Aufbau des Uracil-Gerüsts in primitiven Teichen am Ursprung des Lebens: Carbamoylierung von Asparaginsäure

Mar 16, 2024

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 19178 (2022) Diesen Artikel zitieren

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In Meteoriten findet man eine große Menge an Nukleobasen und Aminosäuren, was darauf hindeutet, dass im Sonnensystem mehrere chemische Reservoire vorhanden sind. Die Hypothese der „geochemischen Kontinuität“ untersucht, wie sich protometabolische Pfade aus sogenannten „Bausteinen“ in einer enzymfreien präbiotischen Welt entwickelten und wie sie die Entstehung des Lebens beeinflussten. In der lebenden Zelle ist der zweite Schritt der Synthese von Uridin- und Cytidin-RNA-Monomeren ein Carbamoyltransfer von einem Carbamoyldonor auf Asparaginsäure. Hier vergleichen wir zwei enzymfreie Szenarien: wässrige und mineralische Oberflächenszenarien in einem thermischen Bereich bis 250 °C. Beide Prozesse könnten in Teichen unter offener Atmosphäre auf der Urerde stattgefunden haben. Die Carbamoylierung von Asparaginsäure mit Cyanat in wässrigen Lösungen bei 25 °C liefert innerhalb von 16 Stunden hohe Ausbeuten an N-Carbamoyl-Asparaginsäure. Es ist wichtig zu betonen, dass verschiedene Moleküle zwar thermodynamisch wirksame Carbamoylierungsmittel sein könnten, die Kinetik jedoch eine entscheidende Rolle bei der Auswahl präbiotisch möglicher Wege spielt.

Die Frage der Entstehung der ersten Lebensformen, von denen wir nichts wissen und die dennoch Darwins Nachkommen sind, kann aus dem Blickwinkel des Übergangs vom Inaktiven zum Lebendigen angegangen werden. Die Hypothese der „geochemischen Kontinuität“1 besagt, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Evolution des Lebens wichtige Teile der Stoffwechselwege Reaktionen wiederholten, die zuvor in einem nichtbiologischen Umfeld stattfanden. Es ist sowohl sparsam als auch falsifizierbar und auch mit der Vorstellung vereinbar, dass sich das Leben in einem kontinuierlichen Prozess und nicht als „ungewöhnlicher Zufall“ entwickelt hat. Darüber hinaus können protometabolische Wege aus einfachen, reichlich vorhandenen Vorläufern biochemische Bausteine ​​kontinuierlich nachliefern und so das Erschöpfungsproblem vermeiden, das bei exogenen Abgabeszenarien auftritt2,3. In dieser Hypothese könnten lebensbestimmende Strukturen (Stoffwechsel, Information, Kompartimente) auf denselben allgemeinen Wegen initiiert worden sein, jedoch mit anderen Alternativen für die kinetische (anorganische, einschließlich heterogene Katalyse) und thermodynamische Kontrolle (freie Energie, die aus makroskopischen Umgebungsschwankungen entsteht). ) als diejenigen, die wir heute in Organismen beobachten4,5.

In diesem Gedankengang untersuchen wir eine typische Stoffwechselsequenz der Nukleotidbiosynthese, die De-novo-Synthese von Pyrimidinen (Orotat-Weg), mit dem Ziel, sie in eine abiotische Umgebung zu übertragen. Die nicht-enzymatische Pyrimidin-Biosynthese ist in letzter Zeit Gegenstand von großem Interesse, entweder durch Versuche zur Transposition des Orotat-Wegs6 oder durch alternative Wege mit unterschiedlichen Vorläufern7. In einer früheren Veröffentlichung haben wir das präbiotische Potenzial von Carbamoylphosphat untersucht, einem aktivierten Carbamoylierungsmittel, das zu Beginn dieses biochemischen Stoffwechselwegs verwendet wird. Im vorliegenden Fall konzentrieren wir uns auf die Bildung von N-Carbamoyl-Asparaginsäure (NCA), dem 7-atomigen Vorläufer des Uracil-Gerüsts.

NCA, auch Ureidobernsteinsäure8 genannt, kommt in allen lebenden Spezies vor, von Bakterien bis hin zu Eukaryoten. NCA kommt im Zytoplasma sowie in Exkrementen (Speichel) und Organen (Prostata) vor. Es wird aus Carbamoylphosphat und L-Asparaginsäure durch die Wirkung des Aspartat-Carbamoyltransferase-Enzyms (ATCase)9 synthetisiert. Da es eine Schlüsselrolle im Aspartat- und Pyrimidinstoffwechsel spielt, ist es an mehreren Funktionsstörungen wie der Canavan-Krankheit und dem Dihydropyrimidinase-Mangel10 beteiligt.

Nach einem zusätzlichen Cyclisierungsschritt bildet NCA das Grundgerüst von Orotsäure11,12, der Vorstufe von Uracil5,13,14 (Abb. 1), und ist daher ein wichtiges präbiotisches Ziel zur Überprüfung, ob die geochemische Kontinuitätshypothese gültig ist.

Aktuelle In-vivo-Pyrimidin-Biosynthese entlang des Orotat-Weges. Der hier untersuchte Schritt ist eingerahmt.

In früheren Arbeiten haben wir gezeigt, dass Carbamoylphosphat (CP) unter präbiotischen Bedingungen eher instabil ist, aber zwei weitere Moleküle produziert, die immer noch die energiereiche Carbamoyl-Einheit enthalten: Cyanat und Harnstoff15. Es ist daher unwahrscheinlich, dass CP selbst an einem präbiotischen Carbamoylierungsweg beteiligt war. Das Potenzial von Cyanat- und Harnstoffverbindungen als alternative Carbamoylierungsmittel muss jedoch untersucht werden. Im Gegensatz zu Carbamoylphosphat16 können Cyanat- und Harnstoff-ähnliche Verbindungen in präbiotischen Umgebungen auf verschiedenen Wegen hergestellt werden. Daher untersuchten wir zunächst die NCA-Synthese durch die Reaktion zwischen Cyanat und L-Asparaginsäure unter alkalischen wässrigen Bedingungen. Anschließend untersuchten wir auch Mineraloberflächenszenarien mit Trocknungsschritten, um die Vorhersagen der geochemischen Kontinuitätshypothese zu testen, einschließlich der Idee, dass Mineralkatalysatoren die Rolle von Enzymen nachahmen können (Abb. 2).

