Anreicherung und Charakterisierung eines Stickoxids

Mar 06, 2024

Nature Microbiology Band 8, Seiten 1574–1586 (2023)Diesen Artikel zitieren

4305 Zugriffe

144 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein hochreaktives und klimaaktives Molekül und ein wichtiges Zwischenprodukt im mikrobiellen Stickstoffkreislauf. Trotz seiner Rolle bei der Entwicklung der Denitrifikation und der aeroben Atmung, seines hohen Redoxpotentials und seiner Fähigkeit, das mikrobielle Wachstum aufrechtzuerhalten, bleibt unser Verständnis von NO-reduzierenden Mikroorganismen aufgrund des Fehlens von NO-reduzierenden mikrobiellen Kulturen, die direkt aus der Umwelt unter Verwendung von NO als Stickstoff gewonnen werden, begrenzt Substrat. Hier haben wir mithilfe eines kontinuierlichen Bioreaktors und einer konstanten Versorgung mit NO als einzigem Elektronenakzeptor eine mikrobielle Gemeinschaft angereichert und charakterisiert, die von zwei bisher unbekannten Mikroorganismen dominiert wird, die bei nanomolaren NO-Konzentrationen wachsen und große Mengen (>6 µM) dieses giftigen Gases überleben , wodurch es zu N2 reduziert wird, wobei nur eine geringe bis nicht nachweisbare Produktion des Treibhausgases Lachgas entsteht. Diese Ergebnisse geben Einblick in die Physiologie von NO-reduzierenden Mikroorganismen, die eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle klimaaktiver Gase, der Abfallbeseitigung und der Entwicklung der Nitrat- und Sauerstoffatmung spielen.

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein stark oxidierendes Molekül mit wichtigen Funktionen in der Zellbiologie und Atmosphärenchemie. In der Atmosphäre trägt NO als Vorläufer des starken Treibhausgases Lachgas (N2O) zur Luftverschmutzung, zur Entstehung von saurem Regen und zum Abbau der Ozonschicht bei1,2. In der Zellbiologie diffundiert NO leicht durch Zellmembranen und reagiert schnell mit anderen freien Radikalen und Übergangsmetallen3, wodurch es für mikrobielles Leben äußerst toxisch wird4,5. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von NO machen es auch zu einem wertvollen Signalmolekül6 und zu einem wichtigen Zwischenprodukt beim Umsatz anorganischer Stickstoffspezies7, was unterstreicht, dass Mikroorganismen Strategien entwickelt haben, um NO nicht nur zu erkennen und zu entgiften, sondern es auch sehr effektiv zu veratmen5,8,9.

Tatsächlich war auf der frühen Erde, lange vor Beginn der sauerstoffhaltigen Photosynthese, durch Blitzschlag und Vulkanismus erzeugtes NO das stärkste Oxidationsmittel für Leben (\({E}_{0}^{{{\prime} }}\) = +1,173 V (NO/N2O)) (\({E}_{0}^{{{\prime} }}\, Standardmittelpunktpotential)10,11,12. Daher wird die Hypothese aufgestellt, dass NO vor dem Aufkommen der aeroben Atmung eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung eines bioenergetischen Signalwegs im Zusammenhang mit der modernen Denitrifikation spielte12, bei dem die NO-Reduktasen (NOR) der Vorfahren als Vorläufer für die später verwendeten terminalen Oxidasen dienten bei der aeroben Atmung13,14,15. Dies deutet darauf hin, dass sich schon früh in der Geschichte des Lebens auf unserem Planeten eine große Vielfalt an Mikroorganismen entwickelt haben muss, die in der Lage sind, Energie aus der NO-Reduktion zu gewinnen, unabhängig von deren Toxizität.

