Proteinnatur einen unterschiedlichen Effekt in Bezug auf die Proteindestabilisierung während des Rührens zeigt, ist es daher notwendig, eine größere Gruppe von Proteinen mit verschiedenen physikalisch-chemischen und strukturellen Merkmalen einzubeziehen, um ein realistischeres und umfassenderes Verständnis dieses Prozesses zu erhalten.

Zweitens haben wir den Proteinverlust für eine komplexe Mischung aus Tausenden löslicher Proteine ​​mithilfe von Hefeproteinzellextrakt (YPE) gemessen. Der Proteinverlust wurde nach mäßigem Rühren der Proteinlösung für 24 Stunden bei 6 °C in PP-, Glas-, TEFLON- und LOBIND-Röhrchen auf einem rotierenden Rad bei einer Geschwindigkeit von 3 bis 30 U/min gemessen. Das YPE wurde mit einem Cocktail aus Proteaseinhibitoren behandelt, um den enzymatischen Proteinabbau zu verhindern. Die anfängliche und endgültige Proteinkonzentration wurde mittels UV-Spektroskopie gemessen und der Prozentsatz des verlorenen Proteins berechnet (Abb. 2).

(A) Schema des Versuchsaufbaus zur Messung des Proteinverlusts beim Rühren einer Proteinlösung mit einem rotierenden Rad. Die Drehzahl lag zwischen 3 und 30 U/min, was einer Leistung von 0,12 bis 1,23 W/kg entspricht. Es wurden Röhrchen aus PP, Glas, TEFLON, LOBIND verwendet. Dargestellt ist eine konische PP-FISHERBRAND-Röhre. (B) Proteinverluste gemessen nach 24-stündiger Bewegung des YPE-Zellextrakts bei 6 °C und 3 U/min in jedem Röhrchen. Die anfängliche Proteinkonzentration betrug C0 = 0,1 g/L und das Füllvolumen 60 %. Der Fehler entspricht der Standardabweichung für drei biologische Replikate. Signifikante Unterschiede werden mithilfe des Tukey-Tests „ehrlich signifikante Differenz“ ermittelt, der aus der Varianzanalyse (Anova) erstellt wurde (*** p-Wert < 0,001).

Die größten Proteinverluste wurden bei PP- und Glasröhrchen beobachtet. Ein erheblicher Proteinverlust wurde auch in TEFLON- und LOBIND-Röhrchen beobachtet. Bei YPE wurde ein höherer Proteinverlust gemessen als bei Hb, BSA und α-syn bei PP. Unter allen Rührbedingungen wurden erhebliche Proteinverluste beobachtet, die nicht nur auf Proteinadsorption auf den Materialoberflächen zurückzuführen sein können. Tatsächlich entsprechen die in Glasfläschchen gemessenen maximalen Verluste dem Zehnfachen der höheren Masse, die von unserer Gruppe für die Abdeckung von Silica-Oberflächen mit derselben YPE-Proteinextraktlösung angegeben wurde17. Darüber hinaus waren die Proteinverluste vergleichbar zwischen LOBIND-Kunststoff (7 ± 3 %), von dem erwartet wurde, dass er Proteine ​​nicht adsorbiert20,21, und PTFE (5 ± 3 %), von dem erwartet wurde, dass er aufgrund hydrophober Wechselwirkungen ein starkes Bindemittel darstellt 22,23. Die gemessenen Verluste folgten nicht einfach den Werten der Grenzflächenspannungen der Lösungen/Materialien – geschätzt über Kontaktwinkelmessungen in Abbildung S1 – und traten nicht ohne Bewegung auf (innerhalb der experimentellen Fehler, Tabelle S4). Alle Beobachtungen deuten darauf hin, dass der Proteinverlust mit dem Vorhandensein von Grenzflächen zwischen Fest/Flüssigkeit (S/L) und Luft/Flüssigkeit (A/L) zusammenhängt und somit komplexer ist als ein einfaches Adsorptionsphänomen auf der Materialoberfläche.

Da PP den größeren Proteinverlust verursachte, konzentrierten wir unsere experimentelle Arbeit auf dieses häufig verwendete Material, um die Prozesse zu verstehen, die am oberflächeninduzierten Proteinabbau unter Rühren beteiligt sind. Zunächst variierten wir die in das System eingespeiste Energie, indem wir die Raddrehzahl für eine feste Dauer von 24 Stunden erhöhten (Abb. 2A). Der Proteinverlust nahm mit der dem System zugeführten Energie zu und erreichte bei einer Energieeinwirkung von 106 kJ/kg (entsprechend 30 U/min) Werte von bis zu 45 %. Wir haben auch den Proteinverlust als Funktion der angelegten Leistung bei einer festen Energie überwacht, indem wir die Rotationsdauer variierten. Der Proteinverlust verdoppelte sich bei einer festen empfangenen Energie von 1,8 kJ/kg, wenn die Lösung 4 Stunden lang bei 3 U/min gemischt wurde, verglichen mit 1 Stunde bei 12 U/min, was einer Leistung von 0,123 bzw. 0,492 W/kg entspricht (Abb. 3).

Entwicklung des Proteinverlusts für YPE in PP-Röhrchen unter Rühren als Funktion von (A) der dem System für eine feste Dauer von 24 Stunden und einer festen Leistung von 1,23 W/kg zugeführten Energie, (B) der für einen festen Zeitraum angelegten Leistung Energie von 1,8 kJ/kg. Alle Proben wurden bei 6 °C auf einem rotierenden Rad gemischt.

Der Anstieg des Proteinverlusts mit der zugeführten Energie deutet auf einen synergistischen Effekt des Kontakts mit PP und der Bewegung auf die oberflächeninduzierte Proteinaggregation hin. Diese Beobachtung wurde bereits für andere Arten von Materialien gemeldet2. Die Abhängigkeit des Proteinverlusts von der bei konstanter Energie angelegten Leistung lässt jedoch stark darauf schließen, dass Turbulenzen bei diesem Prozess eine Rolle spielen.

Die anfängliche Konzentration der Proteinlösung beeinflusst auch den Proteinverlust aufgrund der oberflächeninduzierten Aggregation (Abb. 4). Sie stieg von 0,04 auf 0,14 mg (3,5-fache Steigerung), wenn die Proteinkonzentration mit dem Zehnfachen von 10 mg/L auf 100 mg/L multipliziert wurde (Abb. 4). Das bei den höchsten anfänglichen Proteinkonzentrationen beobachtete Sättigungsplateau, das einem maximalen Proteinverlust von 0,15 mg entspricht, erinnert an Adsorptionsisothermen und verdeutlicht die Rolle von Grenzflächen in diesem Prozess.

Einfluss der anfänglichen Proteinkonzentration auf den Proteinverlust für YPE-Zellextrakt. (A) Absoluter Proteinverlust in mg. (B) Prozentsatz des Proteinverlusts. Die Proben wurden in PP-Röhrchen auf einem rotierenden Rad bei 3 U/min 4 Stunden lang bei 6 °C vorsichtig gemischt.

Proteine ​​konnten in den Experimenten an drei verschiedenen Arten von Grenzflächen adsorbieren: der Fest/Flüssigkeits-Grenzfläche (S/L), der Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche (A/L) am oberen Ende der Lösung und der dreifachen Luft/Feststoff/Flüssigkeit-Grenzfläche ( A/L/S)-Linienschnittstelle am Meniskus, die alle während des Mischens kontinuierlich erneuert werden (Abb. 5). Die spezifische Oberfläche jeder dieser Schnittstellen in unserem System wird abhängig von der Rohrausrichtung auf 5–45 cm2 für die S/L-Schnittstelle, 1–14 cm2 für die A/L-Schnittstelle (im Ruhezustand) und 4 cm2 geschätzt –23 cm für die A/L/S-Schnittstelle, abhängig vom Lösungsvolumen und der Röhrchenausrichtung (vertikal oder horizontal) (Tabelle 1).

Schema, das die drei beim Proteinrühren berücksichtigten Grenzflächen darstellt. (A) Fest-Flüssigkeits-Grenzfläche an der Materialoberfläche. (B) Luft-/Flüssigkeitsschnittstelle. (C) Dreifache Grenzfläche zwischen Luft, Flüssigkeit und fester Linie, die den Meniskus definiert. Proteine, dargestellt als grüne Punkte, könnten beim Mischen an einer oder mehreren dieser Grenzflächen adsorbieren.

