Visualisierung von Mikro

Jul 13, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13375 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Optische Mikroskopietechniken sind eine beliebte Wahl zur Visualisierung von Mikrowirkstoffen. Sie erzeugen Bilder mit relativ hoher räumlich-zeitlicher Auflösung, geben jedoch keine kodierten Informationen zur Unterscheidung von Mikroagenten und ihrer Umgebung preis. Diese Studie präsentiert mehrfarbige Fluoreszenzmikroskopie zur farbcodierten Identifizierung mobiler Mikroagenten und dynamischer Umgebungen durch spektrale Entmischung. Wir berichten über die Leistung der Mehrfarbenmikroskopie, indem wir die Bindung einzelner und Cluster-Mikrowirkstoffe an Krebssphäroide visualisieren, die mit HeLa-Zellen gebildet wurden, als Proof-of-Concept für die Demonstration der gezielten Arzneimittelabgabe. Ein mikrofluidischer Chip wird entwickelt, um ein einzelnes Sphäroid für die Befestigung zu immobilisieren, eine stabile Umgebung für die Mehrfarbenmikroskopie bereitzustellen und ein 3D-Tumormodell zu erstellen. Um zu bestätigen, dass die Mehrfarbenmikroskopie Mikrowirkstoffe in vaskularisierten Umgebungen sichtbar machen kann, werden als experimentelle Modelle In-vitro-Gefäßnetzwerke aus Endothelzellen und ex-ovo-Hühner-Chorioallantoismembranen eingesetzt. Die vollständige Visualisierung unserer Modelle wird durch sequentielle Anregung der Fluorophore im Round-Robin-Verfahren und synchrone Einzelbildaufnahme aus drei verschiedenen Spektralbändern erreicht. Wir zeigen experimentell, dass die Mehrfarbenmikroskopie Mikroerreger, organische Körper (Krebssphäroide und Gefäßsysteme) und umgebende Medien mithilfe von Fluorophoren mit gut getrennten Spektrumseigenschaften spektral zerlegt und eine Bildaufnahme mit 1280 \(\times\) 1024 Pixeln bis zu 15 Bildern ermöglicht pro Sekunde. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Echtzeit-Mehrfarbenmikroskopie durch farbcodierte Visualisierung ein besseres Verständnis hinsichtlich der Verfolgung von Mikroagenten, der Morphologie organischer Körper und der klaren Unterscheidung umgebender Medien ermöglicht.

Der Bereich der Mikrorobotik hat dank der Fortschritte in der Mikro-/Nanofertigungstechnologie neue Möglichkeiten für verschiedene Anwendungen in der Medizin eröffnet1,2,3. Eine der bekanntesten Anwendungen ist die gezielte Medikamentenabgabe, eine innovative Technik zur Erhöhung der Erfolgsquote der Behandlung, zur Abschwächung der Nebenwirkungen der Medikamente und zur Verkürzung der Genesungszeit des Patienten4,5. Mikroagenten, die Endeffektoren der Mikrorobotersysteme, werden als Träger für die Arzneimittelabgabe durch Nanopartikel verwendet und durch externe Reize (z. B. Magnetfelder und akustische Wellen) auf das interessierende Gewebe gelenkt6. Damit Mikrowirkstoffe das Zielgewebe erreichen, werden bildgebende Verfahren eingesetzt, da die Sensorintegration aufgrund von Größenbeschränkungen weiterhin eine Herausforderung darstellt7,8. Erfasste Bilder können als einzige Feedbackquelle für die Zielidentifizierung, die Manipulation der Mikrowirkstoffe und die Freisetzung der Medikamente an der gewünschten Stelle betrachtet werden. Daher spielt eine klare Visualisierung eine entscheidende Rolle im Lieferprozess.

Magnetresonanztomographie (MRT), Computertomographie (CT), Fluoroskopie, Ultraschall und photoakustische Bildgebung werden zur Visualisierung von Mikrowirkstoffen unter In-vitro- und In-vivo-Bedingungen eingesetzt. Die MRT wird zur gleichzeitigen Aktivierung und Visualisierung von Mikrowirkstoffen mit einem hohen Kontrast-Rausch-Verhältnis9,10,11 verwendet. Darüber hinaus enthalten MRT-Bilder anatomische Details mit einem hohen Kontrast-Rausch-Verhältnis für eine präzise Steuerung der Mikroagenten. Aufgrund der geringen Bildaufnahmerate der MRT eignet sie sich jedoch nicht für Mikroagentenanwendungen, die eine Echtzeitvisualisierung erfordern12. Ähnlich wie die MRT liefert die CT hochauflösende Bilder von Mikroagenten, verfügt jedoch nur über begrenzten Arbeitsraum für die Integration von Betätigungs- und Sensorsystemen13. Durchleuchtung ist eine alternative Bildgebungsmethode zur CT, um einen größeren Arbeitsbereich zu erhalten und eine höhere Bildaufnahmerate zu erreichen14,15. Sowohl CT als auch Durchleuchtung haben aufgrund der Belastung durch ionisierende Strahlung schädliche Auswirkungen auf Ärzte und Patienten16. Unter den Bildgebungsmodalitäten haben ultraschallbasierte Techniken keine bekannten Nebenwirkungen auf die Gesundheit und werden zur Echtzeitvisualisierung der Mikrowirkstoffe verwendet17,18,19,20,21. Die Ultraschallbildgebung bietet einen großen Arbeitsraum für die Platzierung der Betätigungssysteme, da die Bilder mit einer kleinen Handsonde erfasst werden22,23,24. Allerdings sind Ultraschallbilder von Natur aus verrauscht und enthalten Artefakte, die die Erkennung von Mikroagenten erschweren. Die photoakustische Bildgebung überwindet die Einschränkungen der Ultraschallbildgebung durch Kontrastverstärkung durch Mikrowirkstoffe. Die Lichtabsorption erhitzt Mikrowirkstoffe, die metallische Materialien enthalten, und nachfolgende akustische Wellen werden durch thermische Ausdehnung erzeugt25. Durch die erzeugten akustischen Wellen erreichen Mikroagenten ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis als Ultraschallbildgebung und werden von der Umgebung aufgelöst26,27,28.

Optische Mikroskopietechniken werden für Vorversuche und Mikrowirkstoffe in Lab-on-a-Chip-Anwendungen eingesetzt, da die Versuchsumgebungen aus transparenten Materialien hergestellt werden6,7. Hellfeld- und Einzelband-Fluoreszenzmikroskopietechniken werden häufig zur Visualisierung von Mikrowirkstoffen eingesetzt. Eine vollständige Visualisierung der Proben wird mit der Hellfeldmikroskopie erreicht, Höhenunterschiede zwischen den Mikroagenten und der physischen Umgebung führen jedoch zu einer Unschärfe der aufgenommenen Bilder29. Die Einzelband-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht nur die Visualisierung von Mikroagenten mit hoher Auflösung und liefert keine Informationen über die Umgebung30,31. In unserer vorherigen Studie wurde die Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie eingeführt, um die Einschränkungen optischer Mikroskopietechniken zur Visualisierung von Mikrowirkstoffen zu überwinden29. Ein Weitfeld-Mehrfarbenmikroskop wurde als Werkzeug entwickelt, um fokussierte Bilder aus verschiedenen Spektralbändern zu sammeln und Aberrationen zu korrigieren. Die vollständigen Proben wurden spektral aufgelöst und es wurde eine verdeckungsfreie Visualisierung von Mikroagenten und Umgebungen erhalten.

In dieser Studie befassen wir uns mit dem Mangel an mehrfarbiger Echtzeit-Bildgebung von Mikroagenten und ihrer Umgebung. Der Hauptunterschied zwischen den in früheren Studien verwendeten Bildgebungstechniken und unserem Ansatz besteht darin, dass durch die Farbcodierung der vollständigen Proben ein besseres Verständnis des Mechanismus der Funktionalität und Dynamik der Mikroagenten erzielt wird. Da Farbe ein wesentlicher Informationsträger für die menschliche Wahrnehmung und Kognitionsverstärkung ist, ermöglichen aufgenommene mehrfarbige Bilder eine klare Visualisierung von Mikroagenten und der Umgebung32. Das Potenzial der Mehrfarbenmikroskopie wird durch die Visualisierung mobiler Mikroagenten als Ersatz für Arzneimittelträger in 3D-Tumor- und vaskularisierten Umgebungen demonstriert. Die Hauptbeiträge dieser Studie (im Bereich der Mikrorobotik) sind (1) die Demonstration der Echtzeit-Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie durch spektrale Entmischung von Mikroagenten, organischen Körpern (Krebssphäroiden und Gefäßen) und mikrofluidischen Kanälen. (2) Entwicklung eines mikrofluidischen Chips, der ein einzelnes 3D-Krebssphäroid an einem festen Ort für Abgabeaufgaben mit Mikroagenten und der Erfassung mehrfarbiger Bilder aus einer begrenzten Umgebung immobilisiert. (3) Farbcodierte Echtzeitvisualisierung von Mikrowirkstoffen innerhalb eines in vitro perfundierbaren Gefäßnetzwerks, das auf einem Mikrofluidiksystem gebildet wird. Darüber hinaus werden mehrere Bildgebungsexperimente mit Mikroagenten unterschiedlicher Geometrie und Größe durchgeführt, um unsere Beiträge zu zeigen.