Drei Szenarien der NCA-Bildung.

In unserem ersten Experiment war der Carbamoyldonor Natriumcyanat, das unter basischen Bedingungen mit Aspartat reagierte (siehe Methoden). Die N-Carbamoylierung von Asparaginsäure wurde tatsächlich schon vor langer Zeit im Nyc-Protokoll17 für die Orotsäuresynthese verwendet. Die N-Carbamoylierung generischer Aminosäuren durch Cyanat wurde vom Commeyras-Team weiter untersucht18,19.

Die Natriumhydroxidlösung, die ursprünglich Asparaginsäure und Natriumcyanat im Verhältnis 1:1 enthielt, wurde 16 Stunden lang bei 25 °C reagieren gelassen, Proben entnommen und direkt in deuteriertem Wasser mittels 1H-NMR analysiert. Es sind zwei Signalsätze erkennbar (Abb. S1). Der Satz von Natriumaspartat (Abb. 3) besteht aus vier Signalen, die NH, Hα und den beiden Hβ-Protonen entsprechen, wobei letztere mit Signalen des zweiten Satzes überlappt sind. Ebenso besteht der zweite Satz aus vier Signalen, die NH, Hα und den beiden Hβ-Protonen entsprechen, wobei letztere mit den Signalen des ersten Satzes überlappen. Dies passt zu NCA, einem Molekül, das die gleiche Art von Protonen wie Aspartat aufweist, nur geringfügig durch Carbamoylierung gestört.

Vergleich der molekularen Strukturen von Aspartat und NCA. Die hinzugefügte Carbamoylfunktion ist blau.

Die Identifizierung der beiden Sätze stimmt vollständig mit der COSY-Korrelation überein (Abb. S2). Kleinere Peaks korrelieren als ein Satz (Asp), während alle größeren Peaks (NCA) miteinander korrelieren. In jedem Satz ist Hα mit Hβ mit einem J3H-H korreliert. Darüber hinaus sind die beiden Hβ mit einem J2H-H miteinander korreliert. 13C-NMR bestätigt die Zuordnungen (Abb. S3). Eine DEPT 135-Erfassung (Abb. S4) unterschied die Signale zwischen den einzelnen Sätzen. Ein zusätzliches 13C-Signal bei 162,0 ppm ohne Korrelation mit Wasserstoffatomen wurde als Carbonat identifiziert, das aus der teilweisen Zersetzung von Cyanat resultierte15,20. HSQC- und HMBC-Korrelationen (Abb. S5 und S6) trugen dazu bei, Kohlenstoffe und Wasserstoffe eindeutig zu verknüpfen. Diese Ergebnisse liefern eine klare spektroskopische Signatur einer erfolgreichen NCA-Bildung (Abb. 2).

Durch die Integration von Protonensignalen beträgt die durchschnittliche NCA-Ausbeute nach 16 Stunden 92 %. Bei weiterer Entwicklung beträgt der Wert 88 % nach 23 Tagen (Abb. S7 und S8) und 91 % nach einem Jahr (Abb. S9). Somit blieb die NCA über einen langen Zeitraum stabil (bzw. metastabil), obwohl der pH-Wert von 6,96 auf 8,66 bzw. 9,41 driftete. Zum Vergleich verwendeten Yi et al. Carbamoylphosphat (anstelle von Cyanat) und Aspartat bei einer Konzentration von 8,3 mM und einem pH-Wert von 8. erhielten NCA in einer Ausbeute von 37 %6.

Zwei Experimente wurden unter den gleichen Bedingungen (siehe Abschnitt „Methoden“) wie das vorherige durchgeführt, jedoch wurde Cyanat durch andere potenzielle Carbamoyldonoren ersetzt.

Biuret, das bei der Dimerisierung von Harnstoff entsteht21,22,23, ist auch in präbiotischen Szenarien relevant24,25,26,27. Theoretisch könnte jedes Biuretmolekül nach den beiden in Abb. 4 dargestellten aufeinanderfolgenden Reaktionen zwei Aspartate carbamoylieren: Obwohl die Konzentration des „Carbamoylierungsmittels“ dieselbe wie im vorherigen Experiment ist, beträgt das Verhältnis Carbamoylgruppe/Aspartat stattdessen 2:1 1:1.

Biuret als potenzieller doppelter Carbamoyldonor.

Nach 16 Stunden bei 25 °C wurden die Reaktionsprodukte mittels 1H-NMR analysiert (Abb. S10). Es war nur ein Satz von vier Signalen vorhanden, die Aspartat zugeordnet wurden (Abb. 3). Dieser Mangel an Reaktivität wird durch eine COSY-Korrelation bestätigt (Abb. S11). Daraus lässt sich schließen, dass innerhalb von 16 Stunden keine nachweisbare Menge NCA gebildet wird. Die Entwicklung wurde über längere Zeiträume beobachtet: Nach 23 Tagen und sogar nach 10 Monaten wurde nur unmodifiziertes Aspartat nachgewiesen (Abb. S12 und S13).

Da die erwartete Ausbeute dieser Reaktion im Gleichgewicht theoretisch 99,98 % betragen würde, basierend auf der Reaktion ΔrG°' (standardisierte molare freie Reaktionsenthalpie, − 44,1 kJ/mol), können wir schlussfolgern, dass die Biuret-Aspartat-Reaktion extrem langsam verläuft Kinetik. Wir können nicht ausschließen, dass über einen sehr langen Zeitraum (länger als mehrere Jahre) eine Carbamoylierung durch Biuret stattfinden könnte, aber auf jeden Fall würde die kinetische Konkurrenz Cyanat als Carbamoylierungsreagens begünstigen – ganz zu schweigen von der Tatsache, dass die Geschwindigkeit der NCA-Zersetzung durch Amidbindung Die Hydrolyse wäre vergleichbar mit ihrer Bildungsgeschwindigkeit.

