Herstellung und Charakterisierung einer auf Chitosan basierenden Nanoabgabeplattform zur Verbesserung der Krebsbekämpfungsergebnisse von Sorafenib bei hepatozellulärem Karzinom

Jun 17, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12180 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Chitosan-Nanopartikel (CS-NPs) zeigten vielversprechende Ergebnisse bei der Arzneimittel-, Impfstoff- und Genabgabe zur Behandlung verschiedener Krankheiten. Die große Aufmerksamkeit für CS war auf seine herausragenden biologischen Eigenschaften zurückzuführen. Die größte Herausforderung bei der Anwendung von CS-NPs bestand jedoch in ihrer größenkontrollierten Synthese. Dabei wurde die ionische Gelierungsreaktion zwischen CS und Natriumtripolyphosphat (TPP), einem weit verbreiteten und sicheren CS-Vernetzer für biomedizinische Anwendungen, genutzt. Die Entwicklung einer Nanoabgabeplattform, nämlich Sorafenib-beladene Chitosan-Nanopartikel (SF-CS-NPs), wurde entwickelt, um die Abgabe von SF-Arzneimitteln an menschliche Zelllinien des hepatozellulären Karzinoms (HepG2) zu verbessern. Die NPs wurden mithilfe einer ionischen Gelierungstechnik künstlich hergestellt. Eine Reihe von CS-NPs, die mit SF beladen waren, wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Natriumtripolyphosphat (TPP) hergestellt. Diese Konzentrationen betrugen 2,5, 5, 10 und 20 mg/ml und werden als SF-CS NPs 2,5, SF-CS NPs 5,0, SF-CS NPs 10 bzw. SF-CS NPs 20 abgekürzt. DLS, FTIR, XRD, HRTEM, TGA und FESEM mit EDX und TEM wurden für die physiochemische Charakterisierung von SF-CS-NPs verwendet. Sowohl DLS- als auch HRTEM-Techniken zeigten, dass kleinere Partikel erzeugt wurden, wenn der TPP-Gehalt erhöht wurde. In einer PBS-Lösung mit einem pH-Wert von 4,5 zeigte das SF eine effiziente Freisetzung aus den Nanopartikeln, was zeigt, dass der Abgabemechanismus für Tumorzellen wirksam ist. Die Zytotoxizitätsuntersuchung zeigte, dass ihre Antikrebswirkung gegenüber HepG2-Zelllinien der von freiem SF deutlich überlegen war. Darüber hinaus zeigte das Nanoarzneimittel keine nachweisbare Toxizität gegenüber normalen erwachsenen menschlichen dermalen Fibroblastenzelllinien (HDFa). Dies ist ein Schritt hin zur Entwicklung eines wirksameren Systems zur Verabreichung von Krebsmedikamenten mit verzögerter Freisetzung, das letztendlich die Art und Weise, wie Krebs behandelt wird, verbessern wird.

Makromolekulare Chemiker führten erfolgreich eine Krebstherapie mit Nanomaterialien durch, wobei der Schwerpunkt auf der Wirt-Gast-Technik lag. Die Erfindung von Nanoabgabegeräten, die therapeutische Chemikalien enthalten, hat die therapeutische Wirksamkeit mehrerer Krebsmedikamente erhöht. Polymere Nanoträger wurden kürzlich entwickelt, um Medikamente effizient zu laden, diese Medikamente kontrolliert und nachhaltig freizusetzen und genügend Medikamente an Krankheitsstellen anzusammeln. Moderne traditionelle Krebstherapien wie rigorose Chemotherapie, Bestrahlung, Operation und Immuntherapie zeichnen sich durch hohe Toxizität, Medikamentenverluste, Schädigung gesunder Organe oder Zellen, unspezifische Verteilung und erhebliche Nebenwirkungen aus, die alle zur Lebensqualität der Patienten beitragen. schlechte Prognose. Herkömmliche Behandlungen von Leberkrebs sind mit Problemen wie Medikamentenverlust, Medikamentenclearance, Medikamentenresistenz und Medikamentenakkumulation an der Tumorstelle behaftet. Therapeutische Nanoabgabetechnologien bieten gegenüber der regulären Krebsbehandlung mehrere Vorteile. Therapeutische Verabreichungsmethoden sind in der Klinik von entscheidender Bedeutung, da Medikamente geladen, eingekapselt, effizient von den Zellen aufgenommen, im Laufe der Zeit langsam freigesetzt und in den Krebszellen gespeichert werden müssen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, effizientere und effektivere Nanoträger-Arzneimittelverabreichungsmethoden zu entwickeln, um die Behandlung mit angemessenen Arzneimittelkonzentrationen und einer hervorragenden Therapiedauer zu den spezifischen betroffenen Bereichen oder Krebszellen zu transportieren. Um die negativen Auswirkungen einer Chemotherapie, die sich im Körper manifestieren könnten, zu bekämpfen, ist dies erforderlich.