Durch Variation der Lösungsmenge in den Röhrchen (und des entsprechenden Luftvolumens) verglichen wir die relative Wirkung jeder dieser Grenzflächen für unterschiedliche Oberfläche-Volumen-Verhältnisse (Abb. 5, Schema S1). Durch die Reduzierung der Luftmenge und damit die Erhöhung des Verhältnisses der S/L-Grenzfläche im Vergleich zu anderen wird der Proteinverlust verringert. Andererseits beobachteten wir, dass die Erneuerung der S/L-Schnittstelle zu einem höheren Proteinverlust führt (Abbildung S3). Dies legt nahe, dass die S/L-Schnittstelle, sobald sie durch Proteine ​​passiviert ist, einen geringen Einfluss auf die Destabilisierung von Proteinen in Lösung hat (Tabelle 1) und dass A/L und/oder A/L/S die bestimmenden Schnittstellen sind. Verschiedene Studien 24 deuten darauf hin, dass die sich bewegende A/L/S-Dreifachlinie eine Zone komplexer Trocknungsphänomene definiert, die starke laterale Kräfte25 und „Scher“-Schäden an Proteinen3 hervorrufen können. Um diese Hypothese zu testen, änderten wir die Geometrie des Systems und verwendeten einen Tauchbeschichteraufbau mit einer PP-Platte, die vertikal eingetaucht und herausgezogen wurde, um die Bedingungen zu reproduzieren, die bei den Rotationsrad-Rührexperimenten an der dreifachen A/L/S-Linie vorgefunden wurden Schnittstelle (Schema S2). Wir haben den Unterschied der PP-Oberflächenkrümmung in beiden Geometrien vernachlässigt, aber wir haben eine Bewegungsperiode beibehalten, die die Bedingungen des rotierenden Radaufbaus reproduziert. Im Gegensatz zu den Beobachtungen im Fall von Insulinlösungen wurde bei den Tauchbeschichtungsexperimenten kein signifikanter Proteinverlust beobachtet (Tabelle S5). Daher ist das Trocknen in der Dreifachlinienzone mit PP sicherlich nicht der Prozess, der für den im Rotationsradexperiment gemessenen Proteinverlust verantwortlich ist.

Wir können daher vernünftigerweise davon ausgehen, dass die S/L- und A/L/S-Grenzflächen eine untergeordnete Rolle im Proteinverlustprozess beim Rühren mit rotierenden Rädern in Kontakt mit PP spielen. Daher gehen wir davon aus, dass die kritische Schnittstelle wahrscheinlich die A/L-Schnittstelle ist. Beachten Sie, dass die Verformungen der A/L-Grenzfläche im Tauchbeschichtungsexperiment nicht geeignet zu sein scheinen, Spannungen zu erzeugen, die Proteine ​​in erheblichem Maße aggregieren (Schema S2). Darüber hinaus wurde beim Rühren in Röhrchen ab einem bestimmten Lösungsvolumen (ungefähr 75 % des Gesamtvolumens) ein sehr geringer Proteinverlust beobachtet (Tabelle 1). Im Gegenteil, bei Vsolution < 60 % wurde unter allen Bedingungen ein erheblicher Proteinverlust gemessen. Daher scheint der Übergang von der Proteinaggregation zur Proteinstabilisierung, also von stressigen zu stressfreien Rührbedingungen, ziemlich steil zu sein und hängt stark vom Verhältnis Vsolution / Vair ab.

Basierend auf der Beobachtung der Rohre während der rotierenden Bewegung des Rades (Abbildung S6) könnten wir diese Grenze qualitativ als den Übergang zwischen einem „Gas, das sich in die Flüssigkeit bewegt“ und einem „Flüssigkeit, die in das Gas fällt“-Status beschreiben. Dies wird manchmal als Übergang von der Pfropfenströmung, bei der sich stetig längliche Blasen bilden, zur wellenförmigen Schichtströmung beschrieben26. (Abbildung S7) Die Änderung des Strömungsmusters ist mit dem Auftreten von Schwankungen in der Menge der A/L-Grenzfläche aufgrund der Bildung von Wellen oder Blasen verbunden. Dies entspricht wiederholten Kompressions-/Dekompressionsereignissen an Grenzflächen, die bekanntermaßen äußerst schädlich für Proteine ​​sind9,27. Dies ist wahrscheinlich der Schlüsselmechanismus, der hier im Spiel ist.

Wir müssen auch das mögliche Zusammenspiel von Turbulenzen (Abb. 3) und der Oberflächenbeschaffenheit des Materials (Abb. 2) diskutieren. Zunächst müssen wir beachten, dass die vorgesehenen turbulenten Scherkräfte (Tabelle S7) viel kleiner sind als die Kräfte, die zur Entfaltung von Proteinen erforderlich sind, unabhängig von der Proteingröße. Die Scherkräfte im System liegen im fN-Bereich (Tabelle S7), wohingegen zur Entfaltung von Proteinen mehrere zehn bis hundert pN erforderlich sind28. Wir denken hier über einen sanften Rührvorgang nach. Allerdings kann die Scherung, auch wenn sie das Protein nicht direkt verändern kann, zwei Auswirkungen haben: (i) sie kann die Menge der A/L-Grenzfläche (das wellenförmige Verhalten29) vorübergehend erhöhen und verringern und so die Aggregation an A/L begünstigen; (ii) es kann die Desorption adsorbierter nativer oder destabilisierter Proteine ​​von den S/L- oder A/L-Grenzflächen begünstigen24,30.

Die Rolle des Oberflächenmaterials kann entweder direkt durch die Adsorption nativer Proteine ​​wirken, was zur Bildung von Keimbildungsstellen für die Aggregation führt, oder durch die Destabilisierung von Protein in Lösung durch eine günstige Wechselwirkung mit entfalteten/destabilisierten Proteinkonformationen6,31.

Wir können anhand dieser Daten nicht sagen, ob die Wirkung von Turbulenzen der Wirkung des Materials vorausgeht, nachfolgt oder parallel zu ihr wirkt. Um dies zu klären, führten wir ein zusätzliches Experiment mit einer überschüssigen Kunststoffoberfläche in Form eines porösen PP-Filters mit einer spezifischen Oberfläche von 0,7 m2/g durch (Schema S3 und Abbildung S2). Es handelt sich um eine hochplastische Oberfläche, die der Proteinlösung ohne Turbulenzen ausgesetzt ist. Mit der erhaltenen S/L-Grenzfläche von 120 cm2 während des Rührens (im Vergleich zu 50 cm2 beim Rühren ohne Filter) verdoppelte sich der Proteinverlust durch YPE und erreichte 40 % der Anfangskonzentration. (Tabelle S6).

Zusammen mit Abbildung S3 deutet dies darauf hin, dass die Materialoberfläche eine gewisse Proteindestabilisierung auslöst, die durch die Kombination von A/L-Grenzfläche und Turbulenzen verstärkt wird. Die thermodynamische Kraft ist nicht die Wechselwirkung zwischen dem Material und dem Protein in ihrem ursprünglichen Zustand (Keimbildungsmodell von Sluzky32), sondern die starke Wechselwirkung zwischen dem Material und dem Protein in ihren entfalteten/destabilisierten Konformationen, die alle Faltungsgleichgewichte in Lösung verschiebt. 6 Diese Situation ähnelt anderen Belastungen wie Druck und Gefrieren, von denen beschrieben wurde, dass sie durch mikroskopische Zyklen von Protein-Protein-Assoziationen/-Dissoziationen solche Konformationsabweichungen induzieren. Daher erklärt dieses mechanistische Modell auch, warum Oberflächen, die mit geringen Mengen an A/L-Grenzflächen umschlossen sind, wie der hier vorgestellte Kunststofffilter, oder die die Proteinadsorption begrenzen sollen, wie der LOBIND-Kunststoff, ebenfalls erhebliche destabilisierende Wirkungen auf Proteine ​​in Lösung auslösen können.

Eine große Frage ist, was mit den verlorenen Proteinen passiert. Zunächst stellten wir fest, ob der Proteinverlust durch das Einfangen von Proteinen auf der Materialoberfläche erklärt werden kann. In diesem Fall sollte die Dicke der adsorbierten Proteinschicht mit der Anzahl der Zyklen zunehmen, um den gemessenen Proteinverlust zu erreichen. Die an PP-Röhrchen adsorbierten Proteine ​​wurden mit 0,1 % v/v Natriumdodecylsulfat (SDS), einem starken Tensid, entfernt und die entsprechende Proteinmenge mittels UV-Spektroskopie gemessen. Die Masse der auf PP adsorbierten Proteine ​​(in mg/m2) nahm in Abhängigkeit von der Rotationsgeschwindigkeit nicht signifikant zu (Abb. 6). Es ist sogar zurückgegangen. Im Vergleich zum gesamten Proteinverlust von 150 µg stellt es auch eine relativ kleine Menge (25 µg) dar, also < 20 % des gesamten Proteinverlusts. Daher ist es unwahrscheinlich, dass allein die Proteinadsorption auf der Materialoberfläche für den Proteinverlust verantwortlich ist. Daher konzentrierten wir unsere Studie auf neu gebildete Objekte in Lösung, um das Schicksal verlorener Proteine ​​zu verstehen.