Harnstoff wurde ebenfalls als potenzielles Carbamoylierungsmittel geprüft8, aber unter den betrachteten Bedingungen (16 h, 25 °C) blieb Aspartat unverändert (Abb. S14).

Carbamat selbst (-O2C-NH2) kann kein effizientes Carbamoylierungsmittel sein, da sein Gehalt an freier Enthalpie zu niedrig ist: Der berechnete ΔrG°' der NCA-Bildung aus Carbamat und Aspartat ist bei allen pH-Werten weitgehend positiv (Abb. 5). Man hätte jedoch denken können, dass die Zugabe von energiereichen Reagenzien wie Phosphorylierungsmitteln die Carbamoylierung von Aspartat durch Carbamat ermöglichen könnte. Die Trimetaphosphat-Chemie scheint in dieser Hinsicht vielversprechend, da dieses Molekül und seine Abbauprodukte in der präbiotischen Chemie weit verbreitet sind28,29; Es wurde sogar vermutet, dass die „RNA-Welt“ durch die Verwendung von Trimetaphosphat als Energiequelle gekennzeichnet war30,31.

Links: pH-Abhängigkeit der umgewandelten freien Gibbs-Reaktionsenergie für biotische und abiotische NCA-Bildungsgleichgewichte aus Aspartat und Carbamat (a), Harnstoff (b), Cyanat (c), Carbamoylphosphat (d) und Biuret (e). Die Werte werden für pMg = 5, Ionenstärke = 1 M berechnet. Rechts: die entsprechenden Reaktionen, konventionell geschrieben mit allen Reagenzien in vollständig protonierter Form.

Um diese Idee zu überprüfen, wurde eine Lösung von Phosphorylierungsmitteln (erzeugt durch Trimetaphosphat-Ammonolyse bei 70 °C für 66 Stunden15) bei 100 °C mit L-Asparaginsäure und Ammoniumcarbamat umgesetzt und mittels 1H- und 13C-NMR analysiert. Die angestrebte Reaktion – die Kondensation von Asparaginsäure mit Carbamat – fand nicht statt, aber die anfänglichen Signale von Aspartat waren dennoch tiefgreifend verändert.

Die Verdoppelung jedes 1H-NMR-Signals von L-Asparaginsäure allein kann als Beweis für eine Dimerisierung interpretiert werden32. Die im 1H-NMR vorhandenen Spaltsignale von L-Asparaginsäure konnten eindeutig einem Asp-Asp-Dimer zugeschrieben werden (Abb. S15 und S16)32, das wir der Spezies β-Asp-Asp zuordneten. Thermisch gewonnene Polyasparaginsäure hat ein α/β-Verhältnis von 1/1,333. Die thermische Polymerisation ist daher kaum selektiv; Im Gegensatz dazu scheint unsere Reaktion eine einzige Verbindung zu bilden.

Somit wurde die im Phosphoramidat enthaltene freie Enthalpie auf andere hochenergetische Bindungen übertragen, nämlich die Peptidbindungen im Asp-Asp-Dimer, was ein weiteres Beispiel für die Vielseitigkeit von Phosphoramidaten als Kopplungsmittel darstellt, die von Osumah und Krishnamurthy34 hervorgehoben wurden; es kam jedoch nicht zur NCA-Bildung.

Amorphe Kieselsäure (SiO2) ist bekanntermaßen effizient für präbiotische Kondensationsreaktionen, insbesondere von Aminosäuren zu Peptiden35, und ist ein präbiotisch realistisches Mineral36,37,38. Es handelt sich um einen mäßig sauren Katalysator, dessen katalytische Eigenschaften auf H-Brückenbildung und Silanolazidität beruhen39,40. So haben wir Aspartat zusammen mit Cyanat oder Harnstoff, aber auch mit Carbamat und Ammoniumcarbonat auf Kieselgel coadsorbiert. Die meisten dieser potenziellen Carbamoylierungsmittel wurden durch Trocknen bei Raumtemperatur entfernt, dh bevor sie mit den Aspartatmolekülen reagieren konnten, wie aus Transmissions-IR-Spektren der getrockneten Systeme hervorgeht (Abb. S17). Für die Systeme (Aspartat + Cyanat), (Aspartat + Carbamat) und (Aspartat + Carbonat) wurden nur die Banden des adsorbierten Aspartats beobachtet, was darauf hinweist, dass der andere Partner in die Gasphase verloren ging. Für das (Aspartat + Harnstoff) auf SiO2-System sind die charakteristischen Harnstoffbanden nach dem Trocknen immer noch sichtbar, eine anschließende TG + MS-Studie zeigte jedoch, dass sich Harnstoff bei 140 °C thermisch zersetzt, ohne mit Aspartat zu reagieren.

Da die Carbamoylierung auf saurem Siliciumdioxid fehlschlug, wandten wir uns einem mineralischen Träger mit basischen Eigenschaften zu. Brucit (Mg(OH)2) wäre ein Kandidat, der bereits auf Aspartatadsorption und Reaktivität untersucht wurde41,42. In einer CO2-reichen Atmosphäre wird Brucit jedoch zu Magnesit (MgCO3)43,44,45,46,47 karbonisiert, ebenso wie Periklas (MgO)48. Deshalb haben wir uns für Magnesit als Träger entschieden. Außerdem bilden Asparaginsäure und Mg2+-Ionen aus der MgCO3-Auflösung schnell den Aspartatkomplex49,50, was uns dazu veranlasste, Mg(Asp)2 für die Asp-Abscheidung auszuwählen. Obwohl es als MgCO3 vermarktet wird, zeigten Pulver-XRD-Studien, dass die Mineralphase nach der Imprägnierung und Trocknung unter Stickstoff immer Hydromagnesit (Mg5(CO3)4(OH)2·4H2O)51,52 ist (Abb. S19). Mittels XRD wurde in mit Biomolekülen imprägniertem Hydromagnesit keine Kristallisation organischer Moleküle beobachtet (Abb. S20, S22, S24 und S26).