Für bildgebende Experimente wird ein Tumormodell erstellt, indem mithilfe von zervikalen HeLa-Zellen gebildete Krebssphäroide in den entwickelten, mit Kulturmedium gefüllten mikrofluidischen Chip platziert werden. In-vitro-basierte mikrofluidische Gefäßnetzwerke und ex-ovo-basierte Hühner-Chorioallantoismembranen werden als Modelle zur Visualisierung von Mikrowirkstoffen in vaskularisierten Umgebungen verwendet. Mehrfarbige Bilder werden durch Experimente aufgenommen, bei denen die Mikroagenten magnetisch in den Modellen bewegt werden. Die mehrfarbige Bildaufnahme in Echtzeit wird auf der Grundlage einer eindeutigen Farbkodierung sowie der Anregung der Fluorophore in minimalen Zeitintervallen konfiguriert. Erstens verhindert spektrales Übersprechen die Identifizierung von Mikroagenten und Umgebungen aus einem einzelnen Spektrumband und deren Visualisierung mit einer bestimmten Farbe. Um das Übersprechen zu überwinden, werden emittierte Fluoreszenzphotonen aus drei relativ gut getrennten Spektralbändern für die individuelle Bilderzeugung gesammelt. Zweitens haben Fluorophore eine begrenzte Lebensdauer und die Intensität der emittierten Fluoreszenzphotonen nimmt während der Bildgebung aufgrund von Photobleichung ab. Um die Lebensdauer der Mehrfarbenbildgebung durch Reduzierung der Lichtschäden an den Fluorophoren zu verlängern, wird eine sequentielle Anregungsstrategie verwendet.

Die Vorteile simultaner33,34 und sequenzieller35,36 Anregungsstrategien für die Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie werden ausführlich anhand zellulärer Strukturen untersucht. Die gleichzeitige Anregung der Fluorophore ermöglicht eine verzögerungsfreie Bilderfassung aus Spektralbändern. Die aufgenommenen Bilder enthalten jedoch erhebliches Übersprechen, das die eindeutige Erkennung spezifischer Mikrostrukturen oder Kompartimente unmöglich macht. Sequentielle Anregung der Fluorophore und synchrone Auslösung der Bildsensoren (dh spektrales Multiplexing) überwinden das Übersprechen37,38. Der Nachteil der sequentiellen Strategie besteht darin, dass spektral aufgelöste Bilder mit gleicher Verzögerung erfasst werden, was die Mehrfarbenbildungsrate begrenzt39. Die Modelle, die mobile und stationäre Mikroagenten enthalten, werden durch sequentielle Anregung der Fluorophore im Round-Robin-Verfahren und synchrone Bildaufnahme mit der Anregungssequenz vollständig ohne Übersprechen aufgelöst. Eine Echtzeitvisualisierung der Modelle wird durch relativ schnelles Spektralmultiplexen erreicht.

Allgemeiner Überblick über die Herstellung fluoreszierender und magnetischer Mikrowirkstoffe mittels Elektrospinnen. (a) Schematische Darstellung des Elektrospinning-Aufbaus und des Inhalts der Polymerlösung. (b1) und (b2) Rasterelektronenmikroskopbilder der mittels Elektrospinnen auf dem Kollektor abgelagerten geraden und perlenbesetzten Fasernetze. (c1) Polymermahlverfahren zur Gewinnung von Mikrowirkstoffen durch Schneiden der Endlosfasern mit einem Ultraschallgerät. (c2) Fluoreszenzbilder der hergestellten Mikroagenten. (c3) 3D-Oberflächenprofil des Mikroagenten, visualisiert mittels konfokaler Mikroskopie. (d1) Ultraviolett-sichtbare Spektralanalyse von Cumarin-6 in Dimethylformamid (DMF). (d2) und (d3) Spektralanalyse von Cumarin-6 in DMF bei verschiedenen Anregungs- und Emissionswellenlängen. (e1) Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung der Bewegung von Mikroagenten mit einem Magnetfeld von 21 mT. (e2) Die den Fluoreszenzbildern überlagerten Vektorfelder zeigen die Bewegung der Mikroagenten, die mithilfe des optischen Lucas-Kanade-Flusses analysiert wurden. Maßstabsbalken 100 \(\upmu\)m.

Unsere Mikrowirkstoffe werden durch Mahlen der durch Elektrospinnen synthetisierten Endlosperlen und geraden Fasern hergestellt (Abb. 1). Die synthetisierten Fasern bestehen aus Polystyrol als Trägerpolymer und Eisenoxid-Nanopartikeln (\(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\)) als magnetischem Material (Abb. 1b). Cumarin 6 wird zum Färben der Fasern ausgewählt, da es in einer Polystyrolmatrix immobilisiert und in Wasser unlöslich ist. Darüber hinaus weist Cumarin 6 eine relativ hohe Photobleichbeständigkeit auf. Beim Mahlvorgang werden die Fasern mithilfe von Ultraschallwellen in Fragmente zerkleinert. Dies ermöglicht die Gewinnung magnetischer und fluoreszierender Mikrowirkstoffe mit einer Größe von 4 bis 131 \(\upmu\)m (Abb. 1c1, c2). Zur Visualisierung der Bewegung und elektrostatischen Wechselwirkung der hergestellten Mikrowirkstoffe im Milli-Q-Wasser wird eine Einzelband-Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt. Abbildung 2a zeigt die Zugbewegung von zwei Mikroagenten, die aus geraden Fasern hergestellt wurden. Abbildung 2b zeigt die dynamische Bewegung eines aus Perlenfasern hergestellten Mikroagenten. Während der Bildgebungsexperimente beobachten wir, dass aus geraden Fasern hergestellte Mikroagenten vollständig mit \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\) beladen und starr sind. Andererseits ermöglicht die für die Perlenfasersynthese vorbereitete Polymerlösung die Herstellung flexibler Mikrowirkstoffe, da die Verteilung von \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\) zufällig ist. Die Abbildungen 2c1–c3,d1,d2 zeigen die diagonale und vertikale Bewegung eines flexiblen Mikroagenten unter Verwendung eines oszillierenden Magnetfelds. Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Mikroagenten werden anhand von drei Experimenten visualisiert. Das erste Experiment wird durchgeführt, um das Verhalten von Mikroagenten in einem rotierenden Feld zu visualisieren. Wir beobachten, dass Mikrowirkstoffe, die sowohl aus Perlen als auch aus geraden Fasern bestehen, aufgrund der Dipol-Dipol-Wechselwirkung aggregieren und im Laufe der Zeit einen Cluster bilden. Abbildung 2e zeigt einen repräsentativen Fall für die Bildung eines Mikrowirkstoffclusters mit einem 16 mT-Rotationsfeld bei 8 Hz. Das zweite Experiment dient dazu, die Anlagerung zweier Mikroagenten mithilfe elektrostatischer Kräfte zu visualisieren. Abbildung 2f1 zeigt aufgenommene Zeitrafferbilder durch Hervorhebung des Anhangs (Selbstmontage). Die Bewegung der angebrachten Mikroagenten wird mithilfe des optischen Lucas-Kanade-Flusses als Vektorfelder dargestellt und in Abb. 2f240 dargestellt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich die angelagerten Mikroagenten zusammen bewegen und elektrostatische Kräfte eine Desaggregation verhindern. Im dritten Experiment wird das Verhalten der Mikroagenten beobachtet, wenn kein Magnetfeld angelegt wird. Die aufgenommenen Bilder zeigen, dass aus geraden Fasern hergestellte Mikrowirkstoffe sinken und ein linienförmiges Selbstorganisationsmuster sowohl in einem offenen Reservoir als auch in einem Mikrofluidikkanal erzeugen (Abb. 2g1, g2). Das Selbstorganisationsmuster wird nicht beobachtet, wenn das Experiment mit den aus Perlenfasern hergestellten Mikroagenten wiederholt wird. Eine Verringerung der magnetischen Materialkonzentration in den Mikroagenten deaktiviert das Selbstorganisationsverhalten. Die hergestellten Mikrowirkstoffe werden als Ersatz für Arzneimittelträger verwendet und an HeLa-Zellsphäroide gebunden, die mit CellTracker Red CMTPX gefärbt sind.