Menge an adsorbierten Proteinen auf PP-Röhrchen in mg/m2 als Funktion der Rotationsgeschwindigkeit für YPE-Zellextrakte. Für jede Bedingung werden die Leistung (P) und die Energie (E) angegeben. Die adsorbierten Proteine ​​wurden mit 0,1 % v/v Natriumdodecylsulfat (SDS) entfernt und die Proteinmenge mittels UV-Spektroskopie gemessen. Signifikante Unterschiede werden mithilfe des Tukey-Tests „ehrlich signifikante Differenz“ ermittelt, der aus der Varianzanalyse (Anova) erstellt wurde (** p-Wert < 0,01).

Große Partikel (d > 1 µm) wurden in den Proteinlösungen nach rotierendem Rühren in PP-Röhrchen identifiziert. Zur besseren Visualisierung ihrer Form und Struktur wurden optische Mikroskopie unter Verwendung von reflektiertem Licht und Konturrekonstruktion mit Fiji-Software eingesetzt (Abb. 7A). Die Größe der Objekte reichte von wenigen bis zu mehreren zehn Mikrometern, eine innere Struktur war jedoch nicht zu erkennen.

In-situ-Bildgebung in Lösung und biochemische Analyse der Proteinaggregate. (A) Optische Bilder mit reflektiertem Licht und Konturrekonstruktion. (B) Raman-Bilder der Partikel P2, P3. Bilder, die den Raman-Spektren des Proteinaggregats und der Lösung entsprechen, werden in Rot bzw. Grün angezeigt. Das Overlay wird unten angezeigt. Für jede Erkrankung wurden zwei biologische Replikate analysiert.

Ihre biochemische Zusammensetzung wurde mittels konfokaler Raman-Mikroskopie analysiert (Abb. 7B). Raman-Eigenschaften (siehe Zuordnungen in Tabelle S8) bestätigten die Proteinnatur der Partikel in Übereinstimmung mit dem beobachteten Proteinverlust und dem möglichen Vorhandensein von DNA oder RNA, was darauf hindeutet, dass Ribosomen/Nukleoproteine ​​in den Partikeln enthalten sein könnten. Diese Daten legen nahe, dass die Proteinaggregation tatsächlich für den Proteinverlust verantwortlich ist, wie bereits im Fall gereinigter Immunglobuline berichtet, die einer periodischen Kompressionsdekompression unterzogen wurden27,34,35.

Die Raman-Bildgebung zeigte auch ein etwas anderes Muster im Vergleich zu Hellfeldbildern mit Flecken dichterer Proteinkerne und Lösungseinlässen in den Partikeln. Um zwischen Proteingelierung und -aggregation zu unterscheiden, haben wir den Hydratationsgrad der Proteinpartikel mittels konfokaler Raman-Mikroskopie bestimmt. Die Raman-Spektren der Partikel im Vergleich zur umgebenden YPE-Lösung nach dem Mischen sind in Abb. 8A dargestellt. Der Wassergehalt der Probe spiegelt sich in der Intensität des OH-Streckschwingungsbandes von Wasser um 3400 cm−1 wider. Obwohl es schwierig sein kann, die absolute Intensität der Raman-Banden zu vergleichen, wurden die Spektren hier unter denselben experimentellen Bedingungen und innerhalb derselben Probe aufgenommen. Die durchschnittliche Intensität der OH-Schwingungsbande der Proteinaggregate ist nur 30 % geringer als die der umgebenden Lösung. Somit behielten die Proteinpartikel, die sich beim Mischen in PP-Röhrchen bildeten, einen erheblichen Wassergehalt bei, was darauf hindeutet, dass es sich eher um gelartige Proteinpartikel als um dehydrierte und denaturierte Proteinkompaktaggregate handelt.

Raman-Spektren von Proteinaggregaten und YPE-Lösung. (A) Durchschnittliche Raman-Spektren von Aggregaten, die in YPE-Lösung bei 0,1 g/L (rot) und YPE-Lösung bei 0,1 g/L nach dem Mischen (blau) gebildet wurden. Die einzelnen Spektren von Proteinaggregaten sind grau dargestellt. (B) Normalisierte Raman-Spektren von Proteinaggregaten, die in YPE-Lösung bei 0,1 g/L (rot) und YPE-Stammlösung bei 25 g/L (grün) gebildet wurden. Die Spektren wurden auf das OH-Band von Wasser bei 3406 cm−1 normiert. * Die Raman-Banden, die in der YPE-Lösung vorhanden sind, aber in Proteinaggregaten fehlen, sind grau hervorgehoben.

Wir verglichen auch die Raman-Spektren der gebildeten Partikel mit denen der ursprünglichen YPE-Lösung (Abb. 8B). Allerdings mussten wir mit Lösungen in einer höheren Konzentration (25 g/L) arbeiten, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis für freie Proteine ​​zu erhalten (Abbildung S8). Die Spektren der Aggregate und der Ausgangslösung weisen große Unterschiede auf, die in der Abbildung grau hervorgehoben sind. Mehrere in der YPE-Lösung gut sichtbare Banden fehlen im Spektrum der Partikel, was darauf hinweist, dass einige Cofaktoren vom Aggregationsprozess ausgeschlossen sind (siehe Tabelle S9), ein Effekt, der auch durch Proteinstrukturänderungen während der Aggregation begünstigt werden könnte. Im Gegensatz dazu wurde zwischen den Raman-Spektren verschiedener Proteinaggregate, abgesehen von ihrem Wassergehalt, kaum ein Unterschied beobachtet, was darauf hindeutet, dass die in diesem Größenbereich gebildeten Partikel eine relativ homogene Zusammensetzung aufweisen (Abb. 8A).

In einem zweiten Schritt suchten wir nach möglichen Zwischenprodukten des Partikelwachstums. Die Lösungen wurden bei 1,2 µm filtriert, um große Aggregate zu entfernen, und nach 24 Stunden mit oder ohne Mischen durch dynamische Lichtstreuung (DLS) analysiert. Der hydrodynamische Radius der Objekte als Funktion der Rotationsgeschwindigkeit ist in Abb. 9 dargestellt. Interessanterweise wurden zwei unterschiedliche Populationen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10 und 130 nm unter stationären Bedingungen ohne Vermischung identifiziert. Da der Zellextrakt aus Tausenden verschiedener Proteine ​​besteht, können wir zunächst davon ausgehen, dass es sich bei diesen beiden Populationen um freie Proteine ​​bzw. große Proteinkomplexe handelt. Diese Verteilung in zwei Populationen mag zunächst überraschend erscheinen. Tatsächlich lässt eine Simulation der Proteindiffusionseigenschaften auf der Proteomskala (bei denen es sich tatsächlich um die durch DLS gemessenen physikalischen Parameter handelt) nicht zwei Populationen vorhersagen36. Man muss jedoch bedenken, dass große Transkriptionskomplexe in sich schnell teilenden Zellen sehr häufig vorkommen und dort bis zu einem Drittel des Proteingehalts ausmachen können37. Neben Ribosomen deuten aktuelle Massenspektrometriedaten darauf hin, dass zwei Drittel des Proteins als „trennbare Komplexe“ in eukaryotischen Zellextrakten vorliegen38. Unsere Beobachtung spiegelt möglicherweise einfach diese Tatsachen wider.

Analyse des hydrodynamischen Radius von in YPE-Lösung gebildeten Partikeln nach dem Mischen in PP-Röhrchen auf einem rotierenden Rad als Funktion der Geschwindigkeit. Die Intensitätsgrößenverteilung wurde durch DLS nach Filtration der Lösungen bei 1,2 µm gemessen, um die größeren Aggregate zu entfernen. Der Prozentsatz jeder Population (in Intensität) ist farblich gekennzeichnet.

Bei 3 U/min beobachteten wir einen kleinen Anstieg des hydrodynamischen Radius der größeren Objekte, die 93 % der Intensität der Partikel ausmachen. Bei 30 U/min verringerten sich sowohl die Größe als auch die Anzahl der größeren Objekte, während sich die Größe kleinerer Objekte nicht wesentlich änderte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich in der Lösung keine Aggregate mit einem Durchmesser von 100 nm < d < 1 µm gebildet haben.

Das Fehlen nachweisbarer Aggregate mittlerer Größe unter allen getesteten Bedingungen (Variation des Lösungsvolumens: 0, 10, 15 ml und der Mischdauer (bis zu 53 Stunden)) ist überraschend. Dies legt nahe, dass die Proteinaggregation nicht auf einem progressiven Wachstum in der Lösung beruht . Stattdessen scheinen sich große Proteinpartikel direkt während des Rührens zu bilden. Mithilfe eines Impfexperiments (siehe Hintergrundinformationen in Abbildung S5) haben wir außerdem bestätigt, dass innerhalb der Lösung keine Partikelkeimbildung/-wachstum stattgefunden hat. Auch die Einführung bereits gealterter Lösungen in frische Zellextrakte gefiltert, um Partikel zu entfernen, oder unfiltriert, steigerte den Proteinabbau tatsächlich nicht.