Nach der Imprägnierung und anschließenden Trocknung bei variablen Temperaturen (Tabelle S1) wurden feste Proben direkt mit deuteriertem Wasser desorbiert. Die Desorptionslösungen wurden mit 1H analysiert (Abb. S25, S27, S28 und S29) und die Spektren mit denen der Referenzverbindungen verglichen (Abb. S18, S21 und S23). Hydromagnesit ist teilweise löslich, daher ist die Wahrscheinlichkeit, dass organische Moleküle am Mineral adsorbiert bleiben und nicht analysiert werden, vernachlässigbar. Laut 1H-Signalintegration war bereits nach dem Trocknen bei Raumtemperatur eine signifikante Menge an NCA zu beobachten, und die NCA-Ausbeute wurde durch thermische Behandlung verbessert. Eine optimale Ausbeute scheint bei 150 °C erreicht zu werden (Abb. S27, Tabelle S1). Bei 230 °C traten neue Signale auf, wahrscheinlich Zersetzungsprodukte von NCA und Poly-Asp oder Poly-Succinimid (Abb. S29).

Es wurden zwei Reaktionsversuche von Biuret und Magnesiumdiaspartat auf Magnesit versucht, bei 25 °C und 140 °C. Es fand keine Kondensationsreaktion statt, wie durch 1H-NMR angezeigt (Abb. S30 und S31).

Die thermodynamischen und kinetischen Parameter der Bildung biologischer Verbindungen werden in vielen biochemischen Studien mit großer Sorgfalt berücksichtigt, insbesondere in den beiden Teilbereichen Bioenergetik und enzymatische Katalyse. Im Gegensatz dazu werden sie in Studien zur Entstehung des Lebens oft vernachlässigt, obwohl in einigen Fällen strenge und aufschlussreiche Daten veröffentlicht wurden53,54.

Ein erster grober Indikator dafür, ob eine bestimmte präbiotische Reaktion thermodynamisch möglich ist, ist die standardmäßige freie Reaktionsenergie (Gibbs), ΔrG°, oder der transformierte Wert bei konstantem pH-Wert, ΔrG°'. Abbildung 5 zeigt den theoretisch erwarteten ΔrG°' für NCA-Bildungsreaktionen aus Aspartat und mehreren möglichen Carbamoylierungsreagenzien in wässriger Lösung als Funktion des pH-Werts der Lösung. Diese Schätzungen ermöglichen die Unterscheidung zwischen zwei Gruppen potenzieller Carbamoylierungsmittel. Bei Carbamat und Harnstoff sollte die Reaktion endergonisch sein, wenn auch nur geringfügig im Fall von Harnstoff, weshalb diese beiden Moleküle (insbesondere Carbamat) wahrscheinlich keine Kandidaten für eine Carbamoylierung in Lösung sind. Im Gegensatz dazu sollte die Aspartatcarbamoylierung durch Carbamoylphosphat (das aktuelle biochemische Mittel), Cyanat und Biuret exergonisch sein. Diese Werte sind pH-abhängig, insbesondere bei Biuret und Cyanat; Die Reaktion mit letzterem wird bei pH < 4 ungünstig, und umgekehrt ist es bei hohem pH ein vielversprechenderes Carbamoylierungsmittel.

Während ΔrG° (bzw. ΔrG°') die Berechnung der Gleichgewichtskonstanten K (bzw. K') ermöglichen, hängen die Gleichgewichtsreaktionsausbeuten zusätzlich zum pH-Wert von den Anfangskonzentrationen aller Reagenzien ab. Reaktion c) mit Cyanat ist beispielsweise eine einfache Kondensation und sollte bei Erhöhung der Gesamtkonzentrationen weiter in Vorwärtsrichtung ablaufen. Zur Veranschaulichung zeigt Abb. 6 die erwarteten NCA-Ausbeuten (im Gleichgewicht) als Funktion des pH-Werts für ein anfängliches Molverhältnis von Cyanat zu Aspartat von 1:1 und Konzentrationen von 50 × 10–3 mol.L-1 (unsere Bedingungen). ) und 25 × 10–6 mol.L-1.

Theoretische Gleichgewichtsausbeute von NCA als Funktion des pH-Werts für (a) C°Asp = C°Cyanat = 50 mmol.L−1, (b) C°Asp = C°Cyanat = 25 µmol.L−1.

Unter den von uns verwendeten Bedingungen wird erwartet, dass die Carbamoylierungsausbeute bei allen pH-Werten ≥ 5 mindestens 96 % beträgt, und selbst im mikromolaren Bereich sollte sie bei pH ≥ 6 > 50 % betragen. Ebenso werden hervorragende Ausbeuten erwartet mit Carbamoylphosphat und noch mehr mit Biuret.

Experimentell führt die Aspartatcarbamoylierung mit Cyanat nach 16 Stunden zu einer Ausbeute von 92 %, und diese Zusammensetzung bleibt über ein Jahr lang stabil. Obwohl dies nicht so hoch ist wie die theoretisch erwarteten Ausbeuten im experimentellen pH-Bereich (> 99,3 %), ist die Reaktion tatsächlich sehr begünstigt und scheint innerhalb weniger Stunden ein Gleichgewicht zu erreichen.

Eine ganz andere Situation ist bei Biuret zu beobachten. Obwohl noch höhere Carbamoylierungsausbeuten zu erwarten wären, wird selbst nach 10 Monaten keine Reaktion festgestellt. Die Kinetik dieser Reaktion muss daher extrem langsam sein – in der Literatur waren keine kinetischen Daten verfügbar, die diese Schlussfolgerung vorhersagen könnten. Bei Harnstoff ist zu erwarten, dass die Carbamoylierung nur geringfügig endergonisch erfolgt, so dass unter unseren Bedingungen eine Ausbeute von > 30 % zu erwarten wäre. Nach 16 Stunden ist keine Reaktion zu beobachten, daher ist auch diese Reaktion nicht sehr schnell.