Einzelband-Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung magnetischer Mikrowirkstoffe, die mit Cumarin 6 markiert sind. (a) Das Zeitrafferbild zeigt die Vorwärtsbewegung der Mikrowirkstoffe durch magnetische Anziehung. (b) Die Schnappschusssequenz zeigt die oszillierende Bewegung des Mikroagenten. (c1) und (d1) Überlagerte Fluoreszenzbilder zeigen die diagonale bzw. vertikale Bewegung der Mikrowirkstoffe. (c2), (c3) und (d2) Oszillierende Bewegungsmuster der Mikroagenten. (e) Aggregation der Mikrowirkstoffe durch ein rotierendes Magnetfeld. (f1) Anlagerung der Mikroagenten durch elektrostatische Wechselwirkung. (f2) Das Vektorfeld drückt die Bewegung der angehängten Mikroagenten aus, die mithilfe des optischen Lucas-Kanade-Flusses analysiert wurden. (g1) und (g2) Selbstorganisation der Mikroagenten in einem Reservoir bzw. einem Mikrofluidikkanal. Maßstabsbalken 100 \(\upmu\)m.

Wir visualisieren die Bindung einzelner und mehrerer Mikrowirkstoffe an HeLa-Zellsphäroide mit drei Experimenten in einem offenen Reservoir, das Indocyaningrün im Kulturmedium enthält. In allen Experimenten werden mehrfarbige Bilder mit 15 fps erzeugt und Mikroagenten mit einer Magnetfeldstärke von 36 mT auf die Sphäroide gelenkt. In den ersten beiden Experimenten werden Mikroagenten mit scharfen Spitzen durch Durchstechen der Sphäroide angebracht (Abb. 3a1,b1). Im dritten Experiment werden drei Mikroagenten nacheinander an das Sphäroid gebunden. Die ersten beiden Mikrowirkstoffe haften durch elektrostatische Wechselwirkung an der Sphäroidoberfläche, während der dritte Mikrowirkstoff durch Punktion befestigt wird (Abb. 3c1). Die Anhänge werden durch das Screening langfristiger Veränderungen mittels dynamischer Bildgebung verifiziert. Anregungslicht erzeugt einen Wärmegradienten zwischen den beleuchteten und nicht beleuchteten Bereichen, wodurch eine Strömung entsteht. Wir visualisieren die Mobilität der Mikroagenten im Fluss als passive Methode zur Anhangsüberprüfung. Die Auswirkung des Flusses auf gebundene und nicht gebundene Mikroagenten für 92 Minuten ist in Abb. 3a2 dargestellt. Obwohl die Geschwindigkeit des anhaftenden Mikroagenten ungefähr 0 \(\upmu\)m/s beträgt, werden nicht anhaftende Mikroagenten durch die Strömung mobilisiert. Wir beobachten auch, dass ein nicht gebundener Mikroagent, der durch die Strömung bewegt wird, mit dem anhaftenden Mikroagenten unter Ausnutzung elektrostatischer Kräfte aggregiert (Abb. 3a3). Die Verdrängung der aggregierten Mikrowirkstoffe wird 92 Minuten lang bei 0 \(\upmu\)m gemessen. Unser Experiment bestätigt, dass die Bindung an das Sphäroid die Trägheit der Mikroagenten erhöht und sie im Fluss immobilisiert. In allen Experimenten werden die Anhaftungen überprüft, indem die Immobilität der Mikroagenten im Fluss für mehr als 90 Minuten sichtbar gemacht wird (Abb. 3a2 – c2). Die zur Verifizierung aufgenommenen dynamischen Bilder zeigen auch, dass sich die anhaftenden Mikroagenten zusammen mit den Sphäroiden verschieben, da das Medium im Reservoir durch die erzeugte Wärme verdampft (Abb. 3a3, b2, c2). Nach der vollständigen Verdunstung des Mediums werden die Verschiebungen 20 \(\upmu\)m und 68 \(\upmu\)m für die Sphäroide gemessen, an denen einzelne bzw. mehrere Mikroagenten befestigt sind. Um zu bestätigen, dass die Verdunstung die Anhaftung nicht beeinträchtigt, wird ein Mikroagent zwei Minuten lang mit einem Magnetfeld von 14 mT rotierend um seinen eingeführten Teil in das Sphäroid bewegt (Abb. 3b3). Die maximale Geschwindigkeit für das distale Ende des Mikroagenten wird mit 1,4 Körperlänge/s (180 \(\upmu\)m/s) gemessen. Es wird keine Ablösung des Mikroagenten vom Sphäroid beobachtet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Mehrfarbenmikroskopie in Echtzeit farbcodierte Bilder erzeugt, um die Anlagerung von Mikroagenten an die Sphäroide zu visualisieren und zu überprüfen.

Zeitraffer-Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie für die Anlagerung einzelner und mehrerer magnetischer Mikrowirkstoffe an HeLa-Zellsphäroide. (a1–c1) Anheftung von Mikroagenten an HeLa-Zellsphäroide mit einem Magnetfeld von 36 mT. (a2,a3) Auswirkung des passiven Flusses auf die angehängten und nicht angebundenen Mikroagenten. (b2,c2) Visualisierung der Veränderungen der an den Sphäroiden befestigten Mikroagenten. (b3) Überprüfung der Anhaftung durch Rotationsbewegung des Mikroagenten um seinen eingeführten Teil im Sphäroid nach Ablauf von zwei Stunden. Maßstabsbalken 100 \(\upmu\)m. Bitte beachten Sie das dazugehörige Video (Teil 1).

Echtzeit-Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie wird durch sequentielle Anregung der Fluorophore im Round-Robin-Verfahren und synchrone Einzelbildaufnahme von Spektralbändern von 500 bis 540 nm, 592,5 bis 667,5 nm und 817,5 bis 875,5 nm durchgeführt. Einzelne Bilder der mit Cumarin 6 markierten Mikrowirkstoffe werden aus dem Spektralband von 500 bis 540 nm aufgenommen. Die Sphäroide werden mit CMTPX und Indocyaningrün gefärbt, um ihre Visualisierung in den Spektralbändern 592,5–667,5 nm bzw. 817,5–875,5 nm darzustellen (Abb. 5a4). Somit kann die gleichzeitige Bewegung der Sphäroide und Mikroagenten aus allen in der Mehrfarbenmikroskopie verwendeten Spektralbändern visualisiert werden. Unsere Mikroagenten sind in der Lage, HeLa-Zellsphäroide durch ein externes Magnetfeld zu mobilisieren. Abbildung 4a zeigt ein Sphäroid, das durch mehrere Mikroagenten im Reservoir angetrieben wird, das Indocyaningrün im Kultivierungsmedium mit einem Magnetfeld von 60 mT enthält. Abbildung 4b zeigt die Drehung eines Sphäroids im Uhrzeigersinn aufgrund von Ungleichgewichten in der Mikroagentenbefestigung während des Vortriebs. Wir mobilisieren die Sphäroide mit Mikroagenten, um die Leistung der Echtzeit-Mehrfarbenmikroskopie zu ermitteln. Das offene Reservoir wird als experimenteller Prüfstand verwendet, da es die translatorische und rotatorische Beweglichkeit der Sphäroide durch die Anlagerung von Mikroagenten ermöglicht. Mehrfarbige Bilder werden mit 15 fps erstellt, wobei die Einzelbildaufnahmerate 45 fps beträgt. Abbildung 4c1, d1 zeigt die Vorwärtsbewegung von zwei und mehreren Sphäroiden, die von Mikroagenten mit einem Magnetfeld von jeweils 120 mT angetrieben werden. Abbildung 4e1 zeigt einen repräsentativen Fall für die Steuerung eines Sphäroids mit Antrieb der Mikroagenten durch Änderung der Magnetfeldrichtung. Durch visuelle Verfolgung erhaltene Pfadinformationen zeigen die Translationsbewegungen der Sphäroide bis zu 218 \(\upmu\)m/s (\(\ungefähr) 1,3 Körperlänge/Sek.) in Abb. 4c2,d2,e241. Um die Rotationsmobilität zu visualisieren, wird ein Sphäroid durch einen einzelnen Mikroagentenaufsatz mit einem maximalen Magnetfeld von 36 mT im Uhrzeigersinn bewegt (Abb. 5a1, a4). Die Bewegungsinformationen des Sphäroids mit Mikroagent werden mithilfe des optischen Lucas-Kanade-Flusses als Vektorfelder dargestellt und in Abb. 5a2 dargestellt. Die Vektorfelder und der Weg des angebrachten Mikroagenten zeigen, dass das Sphäroid mit einer maximalen Winkelgeschwindigkeit von 1,2 rad/s um seine Achse gedreht wird (Abb. 5a3). Rotations- und Translationsmobilität werden gemeinsam visualisiert, indem zwei mit einem Mikrowirkstoffcluster verklebte Sphäroide in einem rotierenden 16-mT-Magnetfeld bei 1 Hz betätigt werden (Abb. 5b1). Abbildung 5b2 zeigt das Bewegungsfeld für die Rotation der beiden Sphäroide mit dem Mikroagentencluster. Die Translationsbewegung der Sphäroide ist in Abb. 5b3 dargestellt. Unsere Experimente zeigen, dass die Mehrfarbenmikroskopie die gleichzeitige Bewegung mehrerer Sphäroide und Mikroagenten in zeitlich variierenden Magnetfeldern bis zu einer Translationsgeschwindigkeit von 504 \(\upmu\)m/s (\(\ca.) 3,4 Körper- Länge/s für ein Sphäroid) bei 15 fps. Wir bestätigen auch, dass Sphäroide als organische Körper durch einzelne, mehrere und eine Gruppe von Mikroagenten in einer Reservoirumgebung aktiviert werden können. Um ein einzelnes Sphäroid für die Anlagerung von Mikroagenten zu immobilisieren und eine begrenzte Umgebung für die Mehrfarbenmikroskopie bereitzustellen, wird ein mikrofluidischer Chip entwickelt.