Daher schlagen wir vor, dass die Partikel durch einen Falten-/Umhüllungsprozess aus den Proteinschichten der A/L-Grenzfläche gebildet werden. Die Größe der Partikel ist vergleichbar mit der berechneten Kolmogorov-Längenskala39 (Tabelle S7), die die maximale Scherrate und die Partikeldimension verknüpft. Daher würde der Agglomerationsprozess, der an einer makroskopischen Grenzfläche stattfindet, durch Scherung und Turbulenzen zu mikrometergroßen, abgeschälten Proteinaggregaten führen.

Wir schlagen ein globales Modell vor, das in Abb. 10 dargestellt ist, mit einer begleitenden Adsorptionswirkung auf der Kunststoffoberfläche und anderen Grenzflächen, adaptiert von Sluzky et al.32. In diesem Schema hätten stark bindende Materialien und schwach bindende Materialien den gleichen Effekt, indem sie das Übersprechen zwischen der Materialoberfläche und der Lösung verringern (Abb. 10, Schritt A). Das ist tatsächlich das, was bei TEFLON- und LOBIND-Röhrchen mit gereinigten Proteinen (Abb. 1) und Zellextrakten (Abb. 2) beobachtet wurde.

Angepasst von Sluzky et al.32.

Modell der Proteindestabilisierung durch Kontakt mit Kunststoffoberflächen unter Bewegung. (A) Die Affinität der Behälteroberfläche für ungefaltetes Protein destabilisiert das Protein in Lösung durch eine Konformationsdrift. Dieser Prozess ist bei neuen A/L- und S/L-Schnittstellen wichtiger. (B) Die destabilisierten Proteine ​​adsorbieren an der A/L-Grenzfläche. Variationen der Grenzflächenmenge induzieren Kompressions- und Dekompressionskräfte und fördern so die Proteinaggregation. (C) Scherkräfte können die Übertragung von und zu Grenzflächen in Schritt A erleichtern und die in Schritt B gebildeten Proteinfilme aufbrechen.

Die Tatsache, dass unabhängig von der Materialoberfläche ein signifikanter α-syn-Verlust beobachtet wird (jedoch mit einem stärkeren Effekt bei Glas, Abb. 1), widerspricht nicht dem in Abb. 10 dargestellten Mechanismus. Tatsächlich wird α-syn teilweise entfaltet seine ursprüngliche Form, so dass es keinen Destabilisierungseffekt durch die Materialoberfläche in Abb. 10A erfahren kann. Somit wird α-syn hauptsächlich durch mechanische Kräfte destabilisiert (Abb. 10, Schritt B und C).

Aus diesem Schema kann der in Abb. 1 beobachtete begrenzte BSA-Verlust mit der sehr häufigen Verwendung von BSA-Lösungen zur Passivierung von Kunststoffoberflächen durch Adsorption in Zusammenhang gebracht werden. Der passivierende Effekt von BSA würde tatsächlich den Rest der Lösung vor dem Materialdestabilisierungseffekt in Abb. 10A schützen.

Die besondere Anfälligkeit von BSA und α-syn in Gegenwart von Glas (Abb. 1) kann auf ihren niedrigeren isoelektrischen Punkt (siehe Tabelle S1) zurückzuführen sein, der elektrostatische Wechselwirkungen mit der Materialoberfläche fördern würde. In diesem Fall können wir zusätzlich zur Oberflächendestabilisierung das Vorhandensein von Aggregatkeimbildungsstellen auf der Materialoberfläche nicht ausschließen40.

Um die Proteine ​​zu identifizieren, die empfindlicher auf den ausgeübten Stress reagieren, führten wir vor und nach dem Rühren des YPE auf dem rotierenden Rad in PP-, TEFLON-, Glas- und LOBIND-Röhrchen eine quantitative Proteomanalyse durch, wobei wir die gleichen Bedingungen wie in gezeigt verwendeten Abb. 2. Die Proteine, die nach dem Rühren von YPE aus der Lösung abgereichert oder in der Lösung angereichert wurden, wurden durch nanoLC-MS/MS identifiziert (Abb. 11). Da die Gesamtproteinkonzentration nach Stress abnahm, mussten wir ein größeres Volumen an YPE-Lösung injizieren, um im optimalen Empfindlichkeitsbereich für das analytische MS-System zu bleiben. Wir haben einen Normalisierungskoeffizienten angewendet, der dem im Molalitätsmaßstab berechneten Verlust der Proben entspricht, um die gleiche Proteinmasse zu injizieren. Die durch die MS-Analyse ermittelten Zahlen beziehen sich auf die Molarität, und eine ordnungsgemäße Umrechnung von Molarität in Molalität wäre grundsätzlich möglich, wenn man die genaue Konzentrationsverteilung der analysierten Proteinmischung kennt. Allerdings weist ein erheblicher Anteil der identifizierten Proteine ​​Molaritäten zwischen LOD und LOQ (5 fmol) auf. Daher können diese Proteine ​​beobachtet, aber nicht quantifiziert werden, und die Umrechnung von Molarität in Molalität konnte nicht angewendet werden (siehe unterstützende Datei Proteomic-SI1). Aus Sicherheitsgründen haben wir daher beschlossen, Proteine, deren Variationen in der Größenordnung der angewendeten Normalisierung lagen, nicht zu berücksichtigen.

Quantitative proteomische Analyse von Proteinen, die der Lösung nach dem Mischen von YPE in PP-, TEFLON-, Glas- und LOBIND-Röhrchen bei 3 U/min für 24 Stunden bei 6 °C entzogen und in ihr angereichert wurden. Der Farbverlauf zeigt den Status der Proteine ​​an: abgereichert (rot) bis angereichert (grün). Die Proteineigenschaften stammen aus der Uniprot-Datenbank41. Eine Liste aller berücksichtigten Proteine ​​finden Sie in der Begleitdatei Proteomic-SI2.

Mit dieser Methode haben wir 112 Proteine ​​identifiziert, die einen signifikanten Konzentrationsunterschied vor und nach dem Rühren in einem oder mehreren der getesteten Materialien aufweisen, basierend auf der statistischen Bayes-Analyse (Bayes-Faktor > 1) (die Proteinliste finden Sie in der unterstützenden Datei Proteomic-SI2). ). Von diesen Proteinen waren 58 Proteine ​​stark abgereichert und 31 Proteine ​​stark angereichert, wobei nach dem Mischen eine Konzentrationsschwankung von mindestens 15 % erreicht wurde. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in Abhängigkeit vom Material beobachtet, wobei die meisten abgereicherten und am stärksten angereicherten Proteine ​​bei allen verschiedenen Oberflächentypen beobachtet wurden. Stark angereicherte und stark abgereicherte Proteine ​​wurden als Komplexe, Oligomere, Chaperonine, teilweise entfaltete Proteine ​​oder IDPs und andere klassifiziert (Abb. 11).

Um den Schwellenwert von 15 % zur Klassifizierung selektiv angereicherter und abgereicherter Proteine ​​in den MS-Daten zu validieren, wurde ein Monte-Carlo-Simulationstest durchgeführt (siehe M&M, Abbildung S9).

Während der Simulationen wurde ein Massenverlustziel τ im Bereich von 0–25 % mit einer Erhöhung um 1 % nicht selektiv auf Proteine ​​angewendet. Zuerst berechneten wir die Bayes'schen Faktoren (BFsim) für jedes Protein des vollständigen YPE unter Verwendung eines Zielmassenverlusts von τ %, um festzustellen, ob der Mengenunterschied zwischen dem vollständigen Extrakt und den abgereicherten simulierten Sätzen signifikant war (BFsim > 1) oder nicht (BFsim ≤ 1). Die Erschöpfung eines bestimmten Proteins wurde anhand einer Mehrheitsentscheidungsregel in 100 Simulationen bewertet. Proteine ​​mit simulierter geringer Häufigkeit (Mengen < 5 fmol) wurden gemäß der experimentell ermittelten LOD und LOQ entfernt. Die Ergebnisse der Simulation für die PP-Oberfläche sind in Abb. 12 dargestellt. Die Linie zeigt die simulierte Anzahl abgereicherter Proteine, um den angestrebten Massenverlust zu erreichen. Um bei der PP-Oberfläche einen Massenverlust von 15 % zu erreichen, mussten 125 Proteine ​​nicht selektiv abgereichert werden, wohingegen im Experiment nur 58 vorhanden waren. Unsere Analyse zeigt auch (unterstützender Informationsteil SF), dass etwa 80 % der experimentell durch Proteomik identifizierten abgereicherten Proteine ​​eine stärkere Abreicherung aufweisen als Proteine ​​aus dem simulierten Datensatz. Diese beiden Ergebnisse zeigen, dass Proteinabreicherungen über 15 % im System nicht auf einen zufälligen Prozess zurückzuführen sind, sondern vielmehr auf eine selektive Abreicherung aus dem Extrakt.