In früheren Studien erhielt Fox55 NCA aus Asp und Harnstoff in „heißem Wasser“ mit festen Mineralbasen. Es wurden hohe Erträge (46–80 %) erzielt; Schnelle Kinetiken sind die Folge hoher Temperaturen, aber sicherlich auch spezifischer katalytischer Effekte der Festphasen. Yamagata et al. setzten Asparaginsäure mit Harnstoff bei pH 7 und 90 °C in einem offenen Kolben um, der eine konstante Eliminierung des NH3-Produkts ermöglichte (offenes System)56. Unter diesen Bedingungen wandelten sich innerhalb weniger Tage etwa 80 % des Aspartats in NCA und daraus weitere Produkte um. Dies würde bedeuten, dass die Carbamoylierungsreaktion durch Harnstoff bei 25 °C zwar langsam, bei 90 °C jedoch einigermaßen schnell abläuft.

Zusammenfassend ist die Aspartatcarbamoylierung ein Beispiel dafür, dass in der präbiotischen Chemie, wie in allen Bereichen der Chemie, kinetische und thermodynamische Aspekte berücksichtigt werden müssen, um die Machbarkeit eines bestimmten Szenarios zu beurteilen. Für viele Reaktionen liegen thermodynamische Daten vor; Sie sagen uns, dass die Carbamoylierung durch Carbamat kein möglicher Weg ist und durch Harnstoff kaum. Natürlich kann eine endergonische Reaktion auftreten, wenn sie mit einer exergonischen Reaktion gekoppelt ist, wie es in der Biochemie häufig vorkommt. Allerdings kann eine solche Kopplung nur dann in Betracht gezogen werden, wenn ein bequemer Reaktionsweg verfügbar ist, um die Kopplung zwischen den Reagenzien zu induzieren: Die Einführung des energiereichen Trimetaphosphats in das System ermöglichte zwar eine endergonische Reaktion, es handelte sich jedoch um eine Aspartat-Dimerisierung anstelle einer Carbamoylierung.

Im Gegensatz dazu sagt uns die Thermodynamik, dass sowohl Cyanat als auch Biuret mögliche Carbamoylierungsmittel sind. Hier kommt die Kinetik ins Spiel. In der Regel müssen kinetische Studien vollständig durchgeführt werden, da selbst für biochemisch wichtige Moleküle nur wenige solcher Studien verfügbar sind. Sowohl aus thermodynamischer als auch kinetischer Sicht ist nur die Cyanatreaktion vielversprechend. Wir haben das biochemische Carbamoylierungsmittel Carbamoylphosphat (CP) nicht untersucht, da eine frühere Studie uns zu dem Schluss geführt hat, dass es unter präbiotischen Bedingungen wahrscheinlich nicht vorhanden ist oder, wenn es gebildet wird, wahrscheinlich vor der Reaktion zu Cyanat isomerisieren würde.

Die Carbamoylierung von Aspartat durch Cyanat weist alle Merkmale einer „guten“ präbiotischen Reaktion auf. Aufgrund des negativen ΔrG° ist es stark bevorzugt; Es gibt einen schnellen Reaktionsweg auch ohne spezifische Katalyse, und sein Produkt, NCA, ist zwar immer noch energiereich, aber kinetisch inert (nicht anfällig für Zersetzung, selbst im Maßstab von mehreren Monaten), so dass es verfügbar bleibt weitere Transformationen für lange Zeit nach der Entstehung. Dies ist in Abb. 7 dargestellt, wo schnelle Reaktionen durch ausgefüllte Pfeile und langsame durch gestrichelte Pfeile dargestellt sind.

Eine teilweise energetische Ansicht der NCA-Bildungsreaktionen in wässrigen Lösungen, die Carbamoyldonoren enthalten. Einfache Pfeile entsprechen schnellen Transformationen und gestrichelte Pfeile langsameren. Werte basieren auf Daten von equilibrator.weizmann.ac.il.

Dies ist ein einfaches Beispiel dafür, wie die Aufklärung der Reaktionsthermodynamik und -kinetik es ermöglicht, ein potenziell komplexes Netzwerk präbiotischer Reaktionswege zu beschneiden.

Wie bereits erwähnt, ist Siliciumdioxid bekanntermaßen eine gute Plattform für Kondensationsreaktionen zwischen Molekülen. Der Grund dafür ist zweifach. Erstens ermöglicht Kieselsäure aus thermodynamischer Sicht das Arbeiten unter Bedingungen geringer Wasseraktivität, indem einfach ein Trocknungsschritt durchgeführt wird. Da Wasser ein Produkt der Kondensationsreaktion ist, verschiebt seine kontinuierliche Entfernung die Kondensation nach dem Prinzip von Le Châtelier nach rechts, und dies gilt auch für jedes flüchtige Kondensationsprodukt. Daher könnte die Carbamoylierung durch alle von uns in Betracht gezogenen Wirkstoffe im Prinzip auf Siliciumdioxid vorteilhaft gestaltet werden (im Gegensatz zur Lösung, bei der nur einige Wirkstoffe zulässig sind). Es genügt eine gründliche Austrocknung der Oberfläche, was bei pyrogener Kieselsäure bei etwa 100 °C der Fall ist.

Zweitens katalysiert Siliciumdioxid aus kinetischer Sicht die nukleophile Addition, die den ersten Schritt der Kondensation darstellt. Obwohl die Komplexität dieses Phänomens eingehend untersucht wurde57, beruht der grundlegende Mechanismus wahrscheinlich auf schwach sauren Oberflächensilanolen, die die Abgangsgruppe aktivieren (Kieselsäure verhält sich wie eine schwache feste Brönsted-Säure), wie in Abb. 8a für die Asparaginsäure schematisch dargestellt /Carbaminsäurekondensation.

Silanol-unterstützte Katalyse der Carbamatkondensation (a) und der kompetitiven Hydrolyse (b) auf Silica.