Die häufigste Form von Leberkrebs, das Hepatozelluläre Karzinom (HCC), auch Hepatom genannt, macht 85 bis 90 % der Fälle aus1. Aufgrund der weiten Verbreitung des Hepatitis-B-Virus (HBV) in diesen Regionen kommt HCC in ärmeren Ländern überproportional häufig vor. Leider steigen in den Industrienationen sowohl die Gesamtsterblichkeitsrate als auch die speziell auf HCC zurückzuführende Sterblichkeitsrate. Das durch HCV verursachte hochgradige hepatozelluläre Karzinom ist die am schnellsten wachsende Krebserkrankung weltweit. Sowohl öffentliche Gesundheitsorganisationen als auch klinische und biologische Grundlagenforscher denken ständig über Möglichkeiten nach, die steigenden Sterblichkeitsraten aufgrund von HCC aktiv einzudämmen. Um die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von HCC bei Hochrisikopersonen zu verringern, können die folgenden Maßnahmen ergriffen werden:

Die Kontrolle von Risikofaktoren oder die Verringerung der Wahrscheinlichkeit, dass Risikopersonen an Kopf-Hals-Tumoren erkranken, sind die Ziele der vorbeugenden Maßnahmen, die als HCC-Präventionsmaßnahmen bezeichnet werden.

Überwachung zur Früherkennung von HCC in einem behandelbaren Stadium

Verbesserung der Behandlung von Personen mit diagnostiziertem HCC

Bessere Patientenklassifizierung für eine bessere Auswahl der den Patienten zur Verfügung gestellten Therapiemodalitäten, um die Heilungs- und Überlebensraten zu verbessern.

Einführung innovativer Therapieansätze zur Behandlung von HCC

Studien zufolge handelt es sich bei SF um einen oral verabreichten Multikinase-Inhibitor, der über antiproliferative, antiangiogene und proapoptotische Mechanismen erhebliche krebshemmende Wirkungen hat2. Raf-1, B-Raf, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, der Rezeptor für aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktoren (PDGFR-), FLT-3, Ret und c-Kit sind alle herunterreguliert. Es wurde festgestellt, dass Raf-Protein ein wichtiger Bestandteil der RAS/MEK/ERK-Signalkaskade ist. Der MAPK/ERK-Weg besteht aus drei nacheinander aktivierten Proteinkinasen, die entscheidende Vermittler einer Vielzahl zellulärer Schicksale sind, darunter Wachstum, Proliferation und Überleben. Andererseits wurde festgestellt, dass die SF-Injektion die Aktivierung des Hypoxie-induzierbaren Faktor-1-Proteins (HIF-1) hemmt3,4. Die Modulation der antiangiogenetischen Wirkung hängt entscheidend vom HIF-1-Protein ab. Darüber hinaus hat SF die Expression des antiapoptotischen myeloischen Zellleukämie-1-Proteins (Mcl-1) erfolgreich herunterreguliert, was die proapoptotische therapeutische Wirksamkeit in Kombinationstherapie mit anderen Krebsmedikamenten steigern kann5,6. Abbildung 1 zeigt einen Überblick über den SF-Hemmungsprozess.

Wirkungsmechanismus von SF zur Krebsbehandlung7.

Als Nanopartikel werden Materialien definiert, deren Abmessungen im Nanobereich liegen, genauer gesagt unter 100 nm. In jüngster Zeit haben diese Substanzen in der modernen Medizin an Bedeutung gewonnen und finden in verschiedenen Bereichen Anwendung, beispielsweise als Kontrastmittel in der medizinischen Bildgebung und als Träger für den Gentransport in einzelne Zellen. Nanopartikel besitzen einzigartige Eigenschaften, die sie aufgrund ihrer Größe von Massenmaterialien unterscheiden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf chemische Reaktivität, Energieabsorption und biologische Mobilität. Für die moderne Medizin bieten Nanopartikel zahlreiche Vorteile. Es gibt bestimmte Szenarien, in denen die Verwendung von Nanopartikeln Analysen und Therapien ermöglicht, die sonst nicht möglich wären.

Um die krebshemmende Wirkung von Sorafenib-Medikamenten auf Leberkrebszelllinien zu verbessern, soll in dieser Arbeit die Formulierung von SF-CS-NPs durch Anpassung der TPP-Menge optimiert werden. Mithilfe der Ionengelierungstechnik reagierte die Phosphatgruppe in TPP mit der Amingruppe in Chitosan und bildete Vernetzungen, die die Synthese der SF-CS-NPs ermöglichten. Um die therapeutische Wirkung zu optimieren, können die Vernetzungseigenschaften der Nanopartikel zwischen Chitosanketten und ihre Wechselwirkung mit TPP angepasst werden. Die Wirksamkeit des resultierenden Nanopartikels wird durch physikalisch-chemische Charakterisierung, In-vitro-Freisetzung und Antikrebsaktivität durch MTT-Assay an Leberkrebszelllinien bewertet.