Translation von HeLa-Zellsphäroiden durch magnetische Mikroagenten in einem mit Kulturmedium und Indocyaningrün gefüllten Reservoir. (a1) Antreiben eines einzelnen Sphäroids durch Mikroagentenverbindung. (a2) Zeitraffer-Zweifarbenmikroskopie zur Verbindung von Mikrowirkstoffen mit dem Sphäroid. (b1) Rotation eines Sphäroids, verursacht durch den Antrieb von Mikroagenten. (b2) Demonstration der Sphäroidrotation durch Gradientenbilder. (c1,d1) Gleichzeitige Übersetzung von zwei bzw. mehreren Sphäroiden durch Mikroagenten. (e1) Lenken eines mit Mikroagenten angetriebenen Sphäroids durch Änderung der Magnetfeldrichtung. (c2–e2) Weg- und Geschwindigkeitsinformationen der Sphäroide in (c1–e1). Maßstabsbalken 100 \(\upmu\)m. Bitte beachten Sie das dazugehörige Video (Teil 1).

Rotation und Translation von HeLa-Zellsphäroiden mit Anlagerung von Mikroagenten in einem mit Kulturmedium und Indocyaningrün gefüllten Reservoir. (a1,b1) Aktivierung der Sphäroide mit einem einzelnen bzw. einem Cluster von Mikroagenten. (a2,b2) Vektorfelder, die den mehrfarbigen Zeitrafferbildern überlagert sind, zeigen die Rotationsbewegung der Sphäroide, die mit dem optischen Fluss von Lucas-Kanade analysiert wurden. (a3,b3) Bewegungsprofil und Geschwindigkeitsinformationen der Sphäroide. (a4) Spektrale Bildzerlegung des mehrfarbigen Bildes zum Zeitpunkt Null. Maßstabsbalken 100 \(\upmu\)m. Bitte beachten Sie das dazugehörige Video (Teil 1).

Zur Erstellung eines vereinfachten 3D-Tumormodells wird ein mikrofluidischer Chip entwickelt, der in der Lage ist, ein einzelnes HeLa-Zellsphäroid mit einem Durchmesser zwischen 100 und 250 \(\upmu\)m zu immobilisieren42. Der Chip enthält eine Kammer, die aus einer U-förmigen Säulenanordnung mit einem Abstand von 80 \(\upmu\)m besteht, die das Entweichen des Sphäroids blockiert und den Eintritt von Mikroagenten ermöglicht (Abb. 6a1). Während der Injektion fangen die Säulen das Sphäroid ein (Abb. 6a2). Anschließend wird eine Luftblase in den Chip übertragen, um das Sphäroid zu immobilisieren, indem ein Druckunterschied zwischen der Innenseite und der Außenseite des Säulenarrays erzeugt wird (Abb. 6a3). Somit ist das Sphäroid für Mehrfarbenexperimente an einem bestimmten Ort fixiert, anders als bei der zufälligen Positionierung im offenen Reservoir. Der Chip wird mit 250 \(\upmu\)g/ml Indocyaningrün im Zellkulturmedium gefüllt, um ihn in der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Das Medium und die Mikrowirkstoffe werden injiziert, ohne dass sich der Sphäroid aufgrund der Druckdifferenz bewegt. Abbildung 6b zeigt ein mehrfarbiges Zeitrafferbild für einen Mikroagenten, der zwischen zwei Säulen und unter einem immobilisierten Sphäroid hindurchgeht. Abbildung 6c1 zeigt eine einzelne Mikroagentenbefestigung durch Durchstechen eines immobilisierten Sphäroids mit einem Magnetfeld von 36 mT. Die dynamische Bildgebung wird 395 Minuten lang mit 15 fps durchgeführt, um zu bestätigen, dass der Chip Sphäroide beibehält, an denen Mikroagenten für die langfristige Mehrfarbenmikroskopie angebracht sind. Die aufgenommenen dynamischen Bilder zeigen, dass die Photobleichbeständigkeit von Indocyaningrün geringer ist als die von Cumarin 6 und CMTPX. Eine Fluoreszenzbildgebung des Chips ist aufgrund der Photobleichung von Indocyaningrün in Minute 170 nicht möglich, wo die Pixelintensitätsabfälle des Sphäroids und des Mikroagenten 21,2 % bzw. 1,6 % betragen (Abb. 6c2, c3). Um die Fluoreszenzbildgebung des Chips wiederherzustellen, wird das Anregungslicht für eine Stunde ausgeschaltet. Die Diffusion ungebleichter Indocyaningrünmoleküle von außerhalb des Bildgebungsbereichs nach innen während der Ausschaltzeit ermöglicht wieder die Mehrfarbenmikroskopie (Abb. 6c4)43. Im Reservoir kann keine Fluoreszenzwiederherstellung durchgeführt werden, da das Medium aufgrund der durch das Anregungslicht erzeugten Wärme vollständig verdampft (Abb. 3a3, b2, c2). Das Reservoir ist nicht versiegelt, um den Unterschied zwischen offenen und geschlossenen mikrofluidischen Plattformen im Hinblick auf die mehrfarbige Bildaufnahme zu zeigen. Die in unserer Studie durchgeführten Experimente zeigen, dass das Reservoir (als offene Plattform) und der Mikrofluidikchip (als geschlossene Plattform) für die Echtzeit-Mehrfarbenmikroskopie eingesetzt werden können. Durch die Verdunstung des Mediums im Reservoir wird jedoch nach einer gewissen Zeit die Aufnahme mehrfarbiger Bilder unmöglich. Ein offenes Reservoir ist keine stabile Umgebung für die Visualisierung langfristiger Veränderungen mittels dynamischer Mehrfarbenbildgebung, solange es nicht mit einer luftdichten, transparenten Kammer verschlossen ist, um Verdunstung zu verhindern. Andererseits hält der Chip das erhitzte Medium in sich, um (1) eine Langzeitmikroskopie zu ermöglichen und (2) die Mehrfarbenbildgebungszeit durch Fluoreszenzwiederherstellung zu verlängern. Um zu überprüfen, dass die Fluoreszenzwiederherstellung die Anhaftung nicht beeinträchtigt, wird der Mikroagent zwischen den Minuten 264 und 267 zufällig mit einem Magnetfeld von 14 mT bewegt (Abb. 6c5). Die maximale Geschwindigkeit für das distale Ende des Mikroagenten beträgt 67 \(\upmu\)m/s (1,3 Körperlänge/s), und es wird keine Ablösung beobachtet. Abbildung 6c6 verifiziert die Anhaftung, indem sie den Teil des Mikroagenten innerhalb des Sphäroids in Minute 395 zeigt. Mehrere Mikroagenten werden an einem immobilisierten Sphäroid mit einem 16 mT-Rotationsfeld bei 5 Hz befestigt (Abb. 6d). Wir beobachten, dass die angelagerten Mikroagenten im Laufe der Zeit aufgrund der Dipol-Dipol-Wechselwirkung einen Cluster bilden (Abb. 6e). Obwohl ein Mikroagentencluster in der Lage ist, Sphäroide zu betätigen, wie in Abb. 4b1 gezeigt, wird die Verschiebung des Sphäroids 137 Minuten lang bei 0 \(\upmu\)m gemessen. Unser Experiment zeigt, dass der Chip eine statische Umgebung für die Mehrfarbenmikroskopie schafft, indem er die Anbringung mehrerer Mikroagenten ermöglicht, ohne das Sphäroid zu bewegen. Wir validieren experimentell, dass unser Tumormodell einen kontrollierbaren und stabilen Prüfstand für die mehrfarbige Bildaufnahme einzelner und mehrerer Mikrowirkstoffe an einem Sphäroid bietet. Um zu verifizieren, dass die Mehrfarbenmikroskopie Mikrowirkstoffe in vaskularisierten Umgebungen sichtbar machen kann, wird ein Gefäßnetzwerk auf einem Mikrofluidiksystem als experimenteller Prüfstand verwendet.