Es ist ein Grundprinzip der Kinetik, dass alles, was eine Reaktion in Vorwärtsrichtung katalysiert, diese auch in Rückwärtsrichtung katalysiert. Wenn Kieselsäure beispielsweise eine Kondensation katalysiert, bei der ein Wassermolekül freigesetzt wird, katalysiert sie auch die Rückreaktion der Hydrolyse: Welche tatsächlich stattfindet, hängt von der Wasseraktivität im System ab. Tatsächlich können im vorliegenden Fall zusätzliche Wege für die Rückreaktion in Betracht gezogen werden, wie in Abb. 8b für die Hydrolyse von Carbaminsäure dargestellt.

Daher können wir verstehen, dass Carbamoylierungsreaktionen an Siliciumdioxid nicht beobachtet wurden. Alle Carbamoylierungsmittel enthalten bereits eine CN-Bindung, die normalerweise recht labil ist. Siliciumdioxid ist eigentlich ein zu guter Katalysator: Es aktiviert die CN-Bindung im Carbamoylierungsmittel bei niedrigen Temperaturen, bei denen noch reichlich Wasser an der Oberfläche vorhanden ist, und verursacht so dessen Hydrolyse, bevor es die Asparaginsäure funktionalisieren kann, eine Reaktion, die eine höhere Energie hat Barriere.

Carbamoylierungsszenarien, die Mineraloberflächen betreffen, sind nicht vollständig ausgeschlossen, da NCA bei (Cyanat + Aspartat) beobachtet wurde, das auf MgCO3 abgelagert war. Wir können daher sagen, dass welche katalytischen Stellen auch immer auf der MgCO3-Oberfläche vorhanden sind (es wäre zu erwarten, dass sie zumindest eine allgemeine Grundkatalyse zeigen), sie nicht in der Lage sind, Amidbindungen bei Raumtemperatur signifikant zu aktivieren. Sie könnten bei höheren Temperaturen immer noch die Kondensation aktivieren, da die NCA-Ausbeuten nach dem Erhitzen auf 150 °C etwas ansteigen, obwohl sie niedriger bleiben als die, die bei einer mineralfreien Reaktion erhalten werden. Andererseits führt übermäßiges Erhitzen innerhalb weniger Stunden zu einem Abbau des NCA-Produkts bei 230 °C: Dies stellt die Obergrenze des Temperaturbereichs dar, der für die Verwendung des präbiotischen Vorläufers NCA verfügbar ist.

In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass Cyanat unter den verschiedenen Carbamoyldonoren, die unter präbiotischen Bedingungen hätten vorhanden sein können, wahrscheinlich der effizienteste ist, um eine Aspartatcarbamoylierung durchzuführen. Diese Reaktion weist alle Merkmale einer „guten“ präbiotischen Reaktion auf und erfordert nur Vorläufer, von denen bekannt ist, dass sie präbiotisch gebildet werden.

Unsere Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, stets sowohl die thermodynamische als auch die kinetische Dimension potenzieller präbiotischer Reaktionen zu berücksichtigen. Aus thermodynamischer Sicht sollte Biuret beispielsweise hohe Carbamoylierungsausbeuten liefern, aber die Reaktionsgeschwindigkeit bei Raumtemperatur ist so niedrig, dass das entsprechende Szenario unwahrscheinlich erscheint. Auf die gleiche Weise führte die Eingabe chemischer Energie aus einem bekannten anorganischen Vorläufer, Trimetaphosphat, zu einer Energietransduktion – allerdings durch die Bildung eines Aspartatdimers und nicht des gewünschten Produkts, NCA. In diesem Fall wurde ein anderer Reaktionsweg eröffnet.

Während thermodynamische Daten zu vielen Biomolekülen und ihren Vorläufern häufig verfügbar sind, zumindest unter Standardbedingungen, sind kinetische Daten rar und die Reaktionskinetik muss systematisch bewertet werden.

Die Antwort auf die Frage, die zu Beginn dieser Studie gestellt wurde – ist die Aspartatcarbamoylierung ein wahrscheinlicher Schritt in der präbiotischen Pyrimidinsynthese? – ist eindeutig positiv, vorausgesetzt, dass Cyanat als Carbamoylierungsmittel verwendet wird. Somit ist die Hypothese der geochemischen Kontinuität nur teilweise bestätigt58. Während die Reaktion durchaus in präbiotischen Umgebungen hätte stattfinden können, wurde wahrscheinlich eher Cyanat als das Carbamoylierungsmittel der aktuellen Biochemie, Carbamoylphosphat, verwendet, das wahrscheinlich nicht leicht verfügbar war15.

Ein Szenario in der wässrigen Phase ist sehr wahrscheinlich. Mineralische Oberflächen können tatsächlich schädlich sein, wenn sie sauer sind, wie es bei Kieselsäure der Fall ist. Andererseits verhinderte das basische Hydromagnesit die Carbamoylierung durch Cyanat nicht, brachte aber auch keine klaren Vorteile. Sobald sich NCA jedoch gebildet hat, könnte die Ablagerung auf einer Mineraloberfläche es gegenüber der in Lösung befindlichen Spezies gegen thermischen Abbau stabilisieren. Diese Vielseitigkeit der Carbamoylierungsreaktion in wässriger Lösung/Mineraloberfläche könnte Teil eines primitiven Teichszenarios sein.

Während wir versuchen, den Orotat-Weg der vorhandenen Biochemie in einem geochemischen Kontext zu reproduzieren, möchten wir alternative Quellen für Orotat nicht ausschließen. Tatsächlich haben Krishnamurthy et al. haben ein anderes wässriges Eintopfszenario7 untersucht, bei dem Orotat aus Hydantoin und Glyoxylat gewonnen wird. Möglicherweise existierten einst mehrere Wege zu Orotat nebeneinander, wobei der aktuelle Weg irgendwann in der chemischen Evolution ausgewählt wurde.

In einem kommenden Artikel werden wir uns auf die Replikation des nächsten Schritts im Orotat-Weg konzentrieren, nämlich die NCA-Cyclisierung, da sie einen wichtigen metabolischen Knotenpunkt in der aktuellen Biochemie darstellt.