Berechnete Anzahl abgereicherter Proteine ​​als Funktion des Massenverlusts. Das Ergebnis der Monte-Carlo-Simulationen wird durch die grüne Linie dargestellt. Der gemessene Proteinverlust und die Anzahl der abgereicherten Proteine, die durch Proteomanalyse für die PP-Oberfläche identifiziert wurden, werden durch ein blaues Kreuz angezeigt.

Die abgereicherten Proteine ​​lassen sich in drei Hauptgruppen einteilen: teilweise entfaltete Proteine ​​(oder IDPs), Chaperonine und Proteine, die große Komplexe bilden (hauptsächlich Ribosomen). Der Nachweis von Proteinen aus den beiden ersten Kategorien kann durch den Mechanismus der Proteinadsorption an Grenzflächen erklärt werden. Tatsächlich impliziert der Adsorptionsprozess häufig eine teilweise Entfaltung des nativen Proteins, das ansonsten mit einem Enthalpienachteil verbunden ist, der mit seiner Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur verbunden ist. Im Gegensatz dazu leiden teilweise ungefaltete Proteine ​​wie IDPs nicht unter diesem Nachteil und werden daher leichter adsorbiert6,31.

Es wird auch erwartet, dass Chaperonine leicht an Grenzflächen absorbieren, und zwar nicht direkt, sondern erst nach Wechselwirkung mit adsorbierten ungefalteten Proteinen, für die sie eine hohe Spezifität und Affinität aufweisen. Ein solcher Mechanismus wurde bereits für Silikatoberflächen nachgewiesen31.

Der Nachweis großer Proteinkomplexe (10–100 nm Durchmesser) wie Ribonukleoproteine ​​ist überraschender, da sie in Adsorptionsexperimenten auf anorganischen Oberflächen normalerweise nicht überrepräsentiert sind17. Einerseits wird nicht erwartet, dass der Verteilungskoeffizient zwischen der A/L-Grenzfläche für große Proteine ​​höher ist als für kleine Proteine42. Experimentelle Daten deuten darauf hin, dass sie sogar niedriger sein könnten43. Betrachtet man Proteine ​​hingegen als feste Kugeln, dann hängt ihr kolloidales Verhalten in Lösung von Polydispersität, Überfüllung und Einschluss ab. Es wurde experimentell und durch Modellierung gezeigt, dass die Diffusion großer Proteine ​​an Grenzflächen im Vergleich zu kleinen verringert ist. Dieser Mechanismus könnte für eine längere Verweildauer und damit für eine höhere Anzahl von Proteinkomplexen an der A/L-Grenzfläche verantwortlich sein, wo sie Kompressions- und Dehnungskräften ausgesetzt sind, die eine weitere Destabilisierung und Aggregation begünstigen44.

Aktuelle KryoEM-Bilder von Lösungen großer Proteine ​​(25 nm groß, vergleichbar mit der Größe der hier identifizierten Komplexe) zeigten eine schnelle und quasi vollständige Adsorption an der A/L-Grenzfläche, die zu lokalisierter Denaturierung45 und Komplexdissoziation46 führte. Dieses Bild deutet stark auf eine durch Kapillarkräfte induzierte Verzerrung/Verlängerung der Grenzflächenproteine ​​hin (Schema S4)47. Dieser Elastokapillareffekt kann eine Verformung der Proteine ​​entlang der Kontaktlinie hervorrufen, deren Größenordnung im nm-Bereich (siehe Hintergrundinformationen Teil SG) ausreichen kann, um Komplexe aufzubrechen und hydrophobe Oberflächen freizulegen, die zur Aggregation neigen. Darüber hinaus wird erwartet, dass Kapillarkräfte die Fixierung größerer Partikel an der A/L-Grenzfläche48 und deren Koaleszenz49 begünstigen.

Eine ergänzende Erklärung liegt in der periodischen Kompression-Dekompression, die durch Oberflächenwellen hervorgerufen wird (Abb. 10)27,50, die die Kapillarbeschränkungen verstärken. Jedes Mal, wenn die A/L-Oberfläche abnimmt, führt dies zu einem Anstieg des Oberflächendrucks adsorbierter Proteine ​​an dieser Grenzfläche, ähnlich der Kompression, die in Langmuir-Trog-Experimenten erzielt wurde. Wie die Kapillarkräfte hängen auch die Kompressionskräfte von der Proteingröße ab und können einen Bereich von 120 mN/m erreichen (siehe Hintergrundinformationen Teil SG). Dies ist stark genug, um große Proteine ​​in Kontakt zu bringen und sie an der A/L-Grenzfläche zu verschränken51. Daher können diese Kompressionskräfte wahrscheinlich die Partikelbildung an der Grenzfläche begünstigen.

Wir müssen berücksichtigen, dass diese Druckschwankungen bei wellenförmigen Strömungsbedingungen stärker und häufiger sind, wo die Anzahl der Oberflächen schnell variiert und die in den Proteinstrukturen (Komplexe, Oberflächengele…) dissipierte Energie dann aufgrund der intrinsischen Struktur viel höher sein wird Viskosität von Proteinen52,53 und von Proteinanordnungen54. Dementsprechend werden wellenförmige Strömungsbedingungen wahrscheinlich die an den Grenzflächen auftretenden Destrukturierungs- und Verschränkungsprozesse verstärken.

Bemerkenswert ist, dass einige Proteine ​​durch die Agitationseffekte erheblich geschützt wurden, darunter die kleinen metabolischen Homo-Oligomere (Abb. 11). Solche Anordnungen sind bekanntermaßen stabiler und weniger anfällig für Aggregation,55 auch wenn es schwierig ist zu verstehen, wie die Scherkräfte sie stabilisieren können. Eine Erklärung könnte in der Tatsache liegen, dass solche oligomeren Komplexe kinetisch stabil sind11, dh sie bauen sich schneller auf als sie zerfallen. In verdünnten Lösungen wird jedoch ihre Aufbaukinetik, die durch das Zusammentreffen der Komponenten der Komplexe gesteuert wird, zum limitierenden Faktor für ihre Stabilität. Alle Phänomene, die diese Begegnung beschleunigen können, wie zum Beispiel Scherung, können ihre Stabilität begünstigen.

Eine andere Erklärung wäre, dass diese Komplexe durch die Scherwirkung von Turbulenzen bevorzugt von Oberflächen desorbiert werden. In einigen Fällen wurde beschrieben, dass Scherung die Menge an adsorbiertem Protein verringert, insbesondere auf hydrophoben Oberflächen30,56. Die Proteine, die der durch Scherung verursachten Desorption widerstehen, bilden Inseln auf der Oberfläche. Dies zeigt, dass laterale Wechselwirkungen zwischen Proteinen auf der Oberfläche ein Schlüsselmechanismus für die Adsorption unter Scherung sind. Homo-Oligomere sind aufgrund ihrer Stabilität und geringeren exponierten Oberflächen57 weniger anfällig für solche Wechselwirkungen und werden vom Wasserfluss leicht desorbiert. Daher wäre es ihre begrenzte Adsorption an der Oberfläche unter Scherung, die sie letztendlich stabilisieren würde, wenn sie den hier beschriebenen kombinierten Belastungen ausgesetzt werden.

Abschließend verglichen wir unsere mit YPE-Zellextrakt erzielten Ergebnisse mit den Daten zur Stabilität von gereinigtem BSA, Hb und α-syn im Lichte des vorgeschlagenen mechanistischen Modells (Abb. 1 und 10).

Aufgrund der in Tabelle S1 dargestellten Daten würden die meisten Menschen davon ausgehen, dass Hb thermisch und mechanisch stabiler ist als BSA und viel stabiler als α-syn. Allerdings ist der Hb-Verlust in Gegenwart von PP in den in Abb. 1 dargestellten Experimenten vergleichbar mit dem von α-syn und wichtiger als der von BSA. Daher scheint Hb, das als hartes Protein eingestuft wird, vergleichsweise empfindlicher gegenüber der hier diskutierten kombinierten Belastung zu sein als gegenüber milder thermischer Belastung oder reiner Scherbelastung. Tatsächlich dauert es drei Stunden oberhalb der ersten Schmelztemperatur von Hb (50 °C), um 5 % Verluste zu erreichen6,58 wohingegen dies hier mit einer Energie (10 kJ) erreicht werden kann, die, wenn sie zum Erhitzen verwendet würde, nur zu einem Ergebnis führen würde bis 2 °C Erhöhung des Mediums. Im Gegenteil scheint BSA gegenüber der kombinierten Belastung weniger empfindlich zu sein als gegenüber einer reinen Scherung, da nur 20 Minuten Scherbeanspruchung im Bereich von 1000 s−1 erforderlich sind, um einen Verlust von 4 %59 zu erreichen, der hier erst nach 24 Stunden beobachtet wird.