Alle Chemikalien wurden von renommierten Lieferanten bezogen: Sigma Aldrich (Saint Louis, MO, USA) lieferte Chitosanpulver [niedriges Molekulargewicht (LMW), Deacetylierung 75–85 %], Merck lieferte Natriumtripolyphosphat (TPP), Hamburg Industries Inc. (Deutschland). ) lieferte Essigsäure (99,8 %), und Laboratory & Scientific Enterprise (Malaysia) lieferte Dimethylsulfoxid (99 %). Die Medikamente Tween 80 und SF wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Das gesamte Experiment wurde mit entionisiertem Wasser (18,20 MΩ cm−1) durchgeführt. Primäre dermale Fibroblasten: Normal, menschlich, Erwachsene (HDFa) (ATCC® PCS-201-012™), hepatozelluläre Karzinomzellen (HepG2-ATCC® HB-8065™) wurden von ATCC (AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION, PO BOX) erworben 1549, Manassas, VA 20,108, USA).

In dieser Untersuchung wurde die ionische Gelierungsmethode zur Herstellung von SF-CS-NPs verwendet (Abb. 2). LMW-Chitosanpulver (0,5 mg/ml) in der 1,0 %igen (v/v) Essigsäurelösung war vollständig gelöst8,9. Anschließend wurden 1,0 g SF-Medikamente in 100 ml DMSO gelöst. Unter ständigem Rühren wurden Arzneimittellösungen und TWEEN-80-Tensid in einer Konzentration von 2,0 % (Vol./Vol.) in die wässrige Lösung mit dem gelösten Chitosan gegeben. Parallel dazu wurde eine Lösung von TPP in Konzentrationen von 2,5, 5,0, 10,0 und 20,0 mg/ml in Wasser hergestellt. Die TPP-Lösung wurde mit einer Bürette tropfenweise zur Chitosan-Arzneimittellösung gegeben. Die Suspension wurde 10 Minuten lang bei 4000 U/min zentrifugiert und anschließend dreimal mit Wasser gewaschen. Um die weitere Analyse und Zytotoxizitätsprüfung zu erleichtern, wurde die Probe gefriergetrocknet.

Schematische Darstellung der ionischen Gelierungsmethodik 10.

In dieser Studie wurde ein Nanosizer (Malvern Instruments, Malvern, UK) verwendet, um die Partikelgrößenverteilung der SF-CS-NPs zu bestimmen. Zur Untersuchung der morphologischen Merkmale und der Größenverteilung wurde hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM; Hitachi H-7100, Tokio, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV verwendet. Zur Beurteilung der Partikelgrößenverteilung wurde ein Bildverarbeitungsprogramm namens ImageJ verwendet. Ein Tropfen verdünnter SF-CS-NPs-Lösungen wurde auf Kupfergitter mit einer Maschenweite von 300 und Kohlenstofffilme aufgetragen. Die Proben wurden vor der HRTEM-Analyse luftgetrocknet. Der nächste Schritt bestand in der Durchführung einer thermogravimetrischen und differentiellen thermogravimetrischen Analyse (TGA/DTG) der Nanopartikel mit einem Mettler-Toledo-Gerät bei Temperaturen von 25 bis 1000 °C und einer Heizrate von 10 °C pro Minute. Die Geometrie und Morphologie von SF-CS-NPs-Nanopartikeln wurden mit einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (FESEM, NOVA NANOSEM 230, NovaTM NanoSEM 230 – FEI Corporation, CA, USA) untersucht. Die flüssigen Nanopartikellösungen wurden auf einen Stummel gegeben, in einem Ofen getrocknet und dann untersucht11,12. Energiedispersive Röntgenspektroskopie in Kombination mit FESEM (FESEM-EDX, NOVA NANOSEM 230, NovaTM NanoSEM 230 – FEI Corporation, CA, USA) wurde verwendet, um die Zusammensetzung der produzierten SF-CS-NPs zu bestimmen13. Das EDX-Spektrum wurde verwendet, um die Atom- und Gewichtsprozente der in der Probe vorhandenen Elemente zu quantifizieren, nicht nur Sauerstoff, Stickstoff, Wasserstoff, Schwefel und Kohlenstoffverbindungen. Um die Beladungseffizienz und Wirkstofffreisetzung der SF-CS-NPs zu bestimmen, wurde ein Ultraviolett-Vis-Spektrophotometer (UV-Vis) verwendet. Die FTIR-Untersuchung von SF-CS-NPs wurde mit einem FTIR-Spektrometer (PerkinElmer1725X-Spektrophotometer) durchgeführt. FTIR-Spektren mit dem Kaliumbromid-Pellet (1,5 mg Probe + 150 mg Kaliumbromid) wurden verwendet, um den erfolgreichen Aufbau der Nanopartikel zu überprüfen. Die Auflösung des Instruments betrug 4 cm−1. Untersucht wurde der Bereich von 600 bis 4000 cm−1 in den FTIR-Spektren.