Mehrfarbige Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung der magnetischen Mikrowirkstoffe in einer mikrofluidischen Umgebung. (a1) Layout des Chips zur Immobilisierung eines einzelnen HeLa-Zellsphäroids. (a2) Mikroagent, der an einem gefangenen Sphäroid befestigt ist. (a3) Immobilisieren eines Sphäroids mithilfe einer Luftblase. (b) Das überlagerte Bild zeigt einen Mikroagenten, der sich unter einem immobilisierten Sphäroid bewegt. (c1) Anbringung eines Mikroagenten an einem immobilisierten Sphäroid. (c2–c4) Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung von Indocyaningrün. (c5) Bindungsprüfung durch magnetisches Bewegen des Mikroagenten. (c6) Pfeile zeigen den Teil des Mikroagenten im Inneren des Sphäroids an. (d) Arbeitsbereich des für Mikroskopie und magnetische Betätigung verwendeten Aufbaus. (e) Bildung eines Mikrowirkstoffclusters, der am Sphäroid befestigt ist. Maßstabsbalken 100 \(\upmu\)m. Bitte beachten Sie das dazugehörige Video (Teil 2).

Das in vitro perfundierbare Gefäßnetzwerk wird durch Co-Kultur von RFP-HUVECs und aus dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen in einem Mikrofluidiksystem entwickelt. Für die Mehrfarbenmikroskopie werden 250 \(\upmu\)g/ml Indocyaningrün im Zellkulturmedium und Mikrowirkstoffe in das System injiziert. Abbildung 7a1 zeigt ein statisches mehrfarbiges Bild des Mikrofluidiksystems mit dem konstruierten Gefäßnetzwerk und den Mikroagenten. Abbildung 7a2 zeigt die vergrößerte Ansicht des auf dem mehrfarbigen Bild definierten ROI und verdeutlicht die Bewegung von Mikroagenten im Gefäßnetzwerk durch passiven Fluss und magnetisches Ziehen mit einem Feld von 70 mT. Micro-Agent (1) bewegt sich frei entlang des Magnetfelds, während Micro-Agents (2) und (3) nach 33 s auf die Lumenwände treffen. Unser Experiment zeigt, dass Mikrowirkstoffe über Lumenöffnungen in das Gefäßnetzwerk eindringen und gleichzeitig verfolgt werden können (Abb. 7a3). Abbildung 7b zeigt eine repräsentative mehrfarbige Bilderzeugung und bestätigt, dass Mikrowirkstoffe, Gefäßnetzwerk und Mikrofluidiksystem spektral in drei unterschiedlichen Spektralbändern aufgelöst sind. Die strukturelle Morphologie des Gefäßnetzwerks wird aufgrund der Diffusion von Indocyaningrün im Kulturmedium anhand zweier Spektrumsbänder (592,5–667,5 nm und 817,5–875,5 nm) sichtbar gemacht (Abb. 7b2, b3). Dies ermöglicht eine vollständige Visualisierung der Gefäßstruktur und grenzt den Hydrogelraum klar ab (Abb. 7b4, b5). Die Mobilität der Mikrowirkstoffe innerhalb des Gefäßnetzwerks wird in drei Reihen mehrfarbiger Experimente unter Nicht-Zellkulturbedingungen visualisiert. In allen Experimenten werden mehrfarbige Bilder mit 3 Bildern pro Sekunde aufgenommen, um den Fotoschaden beim RFP zu minimieren. Die höhere Bildaufnahmerate ist mit Inkubationsbedingungen erreichbar, da RFP-HUVECs über einen aktiven, gut funktionierenden Stoffwechsel verfügen, um die Fluoreszenzsignale wiederherzustellen. Das erste Experiment wird durchgeführt, um einen Mikroagenten zu visualisieren, der durch den passiven Fluss bewegt wird (Abb. 7c). Die durchschnittliche Geschwindigkeit des Mikroagenten wird mit 3,3 Körperlänge/Sekunde (25 \(\upmu\)m/s) berechnet. Das zweite Experiment dient der Visualisierung von Mikroagenten, die mit einem Feld von 42 mT magnetisch gegen den passiven Fluss gezogen werden. Abbildung 7d,e zeigt die überlagerten Zeitrafferbilder der Bewegung der Mikroagenten mit der durchschnittlichen Geschwindigkeit von 1,4 Körperlänge/s (17 \(\upmu\)m/s) und 2,5 Körperlänge/s (12 \ (\upmu\)m/s). Im dritten Experiment wird die Aggregation von drei Mikroagenten unter Nutzung elektrostatischer Kräfte visualisiert (Abb. 7f1). Die aggregierten Mikroagenten werden durch den passiven Fluss mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 0,04 Körperlänge/s (4 \(\upmu\)m/s) bewegt (Abb. 7f2, f3). Aufgenommene mehrfarbige Bilder zeigen, dass 186 s lang keine Disaggregation erfolgt (Abb. 7f1, f2). Unsere bildgebenden Experimente zeigen, dass die Mehrfarbenmikroskopie: (1) eine räumlich-zeitliche Auflösung für die quantitative Analyse der Mikrowirkstoffe im Gefäßsystem bietet, (2) eine Bildaufnahme der Mikrowirkstoffe mit einer Mindestlänge von 5 \(\upmu\)m ermöglicht , (3) ermöglicht eine eindeutige Farbkodierung sowohl von Mikrowirkstoffen als auch der manipulierten Gefäßmorphologie in Echtzeit. Als nächstes berichten wir über die Leistung der Mehrfarbenmikroskopie durch Visualisierung von Mikroagenten innerhalb und außerhalb der natürlichen Blutgefäße.

Mehrfarbige Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung der magnetischen Mikrowirkstoffe in einem perfundierbaren Gefäßnetzwerk. (a1) Mehrfarbiges Bild der mit Cumarin 6 markierten Mikrowirkstoffe in einem mit RFP-HUVECs gebildeten Gefäßsystem auf einem mit Kulturmedium und Indocyaningrün gefüllten Mikrofluidiksystem. (a2) Bewegung der Mikroagenten durch passiven Fluss und magnetisches Ziehen mit einem Feld von 70 mT. (a3) Weg und Geschwindigkeit der Mikroagenten. (b) Mehrfarbige Bilderzeugung durch Überlappung der erfassten spektral unterschiedlichen Bilder. (c1,d1–e1) Bewegung der Mikrowirkstoffe in einem Lumen durch passiven Fluss bzw. magnetisches Ziehen mit einem Feld von 42 mT. (c2–e2) Zusammengeführte Fluoreszenzbilder der Mikrowirkstoffe und Lumen. (f1,f2) Die Aggregation und Bewegung der Mikrowirkstoffe in einem Gefäßsystem durch passiven Fluss. (f3) Geschwindigkeit und Weg der aggregierten Mikroagenten. Maßstabsbalken 100 \(\upmu\)m. Bitte beachten Sie das dazugehörige Video (Teil 3).

Das Ex-ovo-Chorioallantoismembran-Gefäßsystem (CAM), das die hierarchischen Blutgefäße mit mehreren Skalen enthält, wird verwendet, um die Mikrowirkstoffe in einer natürlichen Umgebung sichtbar zu machen (Abb. 8a1). Abbildung 8a2, a3 zeigt die strukturelle Morphologie des Gefäßsystems, visualisiert mit Hellfeld als Referenz bzw. Mehrfarbenmikroskopie mit Autofluoreszenz von Erythrozyten. Das mehrfarbige Bild entsteht durch spektrale Entmischung von drei Hauptzellmerkmalen: Gefäßsystem, Erythrozyten und CAM (Abb. 8a4). Wir perfundieren das CAM mit DPBS, um die frei schwebenden Erythrozyten innerhalb der Gefäßstrukturen vollständig zu entfernen. Diese dezellularisierte Gefäßstruktur ermöglicht die freie Bewegung von Mikrowirkstoffen sowie mehreren Fluorophorlösungen. Zur Färbung wird das Gefäßsystem über Nacht in eine Petrischale mit 250 μg/ml Indocyaningrün in Kulturmedium, 100 μg/ml Rhodamin B in Wasser und den Mikroagenzien gegeben Zeitraum. Vor den bildgebenden Experimenten wird die Schale mit der gefärbten Probe durch manuelles Schütteln 15 Minuten lang mit DPBS gewaschen, um die Aggregation der Mikroagenzien auf dem CAM zu verhindern. Aus der Probe wird ein kreisförmiger Teil mit einem Durchmesser von 15 mm herausgeschnitten und zur Mehrfarbenmikroskopie auf ein PDMS-Reservoir übertragen. Das repräsentative statische Mehrfarbenbild eines dezellularisierten, gegabelten Blutgefäßes und der Mikrowirkstoffe nach dem Waschen mit DPBS ist in Abb. 8b1 dargestellt. Die auf der mehrfarbigen Bildebene definierten ROI (1)–(3) heben Mikrowirkstoffe auf der Chorioallantoismembran, an der Gefäßwand bzw. im Gefäßinneren hervor. Um Details zu Mikroagenten und Gefäßen aufzuzeigen, ist die vergrößerte Ansicht der ROI (1)–(3) in Abb. 8b1–b3 dargestellt. Die spektrale Bildzerlegung der ROI (2) und (3) bestätigt, dass die Mikrowirkstoffe und das Gefäß aus unterschiedlichen Spektralbändern abgebildet werden und dass ein Kontrastunterschied zwischen CAM und Gefäßwand besteht (Abb. 8b2, b3). Der Kontrastunterschied nimmt um 90 % ab, da heterogene Poren in der Gefäßwand die Diffusion von Rhodamin B und Indocyaningrün ermöglichen (Abb. 8c,d). Mehrfarbige Echtzeitbilder werden mit 5 Bildern pro Sekunde und einer Belichtungszeit von 66 ms aufgenommen, wobei die Mikroagenten von einem Magnetfeld von 42 mT angezogen werden. Die durchschnittliche Geschwindigkeit der Mikroagenten, die sich außerhalb und innerhalb des Gefäßes bewegen, wird als 1 Körperlänge/s Länge/s (8 \(\upmu\)m/s) und 0,5 Körperlänge/s Länge/s (2) berechnet \(\upmu\)m/s) bzw. (Abb. 8c,d). Der Mikrowirkstoff im Inneren des Gefäßes wird gezogen, bis er die Wand erreicht. Die Verschiebung des Mikroagenten, nachdem er die Gefäßwand erreicht hat, wird für 5 Minuten mit 0 \(\upmu\)m gemessen, während sich die Mikroagenten außerhalb entlang des Magnetfelds bewegen (Abb. 8d). Unser Experiment zeigt, dass die Mehrfarbenmikroskopie eine Echtzeitvisualisierung der Mikrowirkstoffe in den natürlichen Blutgefäßen ermöglicht.