Auch wenn weniger Daten zur YPE-Stabilität verfügbar sind, müssen wir auch beachten, dass die ribosomalen und RNA-bindenden Proteine, die im YPE als empfindlicher gegenüber dem kombinierten Stress identifiziert wurden (unterstützende Datei Proteomic-SI1 und SI2), auch als solche identifiziert wurden thermostabiler im Proteommaßstab60.

Unsere Beobachtungen deuten daher darauf hin, dass die traditionelle Stabilitätsskala von Proteinen, die hauptsächlich auf thermischen Studien basiert, nicht auf alle Arten von Belastungen angewendet werden kann und dass Proteine, die als „weich und zerbrechlich“ beschrieben werden, unter bestimmten Bedingungen möglicherweise weniger empfindlich und langlebiger sind als „harte und stabile“.

In dieser Arbeit identifizierten wir die störende Wirkung schwankender Luft-/Flüssigkeitsgrenzflächen, verstärkt durch Fest-/Flüssigkeitsgrenzflächen und Scherspannung unter Rühren in komplexen Proteinlösungen. Dieser Effekt ist bei großen Proteinkomplexen stärker, es sind jedoch auch kleine kugelförmige Proteine ​​betroffen. Es ist stark genug, um die Zerstörung von Proteinen wie Hämoglobin auszulösen, was zur Bildung von gelartigen Proteinaggregaten in Mikrometergröße in Zellextrakten führt. Da so viele gleichzeitige Effekte erforderlich sind, um eine Proteindestabilisierung auszulösen, mag es überraschend erscheinen, dass eine Proteindestabilisierung so häufig auftritt. Allerdings kommt eine solche Kombination beim Umgang mit Proteinen sehr häufig vor. Alle Proteinlösungen werden während ihrer Herstellung oder Reinigung in Behältern aus verschiedenen Materialien gelagert oder analysiert. Schwankende Grenzflächen können beobachtet werden, wenn sich Wellen bilden, also sobald sich diese Behälter bewegen. Darüber hinaus bieten unsere Beobachtungen und das vorgeschlagene mechanistische Modell auch Hinweise zur Minimierung dieser Effekte. Entfernen Sie eine der Stresskomponenten – Material, Luft (auch teilweise) oder Bewegung – und die Proteine ​​bleiben erhalten.

Hefeproteinextrakte wurden aus dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm S288C (Matα SUC2 mal mel gal2 CUP1)61 mit Anpassungen des zuvor beschriebenen Protokolls15,16 hergestellt. Die Zellen wurden unter Schütteln bei 30 °C in einem synthetisch definierten Hefemedium (10 g L-1 Bacto-Hefeextrakt, 20 g L-1 Bacto-Pepton und 20 g L-1 Glucose) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 5 % Glycerin und einem Cocktail aus Proteaseinhibitoren (1X EDTA-frei von THERMOFISHER SCIENTIFIC und 1 mM PMSF) resuspendiert und mit einer French Press aufgebrochen. Der Zellextrakt wurde zentrifugiert (4000 U/min, 15 Min., 4 °C und 14.000 U/min, 40 Min., 4 °C) und der Überstand, der wasserlösliche Proteine ​​enthielt, wurde gewonnen. Die Konzentration des Hefeproteinextrakts wurde anhand der Absorption bei 205 nm mit einem Absorptionskoeffizienten von 31 L g−1 cm−162 bestimmt.

Rinderserumalbumin (BSA) wurde unter Verwendung von handelsüblichem lyophilisiertem Pulver (SIGMA, A7030) hergestellt. Es wurde in Wasser bis zu einer Konzentration von 30 g L−1 gelöst, unter Verwendung einer Membran mit einem Cut-off von 3500 kDa dialysiert und 5 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 g zentrifugiert. Die BSA-Konzentration wurde mittels Fluoreszenzspektroskopie bestimmt (Anregung: 279 nm, Emission: 300 bis 500 nm, Spaltbreite 4 nm, Volumen der Küvette 200 µL). Mithilfe der UV-sichtbaren Spektroskopie (siehe Tabelle S1) wurde eine Kalibrierungskurve erstellt, um die Emissionsintensität in Konzentration umzuwandeln. Für die Kalibrierungskurve wurden 8 Lösungen mit 12,5 bis 100 % BSA, verdünnt mit MilliQ-Wasser, realisiert. Die Summe der Signalintensität von 330 bis 340 nm wurde für jede Probe berechnet und als lineare Regression aufgetragen, um die Proportionalitätskonstante zwischen der Signalintensität und der BSA-Konzentration zu erhalten, die durch UV-sichtbare Spektroskopie bestimmt wurde.

Schweinehämoglobin (Hb) wurde aus Schweineblut gereinigt, das vom Schlachthof Harang, Houdan, Frankreich, mit Zustimmung der französischen Division Départementale de Protection des Populations geliefert wurde. Frisches Blut wurde sofort mit einer gerinnungshemmenden Lösung gemischt, bestehend aus 4,8 g/l Zitronensäure, 13,2 g/l Natriumcitrat und 14,7 g/l Dextrose in Milli-Q-Wasser (1:4 Volumen von Antikoagulans und Blut). ). Das Blut wurde bei 4 °C transportiert und sofort nach Ankunft im Labor gereinigt. Das Blut wurde zunächst zentrifugiert (5000 g, 10 min, 4 °C), um den lipidhaltigen Überstand durch Vakuumaspiration zu entfernen. Eine NaCl-Lösung mit 9 g L−1 wurde verwendet, um das Pellet mit einem Glasstab zu resuspendieren, um das entfernte Volumen auszugleichen und gleichzeitig die Ionenstärke beizubehalten. Die Lösung wurde erneut zentrifugiert (5000 g, 5 Min., 4 °C) und der Überstand entfernt. Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt. Die roten Blutkörperchen wurden durch osmotischen Schock durch Zugabe von 1:3 Volumen Milli-Q-Wasser bei 4 °C hämolysiert. 2,8 M Phosphatpuffer pH 7,0 wurde hinzugefügt, um die Membranen bei 4 °C auszufällen. Die Lösung wurde zentrifugiert (25.000 g, 20 Min., 4 °C) und der Überstand, der freies Hb enthielt, wurde gewonnen. Der Überstand wurde viermal für mindestens 2 Stunden in 40 Volumina Milli-Q-Wasser bei 4 °C durch eine Membran mit einem Cut-off von 3,5 kDa dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert (25.000 g, 10 min, 4 °C). Die Lösung wurde durch ein AG 501-X8-Harz geleitet, um das an Hb gebundene 2,3-Bisphosphoglycerat zu entfernen, und zentrifugiert (14.000 g, 15 Min., 4 °C). Die gereinigte Hb-Lösung wurde in gefüllten und verschlossenen Röhrchen aufbewahrt, um die Anwesenheit von Sauerstoff und die Oxidation von Hb zu vermeiden. Die Lösungen wurden eine Woche lang bei 6 °C gelagert und vor der Verwendung zentrifugiert (16.000 g, 5 Min., 4 °C). Das Fehlen von MetHb und die Hb-Konzentration wurden mittels UV-Vis-Spektroskopie gemessen (siehe Tabelle S1).

Zur Herstellung von α-syn wurden kompetente E. coli BL21(DE3)-Zellen mit dem Expressionsvektor pRK172, der für menschliches Wildtyp-α-syn kodiert, transformiert, auf LB-Agar-Petrischalen mit 200 mg/L Ampicillin ausplattiert und über Nacht bei 37 °C gezüchtet . Transformierte Kolonien wurden in 6 × 1-L-Kolben mit LB-Brühemedium, das 200 mg/L Ampicillin enthielt, gewonnen und bei 37 °C unter Rühren (180 U/min) gezüchtet. Als die Zellen eine optische Dichte von 0,6 bei 600 nm erreichten, wurde die Expression von α-syn durch Zugabe von 0,5 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) und weitere 3-stündige Inkubation bei 37 °C und 180 U/min induziert.

Anschließend wurden die Zellen durch 10-minütige Zentrifugation bei 5000 g und 4 °C geerntet, in 200 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 1 mM PMSF und 2 vollständige, EDTA-freie Proteaseinhibitor-Cocktailtabletten (Roche) resuspendiert und eingefroren bei − 80 °C.