Eine Effizienzkurve für die Wirkstoffbeladung wurde mit einem Wellenlängenbereich von 200–500 nm erstellt. Insgesamt wurde 1 ml Methanol mit 10 mg SF-CS-NP-Pulver aus jeder Probe versetzt. Die Konzentration des Medikaments wurde dann mithilfe der UV-Vis-Spektroskopie und der Spitzenwellenlänge der Absorption berechnet. Mit diesem Ansatz konnten wir die Verkapselungseffizienz (EE%) und den Beladungsgehalt (LC%) von SF-CS-NPs bestimmen.

Synthetisierte Nanopartikel (SF-CS-NPs) setzten Arzneimittel auf eine Weise frei, die der in einem Artikel von Jasim und Mitarbeitern (2022) beschriebenen Methode ähnelte und in einigen Aspekten mit ihr identisch war. Um die wirkstoffbeladenen Nanopartikel (10 mg) zu resuspendieren, wurde eine phosphatgepufferte Lösung (PBS) mit pH 7,4 und 4,8 bei 37 °C unter mäßigem und kontinuierlichem Schütteln bei 400 U/min unter Verwendung eines Orbitalschüttlers verwendet. Schließlich wurden den zentrifugierten Proben in vorgegebenen Abständen (0,5, 1, 2, 4, 6, 12 und 24 Stunden und später alle 24 Stunden bis zu 7 Tagen) 3 ml-Aliquots des Überstands entnommen. Zum Nachfüllen der Spritze verwendeten sie frische PBS-Lösung. Zur Untersuchung des verschwendeten Überstands wurde UV-Vis-Spektrophotometrie eingesetzt. Tatsächlich wurden drei verschiedene Messungen durchgeführt.

Die Wirkstofffreisetzung aus den SF-CS-NPs basierte auf dem von Jasim et al. veröffentlichten Ansatz und war in gewisser Weise mit diesem identisch. (2022). Zehn Milligramm SF-CS-NPs wurden in 10 ml phosphatgepufferter Lösung (PBS) mit pH 7,4 und 4,8 bei 37 °C unter mäßigem und kontinuierlichem Schütteln bei 400 U/min unter Verwendung eines Orbitalschüttlers resuspendiert. Anschließend wurden in regelmäßigen Abständen 3-ml-Aliquots des Überstands aus den zentrifugierten Proben entnommen (0,5, 1, 2, 4, 6, 12 und 24 Stunden und später alle 24 Stunden bis zu 7 Tagen). Sie füllten die Spritze wieder mit einer neuen PBS-Lösung. Die Analyse des verworfenen Überstands wurde mittels UV-Vis-Spektrophotometrie durchgeführt. Es wurden drei separate Messreihen durchgeführt.

Das Zellüberleben und die Zytotoxizität von SF-CS-NPs wurden in einer Reihe verschiedener Zelllinien mithilfe des Methylthiazoltetrazolium (MTT)-Assays bewertet14,15. In dieser Studie wurden sowohl die HepG2-Zelllinie als auch die HDFa-Zelllinie verwendet, um die Toxizität der Nanopartikel zu bewerten. HepG2-Zellen wurden in Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (PS; 100 U/ml), kultiviert, wohingegen HDFa-Zellen in Fibroblasten-Basalmedium mit dem Fibroblast Growth Kit gezüchtet wurden -Serumfrei (ATCC® PCS-201-040). Bei einer Konfluenz von 80 % wurden die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Mit Trypsin in einer Konzentration von 0,1 % wurden die Zellschichten geerntet. SF-CS-NPs wurden zu Kulturplatten mit 96 Vertiefungen gegeben, die Zellen enthielten, die in einer Dichte von 1 × 104 Zellen pro Vertiefung ausgesät worden waren. Anschließend wurden die Platten für 24 Stunden in einen Inkubator gestellt. Dies sind die Schritte zur Berechnung des relativen Zelllebensfähigkeitsprozentsatzes:

Die maximale Ausbeute der Reaktion wurde bei 5 mg/ml TPP aufgezeichnet, wie in Tabelle 1 gezeigt, und selbst nach Erhöhung der TPP-Konzentration blieb die Ausbeute relativ ähnlich. Bei einer Konzentration von 2,5 mg/ml war die Reaktionsausbeute am niedrigsten. Die Ergebnisse des Beladungsgehalts (LC) und der Einkapselungseffizienz (EE) von SF zeigten kein eindeutiges Muster, wenn die TPP-Konzentrationen erhöht wurden. LC und EE erreichten eine maximale Konzentration von 5 mg/ml, sanken jedoch bei 10 und 20 mg/ml TPP. Dies kann auf die geringeren Nanopartikelgrößen von SF-CS-NPs mit einer TPP-Konzentration von 10 mg/ml und 20 mg/ml, SF-CS-NPs10 und SF-CS-NPs20 zurückzuführen sein (die Größen der Nanopartikel werden später besprochen).