Mehrfarbige Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung der magnetischen Mikrowirkstoffe in der Chorioallantoismembran ex ovo von Hühnern. (a1) Vorbereitete Probe zur Visualisierung des Gefäßnetzwerks unter Nutzung der Autofluoreszenzeigenschaft von Erythrozyten. (a2,a3) Hellfeld- bzw. Mehrfarbenbilder des Netzwerks. (a4) Spektrale Zerlegung des ROI auf (a3). (b1) Mehrfarbiges Bild der mit Cumarin 6 markierten Mikrowirkstoffe und eines Gefäßes mit Rhodamin B und Indocyaningrün. ROI (1)–(3) auf (b1) zeigt die Mikrowirkstoffe auf der Membran, auf der Gefäßoberfläche bzw. im Gefäßinneren. (b2,b3) Vergrößerte Ansicht und spektrale Zerlegung der ROI (2) bzw. (3). (c,d) Magnetische Bewegung der Mikroagenten außerhalb bzw. innerhalb der Gefäße. Maßstabsbalken 100 \(\upmu\)m. Bitte beachten Sie das dazugehörige Video (Teil 4).

In dieser Arbeit demonstrieren wir die Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung polymerer Mikrowirkstoffe in 3D-Tumor-on-a-Chip- und Gefäßmodellen für die geplante Anwendung der gezielten Arzneimittelabgabe. Im Vergleich zu den in der Literatur verwendeten Bildgebungstechniken werden Mikroagenten und Umgebungen spektral in drei verschiedene Spektralbänder aufgelöst und es wird eine farbcodierte Visualisierung der Modelle erfasst. Wir validieren experimentell, dass die Mehrfarbenmikroskopie eine spektral unterschiedliche Bildaufnahme von Mikroagenten mit unterschiedlichen Seitenverhältnissen, organischen Körpern, umgebenden Medien mit bis zu 15 fps und eine sequentielle Bewegungserkennung mit bis zu 504 \(\upmu\)m/s aus jedem Spektrum ermöglicht Band. Durch die Farbcodierung wird ein besseres Verständnis für die Identifizierung und Unterscheidung jeder Mikrokomponente erreicht. Unsere Messungen zeigen, dass die Mehrfarbenmikroskopie die räumlichen Kompartimente in Echtzeit abgrenzt, um die Funktionalität der Mikroagenten zu analysieren und zu überprüfen. Wir gehen davon aus, dass die Echtzeit-Mehrfarbenmikroskopie die Umsetzung von Mikrowirkstoffen in die Praxis beschleunigen wird, indem sie die erforderliche klare Visualisierung ermöglicht.

Der Elektrospinning-Aufbau zur Herstellung von Mikrowirkstoffen wird unter Verwendung eines Hochspannungsnetzteils (60C24-P250-I5, Advanced Energy, USA) und einer Spritzenpumpe (NE-4000, New Era Pump Systems, USA) aufgebaut (Abb. 1a). . Eine Datenerfassungseinheit (34972A, 34901A, 34907A, Keysight, USA) wird sowohl zur Übertragung von Steuersignalen an die Hochspannungsstromversorgung als auch zur Erfassung von Rückmeldungsdaten verwendet. Der Aufbau wird in einem luftdichten Gehäuse platziert, um eine reproduzierbare Fertigung durch die Bereitstellung der gleichen Luftkonvektionsbedingungen zu gewährleisten. Die Polymerlösung für das Elektrospinnen besteht aus Polystyrolpellets (430102-1KG, Sigma-Aldrich, USA) als Trägerpolymer, wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (DMF) als Lösungsmittel (227056-1L, Sigma-Aldrich, USA), Cumarin 6 ( 442631-1G, Sigma-Aldrich, USA) als hydrophober Fluorophor und Eisenoxid-Nanopartikel (\(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\)) (637106-25G, Sigma-Aldrich, USA). ) als magnetisches Material44,45. Für die Herstellung kontinuierlicher Perlen- und gerader Fasern werden Lösungen mit 30,02 % (19,8 % Polystyrol, 10,0 % \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\), 0,2 % Cumarin 6) und 45,25 % (30,1) verwendet % Polystyrol, 15,0 % \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\), 0,2 % Cumarin 6) Gewichts-Volumen-Verhältnis in DMF werden jeweils hergestellt. \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\) und DMF werden zunächst 30 Minuten lang beschallt, um die Partikel aufzulösen. Anschließend werden der Mischung Polystyrol-Pellets und Cumarin 6 zugesetzt und mit einem Rollenmischer (LLG-uniRoller 6, LLG-Labware, Deutschland) 12 Stunden lang vermischt, um eine homogene Lösung zu erreichen. Für den Elektrospinning-Prozess wird die Polymerlösung in eine Kunststoffspritze gegeben und über einen Teflonschlauch mit einer 18-Gauge-Nadel mit stumpfer Spitze (TS18SS-15, Adhesive Dispensing Ltd., UK) verbunden. Beschleunigungsspannung, Lösungszufuhrgeschwindigkeit und Abstand zwischen Spitze und Kollektor werden auf 14 kV, 2,5 ml/h bzw. 16 cm eingestellt. 0,04 ml Polymerlösung werden auf einmal elektrogesponnen und Fasernetze werden auf einer geerdeten Aluminiumfolie bei 24 \(^{\circ }\)C und 22 % Luftfeuchtigkeit abgelegt. Die Lösungsmittelrückstände auf den elektrogesponnenen Fasern werden durch 12-stündiges Trocknen bei Raumtemperatur entfernt. Abbildung 1b1,b2 zeigt die Morphologien der Fasernetze, die mit Rasterelektronenmikroskopie (JSM-7200F, JEOL, Japan) abgebildet wurden. Abgelegte Fasernetze werden mit einem Skalpell in 2–3 mm große Stücke geschnitten und dann in ein Glasfläschchen getaucht, das 1 % (Volumen/Volumen) Tween 80 (P4780-100ML, Sigma-Aldrich, USA) in Milli-Q-Wasser enthält. Fluoreszierende und magnetische Mikrowirkstoffe werden durch 2-stündiges Schneiden der Fasern mit einem Ultraschallgerät (2510, Branson, USA) erhalten (Abb. 1c1). Der Polymermahlprozess mittels Ultraschall kürzt die Endlosfasern nach dem Zufallsprinzip, um Mikrowirkstoffe zu erhalten. Der Elektrospinning-Aufbau ist auch für die Ablage der Fasern auf dem Kollektor mit zufälliger Ausrichtung ausgelegt. Diese Herstellungstechnik wird ausgewählt, um die Validierung der Mehrfarbenbildaufnahme mithilfe von Mikroagenten mit zufälliger Größenverteilung zu ermöglichen. Um Mikrowirkstoffe mit der gewünschten Größe zu erhalten, können synthetisierte Fasern mit einem Trommelkollektor ausgerichtet und mit einem Laser geschnitten werden46. Darüber hinaus gewährleistet das Elektrosprühverfahren die Herstellung perlenförmiger Mikrowirkstoffe mit enger Größenverteilung. Der Aufbau kann ohne jegliche Modifikation für das Elektrosprühen verwendet werden47. Abbildung 1c2 zeigt Fluoreszenzbilder der hergestellten Mikrowirkstoffe. Das Oberflächenprofil eines mittels konfokaler Mikroskopie charakterisierten Mikrowirkstoffs (S Neox, Sensofar, Spanien) ist in Abb. 1c3 dargestellt. Um optimale Anregungs- und Emissionswellenlängenbereiche für die Fluoreszenzmikroskopie zu bestimmen, wird das Spektrum der Mikrowirkstoffe mit einem Spektrofluorometer (FP-8300, Jasco, Japan) charakterisiert.