Zur α-syn-Reinigung wurden die Zellen in einem Wasserbad bei 37 °C aufgetaut. Nach Zugabe von 1 mM PMSF und 2 cOmplete-Tabletten wurden die Zellen durch Ultraschallbehandlung auf Eis unter Verwendung eines Ultraschallprozessors Sonics Vibra cell 750 (40 % Amplitude, Zyklen von 20 s Ultraschallbehandlung mit 20 s Pausen für eine Gesamtbeschallungszeit von 300 s) lysiert. Die Extrakte wurden 25 Minuten lang bei 40.000 g zentrifugiert und der Überstand gewonnen. Ammoniumsulfatpulver (50 % Sättigung, d. h. 0,291 g/ml) wurde bei 4 °C unter Rühren zugegeben, um α-syn auszufällen. Ausgefällte Proteine ​​wurden bei 5000 g für 25 Minuten bei 4 °C pelletiert und in 400 ml 50 mM TrisHCl, pH 7,5, enthaltend 2 komplette Tabletten, resuspendiert, bis die Pellets vollständig gelöst waren. 0,05 % Polyethylenimin (Sigma) wurden zugegeben und die Probe 30 Minuten lang auf Eis inkubiert, um Nukleinsäuren auszufällen. Die Probe wurde dann 25 Minuten lang bei 4 °C und 5000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine XK 16/40 DEAE-Sepharose-Anionenaustauschsäule (GE Healthcare) (50 ml Bettharzvolumen) geladen, äquilibriert in 50 mM TrisHCl pH 7,5, 20 mM KCl, 1 mM β-Mercaptoethanol. Nach dem Waschen mit 200 ml des gleichen Puffers wurde die Elution mit einem linearen KCl-Gradienten (20 mM–1 M, 300 ml bei einer Flussrate von 4 ml/min) durchgeführt und Fraktionen von 4 ml gesammelt und bei –80 °C gelagert °C.

Die durch SDS-PAGE identifizierten Fraktionen von Interesse, die α-syn enthielten, wurden gepoolt und 20 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, um Proteinverunreinigungen auszufällen, während α-syn löslich blieb.

Die Probe wurde 20 Minuten lang bei 4 °C und 4000 g zentrifugiert und der Überstand gewonnen. Die Konzentration an gereinigtem α-syn wurde spektrophotometrisch bestimmt (siehe Tabelle S1). Reines α-syn wurde durch sterile 0,22-µm-Nitrozellulosefilter filtriert, aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Vor den Experimenten wurde α-syn gegen Wasser dialysiert und in einem 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) verwendet.

Alle Experimente wurden in einem Phosphatpuffer (100 mM, pH7) in einem Kühlraum (6 °C) durchgeführt. Für jedes Experiment mit YPE-Zellextrakt wurden drei biologische Replikate und drei technische Replikate für 27 Messungen gemessen. Für alle Experimente mit gereinigten Proteinen wurden drei Wiederholungen gemessen. Der Prozentsatz des Proteinverlusts wird als Durchschnitt und Standardabweichung dargestellt.

Der Effekt der Beschaffenheit des Röhrchens wurde bei 0,1 g L−1 Proteinen untersucht. Das Flüssigkeitsvolumen entspricht üblicherweise 60 % des Gesamtvolumens der Röhre. Vier Materialien wurden getestet: Polypropylen (PP) (15 ml Zentrifugenröhrchen, FISHERBRAND), Glas (PYREX), TEFLON (THERMOFISHER SCIENTIFIC), LOBIND (EPPENDORF). Die Oberfläche jedes Behälters betrug 50, 23, 85, 34 cm2 für PP-, LOBIND-, TEFLON- bzw. Glasröhrchen. Es wurde eine Kappe aus dem gleichen Material verwendet, mit Ausnahme der Glasröhrchen, bei denen die Kappen eine PTFE-Beschichtung hatten. Die Proteinlösungen wurden auf einem rotierenden Rad mit einem Durchmesser von 25 cm bei fester Rotationsgeschwindigkeit 24 Stunden lang vorsichtig gemischt. Referenzproben wurden unter den gleichen Bedingungen hergestellt, jedoch nicht gerührt. Der Geschwindigkeitseffekt wurde mit einer 10 ml-Lösung von YPE-Zellextrakt (0,1 g L−1) in PP-Röhrchen untersucht. Eine konstante Geschwindigkeit wurde für 24 Stunden auf 0, 3 und 30 U/min eingestellt. Der Effekt der Proteinkonzentration wurde mit einer 10-ml-Lösung von YPE-Zellextrakt durch 4-stündiges Mischen in PP-Röhrchen bei 3 U/min untersucht. Die Anfangskonzentration lag zwischen 0,01 und 0,5 g L−1. Der Volumeneffekt wurde mit YPE-Zellextrakt bei 0,1 g L−1 in PP-Röhrchen untersucht, indem die Lösungen 24 Stunden lang auf einem rotierenden Rad bei 3 U/min gemischt wurden. Es wurden fünf Lösungsvolumina verwendet: 1, 3, 10, 12,5 und 15 ml. Der Trocknungseffekt wurde durch Tauchbeschichtungsexperimente untersucht. Eine poröse PP-Membran mit einer Gesamtoberfläche von 1 cm2, hergestellt aus einem Einwegfiltergerät (0,45 µm, Puradisc 25 PP, WHATMAN), wurde mit einem Dip Coater DC von in eine 5 ml YPE-Lösung mit 0,1 g L−1 eingetaucht und daraus entnommen KSV. Die Geschwindigkeit wurde auf 170 cm/min eingestellt, mit einer Pause von 20 s zwischen jedem Eintauchen und Herausziehen (1 cm). Die Experimente wurden unter magnetischem Rühren bei Raumtemperatur über 24 Stunden in einer wassergesättigten Kammer durchgeführt, um die Verdunstung zu begrenzen. Es wurde jedoch ein leichter Flüssigkeitsverlust beobachtet. Daher wurde eine Korrektur der gemessenen Proteinkonzentration vorgenommen. Die Referenzproben wurden in der gleichen Umgebung ohne Tauchbeschichtung und Magnetrührung aufbewahrt. Schließlich wurde die Wirkung einer zusätzlichen Kunststoffoberfläche mit einer porösen PP-Membran (1 cm2) untersucht, die in 10 ml YPE mit 0,1 g L−1 gegeben und 24 Stunden lang bei 3 U/min auf einem rotierenden Rad gemischt wurde.

Die Desorptionsexperimente wurden mit 10 ml YPE bei 0,1 g L−1 in PP-Röhrchen durchgeführt. Drei Bedingungen wurden verglichen: (i) die Lösung wurde eingeführt und das Desorptionsprotokoll wurde direkt angewendet; (ii) die Lösung wurde 24 Stunden lang ohne Mischen bei 6 °C gelagert; (iii) die Lösung wurde 24 Stunden lang bei 6 °C mit 3 U/min gemischt. Das Desorptionsprotokoll besteht darin, die Röhrchen nacheinander in zwei Bechergläser mit 2,5 l bzw. 1 l Wasser einzutauchen und zu füllen (jeweils 120 s). Mit dieser Methode wurde das Austrocknen des Proteins an der Oberfläche vermieden. Der Gesamtverdünnungsfaktor betrug 4,106. Dann wurde 1 ml einer Lösung mit 0,1 % v/v Natriumdodecylsulfat (SDS) in die Röhrchen gegeben und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 3 U/min gemischt. Da SDS die Absorption bei 205 nm leicht verringert, wurden die Proteinkonzentrationen mithilfe einer mit SDS gemessenen Kalibrierungskurve korrigiert. Die Effizienz der Proteindesorption bei 0,1 % SDS wurde mithilfe der Protein-intrinsischen Fluoreszenz auf Kunststofffasern verifiziert (siehe Abbildung S4).

Die Länge der A/L/S-Dreifachschnittstelle wurde direkt an den Rohren durch Bildanalyse gemessen. Für Proben mit 1 und 15 ml Lösung wurden die A/L- und L/S-Grenzflächenoberflächen durch Kreissegmentberechnung bestimmt. Für andere Volumina konnte der Meniskus an der A/L-Grenzfläche vernachlässigt werden und die Oberflächen der A/L- und L/S-Grenzfläche wurden durch Bildanalyse gemessen. Die berechneten Minimal- und Maximalwerte entsprechen unterschiedlichen Positionen des Rohrs beim Mischen (horizontal oder vertikal).

DLS-Experimente wurden mit einem Zetasizer (MALVERN) durchgeführt. Nach der Filtration mit einem 1,2-µm-Filter wurden 400 µl in die Zellen eingebracht und nach 200 s Gleichgewicht bei 25 °C wurden drei Messungen für drei biologische Replikate bei 25 °C durchgeführt. Korrelogramme wurden mit einem REPES-Algorithmus analysiert, der mit dem GENDIST-Softwarepaket63,64 geliefert wird, um eine Intensitätsverteilung charakteristischer Zeiten zu erhalten. Der hydrodynamische Radius (RH) wurde nach dem Stoke-Einstein-Gesetz unter Verwendung einer dynamischen Viskosität von 8,9 × 10–4 Pa s berechnet.