Die Morphologie der Partikel wurde aus HRTEM-Bildern abgeleitet, indem der genaue Durchmesser, die Größenverteilung, die Form und das Grenzflächenbild der Nanopartikel in der Lösung untersucht wurden. Jedes der erzeugten Nanopartikel nahm die Form einer Kugel an, wie in Abb. 3 dargestellt. Außerdem konnte beobachtet werden, wie sich die TPP-Konzentration auf die Ergebnisse auswirkte, wobei mit steigender TPP-Konzentration der mittlere Durchmesser abnahm. Bei 2,5 mg/ml, der niedrigsten Konzentration, zeigten SF-CS-NPs 2.5 die relativ größten kugelförmigen Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 212,4 ± 59,7 nm, gefolgt von SF-CS-NPs 5 und SF-CS-NPs 10 (5 und 10 mg/ml). mL TPP) mit mittleren Durchmessern von 24,1 ± 10,2 bzw. 16,6 ± 3,0 nm. Die SF-CS-NPs 20 zeigten auch die vergleichsweise niedrigste sphärische Partikelgröße mit einem mittleren Durchmesser von 9,2 ± 2,0 nm bei der maximalen TPP-Konzentration von 20 mg/ml.

HRTEM-Bilder und Partikelgrößenverteilung von (A, E) SF-CS-NPs 2,5, (B, F) SF-CS-NPs 5,0, (C, G) SF-CS-NPs 10 und (D, H) SF-CS-NPs 20 .

Die Partikelgrößenverteilung wurde auch im solvatisierten Zustand untersucht, wobei Moleküle des Lösungsmittels (deionisiertes Wasser) mit den Partikeln interagierten. Abbildung 4 zeigt ein ähnliches Muster, bei dem eine Erhöhung der TPP-Konzentration zu einer Verringerung der Größe der erzeugten Nanopartikel führte, was höchstwahrscheinlich auf die Adsorption von Ionen mit entgegengesetzten Ladungen im Lösungsmittelmedium (deionisiertes Wasser) zurückzuführen ist. Es ist allgemein bekannt, dass die freien Aminogruppen in Chitosan mit der negativen Ladung des multivalenten Anions TPP interagieren, um in einer sauren Umgebung CS-TPP-Nanopartikel zu erzeugen. Dieser Prozess wandelt –NH2 in –NH3+ um. Von nun an führte eine stärkere inter- und intramolekulare Vernetzung zwischen Chitosan und TPP zu geringeren Partikelgrößen, wenn die TPP-Konzentration erhöht wurde.

Partikelgrößenverteilung von SF-CS-NPs, bereit bei zahlreichen TPP-Konzentrationen, (A) 2,5, (B) 5, (C) 10 und (D) 20 mg/ml.

Die Oberflächenmorphologie der synthetisierten Nanopartikel wurde vom FESEM beobachtet (Abb. 5). Eine EDX-Analyse in Verbindung mit FESEM wurde durchgeführt, um die Zusammensetzungsanalyse von SF-CS-NPs 5.0 zu untersuchen. Eine FESEM-Analyse der SF-CS-NPs 5.0 bestätigte die sphärische Natur der Nanopartikel. Darüber hinaus ist in Abb. 5 der Einschluss der Elemente C, N, O, F, S und Cl dargestellt, was beweist, dass alle Verbindungen in den endgültigen Nanopartikeln, SF-CS-NPs 5,0, enthalten waren. In Bezug auf Atomprozentsätze und Molekulargewichte waren Kohlenstoff und Sauerstoff am häufigsten, wohingegen Stickstoff, Fluor, Schwefel und Chlor aufgrund der Anwesenheit der Medikamente vorhanden waren. Der beobachtete Cl-Peak kann auf die Anwesenheit von SF zurückgeführt werden.

FESEM-Bilder von SF-CS-NPs 5.0 in Verbindung mit EDX-Spektren.

Abbildung 6 zeigt die XRD-Muster reiner SF-, CS-NPs und gebildeter SF-CS-NPs mit unterschiedlichen TPP-Konzentrationen. Reines SF hatte eine starke Reflexion bei 2θ = 25,1°, wie in Abb. 6 zu sehen ist, was darauf hindeutet, dass es extrem kristalliner Natur ist. CS-NPs hingegen hatten einen breiten Peak, was darauf hindeutet, dass es sich um eine amorphe Art von Substanz handelt. Ein großer amorpher Peak wurde für die Nanopartikel SF-CS NPs 2.5, SF-CS NPs 5.0, SF-CS NPs 10 und SF-CS NPs 20 beobachtet, was auf eine hohe Konzentration der Chitosanphase hinweist, hinter der sich der kristalline Peak von SF befindet wurde begraben, als sie in den CS NPs eingeschlossen wurden. Breite Peaks bei Beugungswinkeln 2θ von 12,4, 21,7 und 24,3° stimmten mit dem Peakmuster von reinem SF überein, was darauf hinweist, dass SF in der Chitosan-Matrix eingekapselt war.