Die folgenden chemischen Verbindungen wurden von kommerziellen Lieferanten gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet: Ureidobernsteinsäure (Sigma-Aldrich Co., Kat.-Nr. 69037-500MG), Biuret (Sigma-Aldrich Co., Kat.-Nr. 15270-25G), L-Asparaginsäure-Hemimagnesiumsalz-Dihydrat (Sigma-Aldrich Co., Kat.-Nr. 11260-100G), L-Asparaginsäure (Sigma-Aldrich Co., Kat.-Nr. A8949-100G), basisches Magnesiumcarbonat (Sigma-Aldrich Co ., Kat.-Nr. 13118-1 KG) mit einer Brunauer-Emmett-Teller-Oberfläche von 31,5 m2/g, Natriumcyanat (Sigma-Aldrich Co., Kat.-Nr. 185086-100G), wasserfreie Natriumhydroxid-Pellets (Carlo Erba-Reagenzien, Kat.-Nr. 480507), Deuteriumoxid 99,90 % D (Eurisotop, Kat.-Nr. D214FE), lineares Dimer H-Asp-Asp-OH (Bachem, Kat.-Nr. 4010210.0250), Ammoniumcarbamat (Sigma-Aldrich Co., Kat.-Nr. 292834-100G), Ammoniak 28 % AnalaR Normapur (VWR Chemicals, Kat.-Nr. 21190.292), Trinatriumtrimetaphosphat (Sigma-Aldrich Co., Kat.-Nr. T5508-500G), Harnstoff-ACS-Reagenz (Sigma -Aldrich Co., Kat.-Nr. U5128-100G), Ammoniumcarbonat-ACS-Reagenz (Aldrich Chemical Company, Inc., Kat.-Nr. 20786-1), Carbamoylphosphat-Dinatriumsalz (Sigma-Aldrich Co., Kat.-Nr. C4135-1G), pyrogene Kieselsäure Aerosil 380 (Evonik Industries), mit einer Brunauer-Emmett-Teller-Oberfläche von 380 m2/g .

Die freien Gibbs-Energien von Reaktionen wurden mit dem eQuilibrator-Rechner59,60,61,62,63 unter http://equilibrator.weizmann.ac.il/ berechnet.

NMR-Experimente wurden auf einem Bruker Avance III 500-Spektrometer (ωL = 500,07 MHz für 1H und 125,74 MHz für 13C) durchgeführt, das mit einer 5 mm inversen Doppelresonanz-Breitbandsonde ausgestattet war. Chemische Verschiebungen wurden als δ-Werte (ppm) relativ zum TMS-Peak kalibriert, der auf δ = 0,00 ppm (13C-NMR) eingestellt war, und des restlichen leichten Wassers in D2O, eingestellt auf δ = 4,79 ppm (1H-NMR). Kopplungskonstanten werden in Hertz angegeben. Alle Spektren wurden mit den Softwareprogrammen Bruker TopSpin 4.0.6 und 4.0.8 verarbeitet. Die verwendeten 2D-Korrelationen waren die folgenden: 1H-1H COSY (COrlated SpectroscopY), 1H-13C HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) und 1H-13C HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation). Das verwendete DEPT 135-Experiment (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) liefert invertierte CH2- und C-Gruppen.

Die pH-Messungen wurden mit einem pH-Tischmessgerät Accumet AE150 von Fischer Scientific durchgeführt.

Ein kleiner Teil jeder Probe wurde geschliffen und auf einem bodenfreien Halter montiert. Die Röntgenpulverbeugungsdaten wurden bei Raumtemperatur mit einem D8 DISCOVER Bruker-Diffraktometer an der Sorbonne-Universität aufgezeichnet. Dieses Instrument ist mit einer Cu-Anodenquelle (Kα1- und Kα2-Kupferdublett) ausgestattet, die mit 40 kV und 30 mA betrieben wird, und einem LynxEye XE-T 1D-Detektor. Die Daten wurden von 5° bis 80° in 1 Stunde mit Schritten von 0,02° aufgezeichnet

L-Asparaginsäure (6,50 g, 50 mmol, 1 Äquivalent) und Natriumcyanat (3,21 g, 49 mmol, 1 Äquivalent) wurden in einer 1 M Natriumhydroxidlösung (50 ml) gelöst. Die resultierende Mischung wurde gerührt und 16 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann wurden Proben (400 µL in 200 µL D2O) für NMR-Analysen entnommen.

L-Asparaginsäure (6,50 g, 50 mmol, 1 Äquivalent) und Harnstoff (3,00 g, 50 mmol, 1 Äquivalent) wurden in einer 1 M Natriumhydroxidlösung (50 ml) gelöst. Die resultierende Mischung wurde gerührt und 16 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann wurden Proben (400 µL in 200 µL D2O) für NMR-Analysen entnommen.

L-Asparaginsäure (6,50 g, 50 mmol, 1 Äquivalent) und Biuret (5,08 g, 49 mmol, 1 Äquivalent) wurden in einer 1 M Natriumhydroxidlösung (50 ml) gelöst. Die resultierende Mischung wurde gerührt und 16 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann wurden Proben (400 µL in 200 µL D2O) für NMR-Analysen entnommen.

L-Asparaginsäure (173 mg, 1,3 mmol, 1 Äquivalent) und Ammoniumcarbamat (132 mg, 1,7 mmol, 1,3 Äquivalent) wurden in 2,5 ml einer Ammoniaklösung mit Phosphoramidaten gelöst (Probenahme nach 66 Stunden bei 70 °C). Zubereitung beschrieben in 15). Die Lösung wurde in einer luftdichten 25-ml-Flasche 16 Stunden lang in einem Ofen bei 100 °C gelagert. Für NMR-Analysen wurden 600 µL gesammelt.

Um organische Moleküle auf Mineralien abzuscheiden, verwendeten wir ein Benetzungs- und Trocknungsverfahren, das in der Literatur zur heterogenen Katalyse auch „Incipient Wetness Impregnation“ oder IWI genannt wird. Dabei wird eine Lösung, die einen Asp-Vorläufer und einen Carbamoyldonor enthält, mit einer mineralischen Oberfläche in Kontakt gebracht, um eine Paste oder Aufschlämmung zu erhalten. Während dieses Prozesses stehen solubilisierte organische Verbindungen in längerem Kontakt mit dem dispergierten Mineral und die Aufschlämmung wird anschließend bei Raumtemperatur getrocknet. Ähnliche Ereignisse könnten in einem geochemischen Szenario aufgrund klimatischer Schwankungen auftreten.