Die Kontaktwinkel und Oberflächenspannungen von YPE auf den verschiedenen Materialien wurden mit einem Drop Shape Analyzer DSA 25 (KRÜSS) unter Verwendung der Advance Surface-Software gemessen. Die Kontaktwinkel wurden mit liegenden Tropfen gemessen. 5 µL wurden auf dem Substrat abgeschieden und die Messungen wurden unter Verwendung eines elliptischen Modells nach 60 s Gleichgewicht durchgeführt. Die Oberflächenspannungen wurden mit 20 µL hängenden Tropfen nach 180 s Gleichgewicht unter Verwendung des Young-Laplace-Modells gemessen. Die gemessenen Oberflächenspannungen von Proteinen betragen 48,0 ± 0,7 mN/m für YPE 25 g L−1 und 54,6 ± 1,3 mN/m für YPE 0,1 g L−1. Die Ergebnisse entsprechen dem Durchschnitt und der Standardabweichung von drei Wiederholungen.

Die Proteinaggregate wurden direkt in Lösung durch konfokale Raman-Mikroskopie mit einem WITec alpha300 RA-Instrument (OXFORD INSTRUMENTS, Deutschland) abgebildet. 10 µl Lösung wurden zwischen zwei Quarzglasfenstern (Esco Optics, USA) unter Verwendung eines selbstgebauten Parafilm-Abstandshalters in einer geschlossenen Attofluor-Zellenkammer (THERMOFISHER SCIENTIFIC, Frankreich) abgelagert. Raman-Bilder von 30 × 30 µm großen Bereichen, die auf den Aggregaten zentriert sind, wurden mit einer Anregungswellenlänge von 532 nm, einem 100 × Ölimmersionsobjektiv (NA 1,3), einem 600 g/mm-Gitter, einer Laserleistung von 10 mW, einer Belichtungszeit von 0,2 s und einem Schritt von 0,3 µm aufgenommen . Die entsprechenden Hellfeldbilder wurden im Reflexionsmodus mit demselben Objektiv aufgenommen. Raman-Bilder der Proteinaggregate wurden für zwei biologische Replikate gemessen. Die Analyse wurde für jedes biologische Replikat an mindestens zwei Proteinaggregaten wiederholt. Die Raman-Spektren von 0,1- und 25-g/L-Proteinlösungen wurden vor und nach dem Mischen auf einem rotierenden Rad mit einer Laserleistung von 10 mW, einer Belichtungszeit von 5 s und 10 Akkumulationen gemessen. Für jede Probe wurden mindestens 5 Spektren gemessen und gemittelt. Das Fehlen von Laserschäden wurde durch die Akkumulation einzelner Spektren an derselben Stelle bei derselben Leistung kontrolliert. Die Daten wurden mit der WITec Project Five-Software verarbeitet. Kosmische Strahlung wurde automatisch und manuell entfernt. Der Hintergrund wurde mittels Polynomanpassung (abgerundete Formfunktion der WITec-Software) subtrahiert. Raman-Bilder wurden durch Generieren von Spektralkomponenten aus der Intensitätsverteilung mithilfe automatisierter Komponentenanalyse und spektraler Entmischung (True Component Analysis der WITec-Software) erhalten. Das durchschnittliche Raman-Spektrum jeder Komponente wurde extrahiert. Hellfeld- und Raman-Bilder wurden in die Fidschi-Software exportiert.

Röhrchen, die 60 % ihres maximalen Volumens an YPE bei 0,25 g L−1 in einem Phosphatpuffer (100 mM) enthielten, wurden 24 Stunden lang bei 3 U/min und 6 °C gemischt. Die Konzentration wurde so gewählt, dass optimale Bedingungen für den Nachweis und die Quantifizierung gegeben sind. Proteomische Experimente wurden auf der Proteomic Analysis Platform von Paris Sud-Ouest (PAPPSO) durchgeführt. YPE-Proben wurden auf SDS-PAGE-Gelen abgelagert und die Proteine ​​mithilfe einer kurzen Migrationszeit getrennt. Es wurde ein klassisches Proteinverdauungsprotokoll angewendet (beschrieben in Ref. 65). Die Proben wurden mittels LC-MS/MS auf einem Orbitrap Fusion Lumos Tibrid (THERMO SCIENTIFIC) Massenspektrometer analysiert. Die Proteinidentifizierung wurde mithilfe der Proteindatenbank des Saccharomyces cerevisiae-Stamms S288c (41, 6750 Einträge, Version 2020) durchgeführt. Die angewandte Methode wurde von66 angepasst, um eine halbabsolute Quantifizierung zu erhalten. Quantifizierungen unter 5 fmol galten nicht als zuverlässig. Die Variationen der Proteinhäufigkeit wurden durch Vergleich mit einer Referenzprobe ermittelt, die dem Kunststoff ausgesetzt, aber nicht bewegt wurde. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD038266 beim ProteomeXchange Consortium 67 hinterlegt.

Um die Spezifität des auf der Polypropylenoberfläche adsorbierten Proteins zu bewerten, haben wir das folgende Monte-Carlo-Simulationsrahmenwerk entwickelt. Zuvor haben wir folgende Hypothesen aufgestellt: (1) Wenn der Effekt der Massenverarmung unspezifisch ist, sollten die Proteine ​​im Zellextrakt gleichmäßig abgereichert sein; (2) Proteinhäufigkeiten (Qabs) werden mithilfe der in 66 beschriebenen semiquantitativen Methode geschätzt. (3) Die für Simulationen verwendete Proteinhäufigkeitsvariabilität wird anhand der experimentellen Abweichungen der vier technischen Replikate geschätzt. Die gesamte Simulationsstrategie ist in Abbildung S9 dargestellt.

Das Ziel besteht darin, ausgehend von den vier Proben der vollständigen YPE-Schrotflintenquantifizierung vier Replikate zu generieren, die auf einen Zielmassenverlust von τ % abgereichert wurden. Für jedes durch LC-MS/MS nachgewiesene Protein: (1) haben wir den semiquantitativen Index Qabs für jedes der vier Replikate berechnet; (2) diese Konzentrationsmessungen wurden in Molekülsätze der Größe N = Qabs x Avocoef umgewandelt, wobei Avocoef = 5,106 eine Avogadro-ähnliche Zahl ist; (3) Diese Molekülsätze (einer pro Protein) wurden zufällig ausgewählt und die Größe des Satzes verringerte sich um eine Einheit. Dieser Probenahmevorgang wurde wiederholt, bis ein Gesamtmassenverlust von τ % erreicht wurde. (4) Anschließend wurden die heruntergestampften Molekülsätze wieder in den semiquantitativen Index Qabs umgewandelt. (5) Für jedes Protein wurden die Qabs-Werte der vier vollständigen YPE-Replikate und der vier simulierten Molekülsatz-Replikate unter Verwendung einer Bayes'schen Version des t-Tests68 verglichen. Der Gesamtvorgang von Schritt 2 bis 5 wurde 100 Mal wiederholt.

Die spezifische Oberfläche des Filters wurde durch Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) gemessen. Die präsentierten Daten entsprechen einem Durchschnitt von 2 Messungen unter Vakuum, durchgeführt an einem Xeuss 2.0 Kupferaufbau von XENOCS mit 3600 s Zählzeiten und einem Abstand von Probe zu Detektor von 2,5 m.

Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD038266 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Die vollständigen Proteinlisten, die einen signifikanten Konzentrationsunterschied vor und nach dem Rühren aufweisen, sind auch in SI (Proteom-SI1 und SI2) verfügbar. Die anderen Daten sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Stephanie Devineau

Universität Paris-Saclay, CEA, CNRS, Institut für Integrative Biologie der Zelle (I2BC), 91198, Gif-Sur-Yvette, Frankreich

Jean-Christophe Aude, Stéphane Chédin, Laura Pieri und Yves Boulard

Universität Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Micalis Institute, PAPPSO, 78350, Jouy-en-Josas, Frankreich

Céline Henry & Aarón Millán-Oropeza

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JPR, YB, SP und GB waren am Studiendesign und seiner Umsetzung beteiligt. MS und JPR haben das Manuskript geschrieben. MS und FS führten Destabilisierungsexperimente durch. MS und TP analysierten die DLS-Experimente. SD hat die Raman-Analyse entworfen. LP und FS bereiteten die gereinigten Proteinproben vor. MS und SC stellten die Gesamtproteinextrakte her. FS führte die Materialanalyse durch. JCA, AMO und CH führten die Proteomanalyse durch. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Marion Schvartz oder Jean-Philippe Renault.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schvartz, M., Saudrais, F., Devineau, S. et al. Eine Studie im Proteommaßstab zeigt, wie Kunststoffoberflächen und Bewegung die Proteinaggregation fördern. Sci Rep 13, 1227 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28412-7

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Eingegangen: 29. November 2022

Angenommen: 18. Januar 2023

Veröffentlicht: 21. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28412-7

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