XRD-Muster von (A) CS-NPs, (B) reinem SF, (C) SF-CS-NPs 2,5, (D) SF-CS-NPs 5,0, (E) SF-CS-NPs 10 und (F) SF-CS-NPs 20.

Abbildung 7 zeigt die Fourier-Transformations-Infrarotspektren (FTIR) für reines SF, CS-NPs, SF-CS-NPs 2,5, SF-CS-NPs 5,0, SF-CS-NPs 10 und SF-CS-NPs 20, die zur Schlussfolgerung verwendet werden können das Vorhandensein und die Wechselwirkung von adsorbierten Molekülen und beschichteten Molekülen, die an die Oberflächenschichten der Nanopartikel gebunden sind. Die Absorptionsbanden wurden durch Scannen eines Spektrums zwischen 600 und 4000 cm−1 nachgewiesen.

FTIR-Spektrum von (A) reinem SF, (B) CS-NPs, (C) SF-CS-NPs 2,5, (D) SF-CS-NPs 5,0, (E) SF-CS-NPs 10 und (F) SF-CS-NPs 20.

Für reines SF ist der Peak bei 1642 cm−1 charakteristisch für die C=O-Amidgruppe. Die C-H-Streckschwingungsbande hat eine Begleitbande bei 3078 cm−1 und die Amid-C=O-Gruppe hat eine charakteristische Bande bei 1738 cm−1. Die Bande bei 1022 cm−1 wurde hingegen durch die Phosphatgruppe in TTP verursacht. Darüber hinaus hatten CS-NPs charakteristische breite Banden bei 1647 und 1588 cm−1, die als Ausdruck der Streckung der Biegeschwingung der CO-NH2-Gruppe interpretiert wurden. Die CO-Gruppe der Carbonsäure führt dazu, dass eine Bande bei 1302 cm−1 und 1128 cm−1 erscheint. Nanopartikel mit den hergestellten SF-CS-NPs 2.5, SF-CS-NPs 5.0, SF-CS-NPs 10 und SF-CS-NPs 20 hatten Banden bei 3332, 3294, 1704, 1641, 1556 und 1202 cm−1. Die 679-cm-1-Bande der SF-CS-NPs ist ein Ergebnis der C-Cl-Streckung des Arzneimittels. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Biegeschwingung der CO-NH2-Gruppe nur in ChNPs gestreckt ist, was durch breite Banden bei 1647 und 1588 cm−1 angezeigt wird. Alle hergestellten Nanopartikel zeigten die CS-TTP-Signaturbanden, was beweist, dass das SF erfolgreich in der Chitosan-Matrix eingekapselt wurde.

Mit einem Thermoanalysator wurde die thermische Stabilität der SF-CS-NPs 2.5, 5.0, 10 und 20 untersucht. Die Ergebnisse der TGA/DTG-Thermogramme sind in Abb. 8 dargestellt. Die Ergebnisse liefern quantitative Details zur Zusammensetzung der Nanostrukturen. Die SF-CS-NPs 2.5, SF-CS-NPs 5.0, SF-CS-NPs 10 und SF-CS-NPs 20 zeigten vergleichbare vierphasige Gewichtsverlustmuster, wie in Abb. 8 dargestellt. Gewichtsverlust bei Temperaturen zwischen 28 und 100 ° C wurde auf die Freisetzung von Wasser (Verlust von Wasserstoffbrückenbindungen) zurückgeführt. Im Gegensatz zur dritten und vierten Phase, die zwischen 69 und 180 °C stattfand, wurde die zweite Phase durch den Abbau von Chitosan ausgelöst. Der endgültige Rückstand der TGA-Studie lag zwischen 20 und 30 Prozent, was die höhere thermische Stabilität von Chitosan belegt.

TGA/DTG-Thermogramme von (A) SF-CS-NPs 2,5, (B) SF-CS-NPs 5,0, (C) SF-CS-NPs 10 und (D) SF-CS-NPs 20.

Die therapeutische Wirksamkeit des Medikaments hängt stark von der Art der Wirkstofffreisetzung aus dem Nanoträger ab, die aufrechterhalten werden muss, damit das Abgabesystem nach der Verabreichung wirksam ist. Eine kontrollierte Medikamentenabgabe hat das Potenzial, Medikamentendosierungen zu reduzieren, systemische Nebenwirkungen zu minimieren und die Wirkungsdauer therapeutischer Medikamente zu verlängern. Die aus SF-CS-NPs 20 freigesetzte SF-Menge wurde mithilfe von In-vitro-Freisetzungstests in PBS 7,4 und PBS pH 4,5 gemessen. Zur Simulation der physiologischen Bedingungen der Zellen und der sauren Tumormikroumgebung wurden pH-Werte von 4,5 bzw. 7,4 verwendet. Den gleichen Phasen folgten SF-CS-NPs 20, die zunächst in den ersten 24 Stunden schnell, dann in den nächsten 48 Stunden langsam und schließlich stetig freisetzten. Die konstante Freisetzung von SF, die SF-CS-NPs 20 in Abb. 9A zeigen, lässt darauf schließen, dass SF innerhalb der Nanopartikel stabil ist. Der 169-Stunden-Zeitraum endete mit einer erfolgreichen vollständigen Entladung. Abbildung 9 zeigt, dass 92 % des nach 72 Stunden freigesetzten SF bei einem pH-Wert von 4,5 erreicht wurden, im Gegensatz zu 84 % bei einem pH-Wert von 7,4 für die 20 SF-CS-NPs-Proben zum gleichen Zeitpunkt. Der 169-Stunden-Zeitraum endete mit einer erfolgreichen vollständigen Entladung. Diese Freisetzungsprofile zeigten, dass SF-CS-NPs 20 SF bei pH 4,5 statt bei pH 7,4 freisetzen können, was SF anfälliger für die Freisetzung machen könnte.