L-Asparaginsäure (20 mg, 0,13 mmol, 1 Äquivalent) und ein Carbamoyldonor* (0,20 mmol, 1,3 Äquivalent) wurden unter Rühren in 5 ml destilliertem Wasser gelöst. 500 mg Silica Aerosil wurden mit der Lösung imprägniert. Die resultierende Aufschlämmung wurde unter N2 getrocknet, bis ein trockenes Pulver erhalten wurde. Durch eine zusätzliche Behandlung im Exsikkator unter Vakuum wurden Wasserspuren entfernt. Das Pulver wurde gemahlen und für IR-Analysen beprobt. *Harnstoff (12 mg), Ammoniumcarbonat (19 mg), Ammoniumcarbamat (15 mg), Natriumcyanat (13 mg) oder Natriumcarbamoylphosphat (27 mg).

Magnesiumdiaspartat (24 mg, 0,074 mmol, 2 Äquivalente Asp) wurde unter Rühren in 6 ml destilliertem Wasser gelöst. 500 mg (5,9 mmol, 39 Äq.) Magnesiumcarbonat (5,9 mmol) wurden mit der Lösung imprägniert. Die resultierende Suspension wurde unter N2 getrocknet, bis ein trockenes Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde gemahlen und für XRD- und NMR-Analysen als Probe genommen (30 mg suspendiert in 600 µL D2O).

Asp-Asp-Dimer (24 mg, 0,15 mmol) wurde unter Rühren in 6 ml destilliertem Wasser gelöst. 500 mg Magnesiumcarbonat wurden mit der Lösung imprägniert. Die resultierende Suspension wurde unter N2 getrocknet, bis ein trockenes Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde gemahlen und für XRD- und NMR-Analysen als Probe genommen (30 mg suspendiert in 600 µL D2O).

Ureidobernsteinsäure (22 mg, 0,12 mmol) wurde unter Rühren in 6 ml destilliertem Wasser gelöst. 500 mg Magnesiumcarbonat (5,9 mmol) wurden mit der Lösung imprägniert. Die resultierende Suspension wurde unter N2 getrocknet, bis ein trockenes Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde gemahlen und für XRD- und NMR-Analysen als Probe genommen (30 mg suspendiert in 600 µL D2O).

Magnesiumdiaspartat (24 mg, 0,074 mmol, 2 Äquivalente Asp) und Natriumcyanat (13 mg, 0,20 mmol, 1,4 Äquivalente) wurden unter Rühren in 6 ml destilliertem Wasser gelöst. 500 mg (5,9 mmol, 39 Äq.) Magnesiumcarbonat (5,9 mmol) wurden mit der Lösung imprägniert. Die resultierende Suspension wurde unter N2 getrocknet, bis ein trockenes Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde gemahlen und zur thermischen Aktivierung beprobt. 10 mg des Pulvers wurden bei vier verschiedenen Temperaturen (150 °C, 200 °C und 230 °C) 30 Minuten lang in einem mit Trockenmitteln ausgestatteten Ofen thermisch aktiviert. Die Luftfeuchtigkeitsmessung bei 88 °C beträgt 3,5 % relative Luftfeuchtigkeit. Nach dem Abkühlen in einem Exsikkator unter reduziertem Druck wurden die Proben mittels NMR analysiert (10 mg suspendiert in 600 µL D2O).

Magnesiumdiaspartat (24 mg, 0,074 mmol, 2 Äquivalente Asp) und Biuret (21 mg, 0,20 mmol, 1,4 Äquivalente) wurden unter Rühren in 6 ml destilliertem Wasser gelöst. 500 mg (5,9 mmol, 39 Äq.) Magnesiumcarbonat (5,9 mmol) wurden mit der Lösung imprägniert. Die resultierende Suspension wurde unter N2 getrocknet, bis ein trockenes Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde gemahlen und zur thermischen Aktivierung beprobt. 10 mg des Pulvers wurden 30 Minuten lang bei 140 °C in einem mit Trockenmitteln gefüllten Ofen thermisch aktiviert. Die Luftfeuchtigkeitsmessung bei 88 °C beträgt 3,5 % relative Luftfeuchtigkeit. Nach dem Abkühlen in einem Exsikkator mit reduziertem Druck wurden die Proben mittels NMR analysiert (10 mg suspendiert in 600 µL D2O).

Die Autoren erklären, dass alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Papier und in den Zusatzinformationen verfügbar sind.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Baptiste Rigaud und Mohamed Selmane für ihre Hilfe bei NMR- und XRD-Messungen. Wir danken auch Brittany Foley für ihr sorgfältiges Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch das CNRS MIT-Programm „Origines 2020“ finanziert.

Surface Reactivity Laboratory (LRS, UMR 7197 CNRS), Universität Sorbonne, Case Courier 178, 4, Place Jussieu, 75005, Paris, Frankreich

Louis MP Ter-Ovanessian und Jean-François Lambert

Institut für Systematik, Evolution, Biodiversität (ISYEB, UMR7205 CNRS), Practical School of Advanced Studies, Nationalmuseum für Naturgeschichte, Universität Sorbonne, Universität der Antillen, CP 50, 57 rue Cuvier, 75005, Paris, Frankreich

Louis MP Ter-Ovanessian und Marie-Christine Maurel

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LTO plante die Experimente, bereitete die Proben vor, führte spektroskopische Analysen durch und verfasste den ersten Entwurf des Manuskripts. JFL und MCM überwachten die Arbeit und überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit Jean-François Lambert.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ter-Ovanessian, LMP, Lambert, JF. & Maurel, MC. Aufbau des Uracil-Gerüsts in primitiven Teichen am Ursprung des Lebens: Carbamoylierung von Asparaginsäure. Sci Rep 12, 19178 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21272-7

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Eingegangen: 18. Juli 2022

Angenommen: 26. September 2022

Veröffentlicht: 10. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21272-7

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