Die Lösung für die Spektrumanalyse wird durch Auflösen von 2,11 mg Cumarin 6 in 5 ml DMF hergestellt. Für die Messung werden 10 µl Lösung mit 690 µl DMF in einer Quarzküvette (CV10Q700F, Thorlabs, USA) verdünnt. Ultraviolett-sichtbare Anregungs- und Emissionsspektren im Wellenlängenbereich zwischen 200 und 900 nm werden mithilfe der 2D-Spektrumanalyse gemessen (Abb. 1d1). Die maximalen Anregungs- und Emissionswellenlängen für Cumarin 6 in DMF werden mit 461 nm bzw. 505 nm gemessen. Zur Messung des Emissionsspektrums bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen wird eine 3D-Spektrumanalyse durchgeführt. Die Lösung wird zwischen 350 nm und 500 nm in Schritten von 1 nm angeregt und emittierte fluoreszierende Photonen werden im Wellenlängenbereich von 450 nm und 600 nm gesammelt (Abb. 1d2, d3). Unsere Messung zeigt, dass Fluoreszenzphotonen mit maximaler Intensität gesammelt werden, wenn die Anregung und Emission mit den Spektralbändern 436–477 nm bzw. 497–518 nm durchgeführt werden. Gemäß der Spektralanalyse werden Banden bei 450–490 nm und 500–540 nm ausgewählt, um Cumarin 6 anzuregen und emittierte fluoreszierende Photonen zur Visualisierung der hergestellten Mikrowirkstoffe zu sammeln. Abbildung 1e1 zeigt ein Beispiel einer Einzelband-Fluoreszenzmikroskopie für die magnetische Bewegung eines Mikroagenten. Zur Visualisierung der Mikrowirkstoffe in einer Tumorumgebung, die HeLa-Zellsphäroide mit einem Durchmesser von 200 \(\upmu\)m enthält, wird eine Mehrfarbenmikroskopie durchgeführt.

HeLa-Zellen werden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (11-965-092, Fisher Scientific Ltd. Kanada), ergänzt mit 10 %, fötalem Rinderserum (F7524-500ML, Sigma-Aldrich, USA) und 1 % (Volumen/Volumen) kultiviert ) Penicillin-Streptomycin (15-140-122, Thermo Fisher Scientific Inc., USA)29. Zellen in 2D werden bei 80 % Konfluenz kultiviert und passagiert und alle 48 Stunden wird ein Mediumwechsel durchgeführt. Zur Bildung von 3D-Krebssphäroiden werden Zellen trypsinisiert, auf eine Dichte von \(2\times {10}^6\) Zellen/ml resuspendiert und in 3 % (Gewicht/Volumen) Agarose (16500500, ultrarein) ausgesät Agarose, Invitrogen, USA) Mikrowell-Arrays, was durchschnittlich 267 Zellen pro Sphäroid ergibt. Der halbe Mediumwechsel erfolgt täglich. Am dritten Tag werden die Sphäroide gesammelt und mit \(10\,\upmu \hbox {M}\) CellTracker Red CMTPX (C34552, Thermo Fisher Scientific Inc., USA) durch 45-minütige Inkubation in einem serumfreien Medium gefärbt und gewaschen zweimal mit Zellkulturmedium. Sowohl 2D- als auch 3D-Kulturen werden in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid bei 37\(^\circ\)C durchgeführt. Zur Langzeitlagerung werden mit CMTPX gefärbte 3D-Sphäroide 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Formaldehyd (F8775-25ML, Sigma-Aldrich, USA) fixiert und dann zweimal mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) gewaschen. Für bildgebende Experimente werden die Sphäroide mithilfe des entwickelten Mikrofluidikchips immobilisiert und gehalten (Abb. 6a).

Zur Herstellung einer Negativform der Chips mit einer Höhe von 187 \(\upmu\)m wird die Standard-Softlithographie-Methode unter Verwendung von SU-8-Fotolack48 verwendet. Der Salzungsprozess wird durchgeführt, um die Polydimethylsiloxanschicht (PDMS) leicht zu entfernen und die Oberflächenhydrophilie der Form zu verbessern. Eine entgaste 10:1-Mischung aus PDMS und Härter (Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit, Dow Corning, USA) wird über die Form gegossen und 12 Stunden lang bei 70 °C im Ofen ausgehärtet. Nachdem die ausgehärtete PDMS-Schicht entfernt wurde, werden Einlass- und Auslassöffnungen gestanzt. Die Chipherstellung wird abgeschlossen, indem die PDMS-Schicht mittels Plasmaoxidation auf ein Mikroskopglas geklebt wird. Die Haftfestigkeit wird verbessert, indem der Chip 4 Stunden lang auf einer Heizplatte bei 70 °C gebrannt wird. Ein einzelnes Zellsphäroid wird zunächst in den Chip überführt und durch eine Luftblaseninjektion immobilisiert. Mikrowirkstoffe werden mit 250 \(\upmu\)g/ml Indocyaningrün (I2633-25MG, Sigma-Aldrich, USA) im Kulturmedium gemischt und anschließend durch Pipettieren in den Chip injiziert. So entsteht ein 3D-Tumormodell für die mehrfarbige Bildaufnahme (Abb. 6a3). Um zu zeigen, dass die Mehrfarbenmikroskopie spektral aufgelöste Bilder für die Mikrowirkstoffe in vaskularisierten Modellen liefert, wird auf einem mikrofluidischen Kanal ein perfundierbares Gefäßnetzwerk gebildet.

Rotes Fluoreszenzprotein – menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (RFP-HUVECs) (cAP-0001, Angio-Proteomie, USA) werden in 2D mit Endothelzellwachstumsmedium-2 (EGM-2-Medium) (Endothelial Cell Growth Medium 2 Kit, C-22111, Promo Cell, USA) mit 1 % (Vol./Vol.) (v/v) Penicillin-Streptomycin. Parallel dazu werden mesenchymale Stammzellen (PT-2501, Lonza, USA) in 2D in minimalem essentiellen Medium der Eagle-Alpha-Modifikation (22571020, Thermo Fisher Scientific, USA) kultiviert, ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (F7524v). , Sigma-Aldrich, USA), 2 mM L-Glutamin (35050061, Thermo Fisher Scientific, USA), 0,2 mM Ascorbinsäure (A8960-5G, Sigma Aldrich, USA), 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin (15 -140-122, Thermo Fisher Scientific, USA) und 1 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Basis (PHG0261, Thermo Fisher Scientific, USA). Beide Zelltypen werden in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid bei 37 \(^{\circ }\)C kultiviert und zwischen den Passagen 4 und 6 verwendet. Die Zellen werden vor der Ablösung bis zu einer Konfluenz von 80 % kultiviert und in a gemischt Konzentration von \(10\times 10^{6}\) Zellen/ml (Verhältnis 1 zu 1) in einem Fibrinhydrogel in einer Endkonzentration von 3 mg/ml (Fibrinogen, 0215112201, MP Biomedicals, USA) und 3 U davon Thrombin (0215416301, MP Biomedicals, USA). Das Zell-Matrix-Gemisch wird in die Hydrogelkammer des Gelladeanschlusses des Mikrofluidiksystems injiziert und im Inkubator bei 37 \(^{\circ }\)C für 15 Minuten polymerisieren gelassen. Zuvor wird der mikrofluidische Oberflächenbereich funktionalisiert, um eine starke Hydrogel-Wechselwirkung mit PDMS und Glas zu fördern, indem der mikrofluidische Chip nach der Plasmaoxidationsbindung für 4 Stunden mit Poly-D-Lysin-Hydrobromid (P1024-10MG, Sigma-Aldrich, USA) inkubiert wird Waschschritte mit sterilem Milli-Q-Wasser. Nach der Polymerisation des Hydrogels werden die Gelladeöffnungen mit Streifen einer Standard-PCR-Platten-Versiegelungsfolie blockiert, um Flüssigkeitslecks zu vermeiden, und die Flusskanäle neben dem Hydrogelkanal werden mit EGM-2-Medium gefüllt. Der Druckabfall von 5 Pa zur Erzeugung der mechanischen Reize für die In-vitro-Vaskularisierung wird durch die Verbindung zweier Spritzenpumpen (AL-1600, New Era Pump Systems, USA) auf vertikal gegenüberliegenden Seiten hergestellt. Eine Übersicht über das Mikrofluidiksystem zur Erzeugung einer In-vitro-Vaskularisierung ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Der Einlassanschluss wird zum Injizieren des EGM-2-Mediums und der Auslassanschluss zum Herausziehen verwendet, während die Fluidanschlüsse nach der Initialisierung mit PDMS blockiert werden Füllung. Durch Anwendung vorab festgelegter Flussraten mit EGM-2-Medium durch Flussstudien, die mit COMSOL Multiphysics (Version 5.5, COMSOL AB, Schweden) durchgeführt wurden. Der Druckabfall wird vor den Experimenten 7 Tage lang aufrechterhalten. Für die Mehrfarbenmikroskopie werden 250 \(\upmu\)g/ml Indocyaningrün im Zellkulturmedium und Mikrowirkstoffe in das Mikrofluidiksystem injiziert. Abbildung 7a1 zeigt die Mikrowirkstoffe im konstruierten Gefäßnetzwerk. Um Mikrowirkstoffe in natürlichen Gefäßen sichtbar zu machen, wird eine ex-ovo-Hühner-Chorioallantoismembran als Testumgebung verwendet.