Kumulative Freisetzungsprofile von SF aus (A) SF-CS-NPs 5 und SF-CS-NPs 20 bei pH 4,5 und (B–F) die Anpassung der Daten unter Verwendung von fünf verschiedenen mathematischen Modellen bei verschiedenen pH-Werten 4,5.

Aufgrund der zahlreichen physikalisch-chemischen Variablen, die bei der Verabreichung von Medikamenten oder der Freisetzung aus Nanoträgern eine Rolle spielen, sind mathematische Modelle erforderlich. Abbildung 9B zeigt die linearen Anpassungen an fünf alternative kinetische und mathematische Modelle, die verwendet wurden, um die Daten der SF-Freisetzung aus Nanopartikeln (F) anzupassen. Formel 4, in der K1 die Geschwindigkeitskonstante und qe und qt die im Gleichgewicht bzw. zu jedem Zeitpunkt (t) freigesetzten SF-Mengen sind, kann verwendet werden, um Freisetzungskinetiken pseudo-erster Ordnung in linearer Form zu definieren. Die Geschwindigkeitskonstante K2 für die Freisetzungskinetik pseudo-zweiter Ordnung wird durch Formel 5 in einer für Kinetikmodelle zweiter Ordnung typischen linearen Form beschrieben. Nach dem Higuchi-Modell (Formel 6), bei dem KH die Higuchi-Geschwindigkeitskonstante ist, steigt die Sorafenib-Freisetzung aus den Nanopartikeln mit der Quadratwurzel der Zeit. Formel 7 des Hixson-Crowell-Modells veranschaulicht die Zeitabhängigkeit der restlichen SF-Wurzel, wobei Mo die Anfangskonzentration von SF in den Nanopartikeln, qt die zum Zeitpunkt t freigesetzte Menge und KHC die Hixson-Crowell-Geschwindigkeitskonstante ist. Der Freisetzungsexponent n und der Logarithmus der Zeit hängen im Korsmeyer-Peppas-Modell (Formel 8) zusammen, wobei q die Freisetzung bei unendlicher Zeit darstellt.

Der berechnete Korrelationskoeffizient (R2), die Geschwindigkeitskonstante (K) und die t1/2-Werte des Freisetzungsprofils sind in Tabelle 2 aufgeführt. Dies zeigt, dass die Freisetzungskinetik von SF-CS-NPs dem Kinetikmodell pseudo-zweiter Ordnung folgte 20. Durch die Entwicklung konkurrierender Austauschkinetiken wurde entdeckt, dass die ionische Reaktion der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Freisetzungsprozess ist.

Die kleinsten Nanopartikel hatten die beste antiproliferative Aktivität und Selektivität für HepG2-Zellen. Die einzige Zytotoxizität und antiproliferativen Aktivitäten von SF-CS-NPs 20 wurden daher in diesen Abschnitt einbezogen. Der MTT-Test wurde verwendet, um die Zytotoxizität und das Zellüberleben der SF-CS-NPs 20 zu bewerten. Zur Durchführung dieses Tests wurden HDFa- ​​und HepG2-Zellen verwendet. Zur Bestimmung der Tumorselektivität wurden HDFa-Zellen als nicht krebsartige Zelllinie und Kontrolle verwendet.

Abb. 10 zeigt den Prozentsatz der noch lebenden HDFa- ​​und HepG2-Zellen, nachdem sie über einen längeren Zeitraum reinen SF- und SF-CS-NPs 20 ausgesetzt waren. Nach der Inkubation erwiesen sich alle modifizierten Nanopartikel als biokompatibel und ungiftig für HDFa- ​​und HepG2-Zellen, mit einer Zelllebensfähigkeit von 85 % bzw. 50 % in einem Konzentrationsbereich von 1 g bis 125 g. Da davon ausgegangen wird, dass gesunde Zellen von der synthetischen Antikrebs-Nanopartikelzusammensetzung nicht beeinträchtigt werden, wird davon ausgegangen, dass sie bösartige Zellen effektiv zerstört und gleichzeitig für gesunde Zellen sicher ist.