Weiße Leghorn-Hühnerembryonen werden während des gesamten Kultivierungsprozesses bei 38 °C und 65 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Am 10. Tag wird der Eiinhalt in 60-mm-Zellkultur-Petrischalen aufgebrochen49. Eialbumin- und Eigelbinhalte werden mit Pipetten zur Handhabung viskoser Flüssigkeiten entfernt. Das Gefäßsystem wird dreimal mit eiskalter DPBS-Lösung (14190250, Thermo Fisher Scientific, USA) gewaschen und dann über Nacht bei 4 °C lange in 4 % Paraformaldehyd (1004965000, Sigma-Aldrich, USA) fixiert -Langfristige Lagerung. Anschließend erfolgt die Inkubation mit 0,3 % Triton X-100 (T8787-250ML, Sigma-Aldrich, USA) in DPBS für 30 Minuten und das dreimalige Waschen mit eiskalter PBS-Lösung. Für die Mehrfarbenmikroskopie wird das Gefäßsystem zunächst dezellularisiert (Erythrozyten entfernt) und anschließend mit Rhodamin B (K94900-25, Labshop, Niederlande) und Indocyaningrün gefärbt.

Echtzeit-Weitfeld-Mehrfarbenmikroskopie wird durch Anregung der Fluorophore aus drei verschiedenen Spektralbändern im Round-Robin-Verfahren durchgeführt29. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird synchron gesammelt, um 8-Bit-Graustufen-Einzelbilder mit 1280 \(\times\) 1024 Pixeln zu erfassen. 10x- und 5x-Objektive mit großem Arbeitsabstand (Plan Apo, Mitutoyo, Japan) werden verwendet, um das Anregungslicht auf die Proben zu fokussieren und die emittierten Fluoreszenzphotonen zu sammeln. Cumarin 6 und Indocyaningrün werden im Spektrum von 450 bis 490 nm bzw. 750 bis 800 nm angeregt. Das emittierte Licht wird bei 500 bis 540 nm für Cumarin 6 bzw. 817,5 bis 875,5 nm für Indocyaningrün gesammelt. CMTPX, RFP-HUVECs und Rhodamin B werden aus dem Band von 554,5 bis 589,5 nm angeregt und das emittierte Licht wird im Wellenlängenbereich von 592,5 bis 667,5 nm gesammelt. Die Intensitätswerte in den einzelnen Bildern, die von den Spektralbändern 500 bis 540 nm, 592,5 bis 667,5 nm und 817,5 bis 875,5 nm aufgenommen wurden, werden jeweils durch Schwarz-Grün-, Schwarz-Rot- und Schwarz-Blau-Farbkarten dargestellt (Abb. 5a4, 7b). , 8a4). Mehrfarbige Bilder entstehen durch Überlagerung der in einer Runde aufgenommenen farbkonvertierten Einzelbilder. Eine orthogonale Anordnung von vier elektromagnetischen Spulen mit Eisenkern und einer Grenzfrequenz von 110 Hz wird im Arbeitsraum des Mikroskops platziert, um die Mikroagenten mithilfe des Rotationsfelds zu bewegen (Abb. 6d). Zur Wärmeableitung ist das Spulenfeld mittels konischer Kragen auf einem Aluminiumhalter montiert. Die Spulen sind zur Verbesserung der Wärmeübertragung und elektrischen Isolierung mit Kupferband abgedeckt. Zur Versorgung der Spulen50 werden schaltbare Verstärker mit Gleichstromversorgung (EA-PS 5040-20A, EA Elektro-Automatik, Deutschland) verwendet. Zur Erzeugung von Referenzsignalen für die Drehfeldfrequenz wird ein Signalgenerator (4050B, BK Precision, USA) verwendet. Die Signale werden über eine Demultiplexer-Schnittstelle (74HC4052, Texas Instruments, USA) durch Erkennung fallender Flanken mittels eines Mikrocontrollers an einen entsprechenden Spulentreiber verteilt. Das vom Spulenarray erzeugte maximale Magnetfeld wird mit einem Teslameter (3MH3A, Senis AG, Schweiz) mit 30 mT gemessen. Die magnetische Anziehungskraft wird durch zwei Neodym-Eisen-Bor-Permanentmagnete (S-45-30-N, Supermagnete, Deutschland) erzeugt. Das von den Magneten erzeugte maximale Magnetfeld und der maximale Gradient werden mit 120 mT bzw. 5 T/m gemessen.

Gemäß den niederländischen Tierschutzrichtlinien ist eine IACUC-Genehmigung für Experimente mit Hühnerembryonen nicht erforderlich, es sei denn, es ist mit einem Schlüpfen zu rechnen. Darüber hinaus benötigen nur Experimente mit Hühnerembryonen der Entwicklung EDD14 und älter eine IACUC-Genehmigung. Die in dieser Studie verwendeten Embryonen befanden sich alle in den frühen Stadien der Embryonalentwicklung (EDD10). Die in dieser Studie verwendeten befruchteten Hühnereier wurden von zugelassenen Geflügel-Eierfarmen in den Niederlanden gekauft. Die Kulturstudien von RFP-HUVEC wurden vom niederländischen Ministerium genehmigt und die Experimente wurden in einer ML-1-Laborumgebung gemäß den Richtlinien und dem Standardprotokoll der Universität durchgeführt.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Die Autoren danken Pelin Kubra Isgor für die Einführung der ersten Designidee des Mikrofluidik-Chips. Sie möchten außerdem Efe Bulut, Wouter Abbas, Edwin Morsink, Nick Helthuis, Erik G. de Vries, Michiel Richter, Vasileios Trikalitis und Juan Sevilla für ihre technische Unterstützung und fruchtbaren Diskussionen danken. Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen des Grant 638428-Projekts ROBOTAR: Robot-Assisted Flexible Needle Steering for Targeted Delivery of Magnetic Agents unterstützt.

Labor für chirurgische Robotik, Abteilung für Biomechanik, Universität Twente, 7522 NB, Enschede, Niederlande

Mert Kaya, Islam SM Khalil und Sarthak Misra

Labor für chirurgische Robotik, Abteilung für Biomedizintechnik und Universitätsklinikum Groningen, Universität Groningen, 9713 AV, Groningen, Niederlande

Mert Kaya, Zhengya Zhang und Sarthak Misra

Vaskularisationslabor, Abteilung für Biomechanik, Universität Twente, 7522 NB, Enschede, Niederlande

Fabian Stein, Prasanna Padmanaban und Jeroen Rouwkema

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MK entwickelte das mehrfarbige Fluoreszenzmikroskop, entwarf den Elektrospinning-Aufbau und stellte Mikrowirkstoffe her. MK und ZZ entwarfen mechanische Komponenten im Elektrospinning-Aufbau. MK und FS haben den Mikrofluidik-Chip modifiziert und hergestellt. FS bildete HeLa-Zellsphäroide und konstruierte ein in vitro Gefäßnetzwerk im Mikrofluidiksystem. PP inkubierte Hühnerembryonen und präparierte ex ovo Chorioallantoismembranproben. MK, FS und PP führten Experimente durch und erstellten das Manuskript. ISMK, JR und SM lieferten wissenschaftliches Feedback. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Mert Kaya.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Ergänzende Informationen 3.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kaya, M., Stein, F., Padmanaban, P. et al. Visualisierung von Mikroagenten und ihrer Umgebung durch Echtzeit-Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie. Sci Rep 12, 13375 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17297-7

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Eingegangen: 22. April 2022

Angenommen: 22. Juli 2022

Veröffentlicht: 04. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17297-7

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