Dosis-Wirkungs-Kurve der (A) reinen SF- und (B) SF-CS-NPs 20, wobei (a) die Lebensfähigkeit von HDFa und (b) die Hep-G2-Hemmung darstellt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD aus drei separaten Studien dargestellt, die jeweils dreifach durchgeführt wurden.

Der CC50 wurde anhand sigmoidaler Dosis-Wirkungs-Kurven berechnet und die Ergebnisse in dieser Arbeit in Tabelle 3 beschrieben. Zytotoxizitätsstudien an reinen SF- und SF-CS-NPs 20 wurden ausführlich in vitro durchgeführt. Für HDFa- ​​und HepG2-Zellen waren 154,88 x 1,8 bzw. 13,60 x 1,6 g/ml SF-CS-NPs 20 erforderlich, um den CC50 nachzuweisen. Während reines SF eine höhere Dosis erforderte, um eine zytotoxische Wirkung von 50 % zu erzielen, benötigten SF-CS-NPs 20 nur eine niedrigere Dosis, um den gleichen Effekt zu erzielen. Darüber hinaus zeigte diese Untersuchung, dass freie NPs weniger gefährlich sind als SF-CS-NPs 20.

In dieser Studie wurden verschiedene Charakterisierungsmethoden sowie In-vitro-Freisetzungs- und Zelllebensfähigkeitsforschung eingesetzt, um eine umfassende Untersuchung der Eigenschaften von SF-CS-NPs durchzuführen 20. Forschung mit FTIR und XRD verleiht dieser Vorstellung Glaubwürdigkeit dass Nanopartikel entstehen können. Die Größe der verstreuten Partikel wurde anhand von Bildern von HRTEM und FESEM demonstriert. Es gab keine Hinweise auf eine Agglomeration. Es zeigte sich, dass das Medikamentenfreisetzungsprofil für die Behandlung von Nanopartikeln von Vorteil war. Gleichzeitig war die krebshemmende Wirkung der hergestellten Nanopartikel stärker als die des freien Arzneimittels, was mit den Ergebnissen der Zytotoxizitätstests übereinstimmte.

Zukünftig ist es zwingend erforderlich, eine gründliche Untersuchung der biologischen Aktivitäten durch quantitative Aufnahmevalidierungen durchzuführen. Darüber hinaus wird die Verwendung von In-vivo-Tiermodellen als notwendig erachtet und wird einen wesentlichen Aspekt unserer bevorstehenden Forschung darstellen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

Choi, SI et al. Besseres Überleben von Patienten mit Hepatitis-B-Virus-bedingtem hepatozellulärem Karzinom in Südkorea: Veränderungen in 16-jährigen Kohorten. PLoS ONE 17(3), e0265668. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0265668 (2022).

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Ein besonderer Dank geht an Isshadiba Faikah Mustafa für ihre technische Unterstützung während der Experimente.

Diese Arbeit wurde von Grant Putra Berimpak, UPM/8003/3/1/GPB/2019/9678800, Vot. unterstützt. NEIN. 9678800 Universität Putra Malaysia.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Fahad Albalawi und Mohd Zobir Hussein.

Abteilung für medizinisches Labor und Blutbank, King Fahad Specialist Hospital-Tabuk, Tabuk, Saudi-Arabien

Fahad Albalawi

Labor für Nanomaterialsynthese und -charakterisierung, Institut für Biowissenschaften (IBS), Universiti Putra Malaysia, Serdang, Selangor, Malaysia

Fahad Albalawi

Fakultät für Zahnmedizin, Brawijaya-Universität, Malang, Indonesien

Mohd Zobir Hussein

Abteilung für menschliche Anatomie, Fakultät für Medizin und Gesundheitswissenschaften, Universiti Putra Malaysia, Serdang, Selangor, Malaysia

Sharida Fakurazi

Labor für Naturmedizin und Produktforschung, Institut für Biowissenschaften, Serdang, Selangor, Malaysia

Sharida Fakurazi

Abteilung für Zell- und Molekularbiologie, Fakultät für Biotechnologie und Biomolekularwissenschaften, Universiti Putra Malaysia, Serdang, Selangor, Malaysia

Herr Jaffri Masarudin

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Die FMA führte das Experiment durch, charakterisierte die Nanopartikelsysteme und verfasste das Manuskript. Das MZH betreute das Projekt und redigierte und kommentierte das Manuskript. SF und JM haben die Idee für die Forschungsstudie beigesteuert. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Mohd Zobir Hussein.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Albalawi, F., Hussein, MZ, Fakurazi, S. et al. Herstellung und Charakterisierung einer auf Chitosan basierenden Nanoabgabeplattform zur Verbesserung der Krebsbekämpfungsergebnisse von Sorafenib bei hepatozellulärem Karzinom. Sci Rep 13, 12180 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38054-4

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Eingegangen: 21. März 2023

Angenommen: 02. Juli 2023

Veröffentlicht: 27. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38054-4

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