Im modernen Stickstoffkreislauf ist NO ein wichtiges Zwischenprodukt in den einzigen beiden Prozessen, die N2 in die Atmosphäre freisetzen: anaerobe Ammoniumoxidation (Anammox) und Denitrifikation7. Bei Anammox reduzieren Bakterien aus dem Stamm der Planctomycetes Nitrit (NO2−) zu NO, das dann verwendet wird, um Ammonium in Abwesenheit von Sauerstoff zu Hydrazin zu aktivieren16. Bei der Denitrifikation wird NO während der schrittweisen Reduktion von Nitrat (NO3−) zu N2 (NO3− → NO2− → NO → N2O → N2) durch eine große Vielfalt von Mikroorganismen umgewandelt, die im gesamten Lebensbaum weit verbreitet sind17. Im Gegensatz zu Anammox kann die Denitrifikation entweder einzeln durch einzelne Mikroorganismen oder alternativ durch Konsortien verschiedener Mikroorganismen durchgeführt werden, wobei jeder Mikroorganismus eine oder mehrere der unterschiedlichen N-Oxid-Reduktionsreaktionen durchführt (Gleichungen (1)–(4)). . Dementsprechend wurde eine Vielzahl von N-Oxid-reduzierenden Mikroorganismen unter Verwendung von NO3− und den Denitrifikationszwischenprodukten NO2− und N2O, jedoch nicht von NO 18,19, isoliert. Allerdings wurde ein mikrobielles Wachstum direkt auf diesem Substrat nachgewiesen; Beispielsweise wurde gezeigt, dass Anammox-Bakterien in Abwesenheit von NO2− direkt auf NO und Ammonium wachsen (Lit. 8), und es wurde vermutet, dass denitrifizierende Mikroorganismen ihre Biomasse erhöhen, wenn sie unter verschiedenen Bedingungen mit NO gefüttert werden20,21,22. Dennoch liegen nur wenige Informationen über das Wachstum denitrifizierender Mikroorganismen auf NO vor, und unser Wissen über die Physiologie der NO-Reduktion, sei es als eigenständige Reaktion oder als Teil des Denitrifikationsprozesses, basiert auf Kulturen, die nicht unter Verwendung von NO gewonnen wurden und dies typischerweise der Fall ist beschränkt sich auf die Hemmung und toxische Wirkung von NO auf Zellen5.

Hier haben wir NO erfolgreich als direkten Elektronenakzeptor für die Anreicherung von NO-reduzierenden Mikroorganismen in einem kontinuierlichen Bioreaktor eingesetzt. Die Anreicherungskultur, die hauptsächlich aus zwei bisher unbekannten Mitgliedern der betaproteobakteriellen Sterolibacteriaceae-Familie besteht, „Candidatus Nitricoxidivorans perseverans“ und „Candidatus Nitricoxidireducens bremensis“, wuchs durch NO-Reduktion zu N2 und Formiatoxidation, wobei es praktisch zu keiner Anreicherung von N2O kam. Die mikrobielle Wachstumskinetik der Anreicherungskultur und ihre Affinität für verschiedene N-Oxide wurden bestimmt. Parallel dazu wurden mithilfe von Metagenomik, Metatranskriptomik und Metaproteomik die biochemischen Reaktionen untersucht, die dem mikrobiellen Wachstum auf NO zugrunde liegen. Diese Studie zeigt, dass Mikroorganismen gedeihen und mit NO angereichert werden können, und bietet unerforschte Möglichkeiten zur Untersuchung des mikrobiellen Umsatzes an diesem hochenergetischen und klimaaktiven Molekül, das möglicherweise eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung der Denitrifikation und der aeroben Atmung gespielt hat.

Ein kontinuierlicher Bioreaktor wurde mit Biomasse aus einer kommunalen Kläranlage (Bremen, Deutschland) beimpft und kontinuierlich mit NO und Formiat als einzigem Elektronenakzeptor bzw. Elektronendonor gespeist. Der Bioreaktor wurde ständig mit Ar/CO2 gespült, um anoxische Bedingungen zu schaffen und die chemische Umwandlung von NO mit Sauerstoff zu verhindern8,23. 1.549 Tage lang wurde eine NO-reduzierende Kultur angereichert, während gleichzeitig NO in N2 umgewandelt und Formiat zu CO2 oxidiert wurde (Gleichung (5)). Die Aktivität und das Wachstum der Kultur wurden durch Messung der Zu- und Abflusskonzentrationen von NO, N2O, Formiat und des Gesamtproteingehalts überwacht (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1). \(\Delta {G}^{0{\prime} }\), Änderung der freien Gibbs-Energie unter biologischen Standardbedingungen.

N2O-Werte werden nur angezeigt, wenn die gemessene Konzentration über der Nachweisgrenze (10–25 ppm) lag. Formiat wurde als Reduktionsmittel zur Energieeinsparung und Kohlenstoffquelle für das Biomassewachstum bereitgestellt.

Quelldaten

Die Zellen in der Anreicherung waren überwiegend freilebend und wurden zunächst mithilfe eines Membranfilters im Bioreaktor zurückgehalten. Nach 331 Tagen zeigte die Kultur einen konstanten Substratverbrauch (Abb. 1) und die Membran wurde entfernt. Anschließend wurden die Zellen mit einer Verdünnungsrate von ~0,104 pro Tag ausgewaschen, was einer Verdopplungszeit von 6,65 Tagen entspricht. NO wurde mit einer Rate von 1,69 (± 0,1; n = 248) mmol pro Tag (20,93 ± 5,1 µmol pro mg Protein pro Tag; n = 175) reduziert und Formiat wurde mit einer Rate von 2,38 (± 0,2; n = 231) verbraucht ) mmol pro Tag (29,01 ± 6,3 µmol pro mg Protein pro Tag; n = 165). Da NO im Vergleich zu Formiat im Überschuss zugeführt wurde, verblieben immer 700–1.000 ppm NO im Kopfraum des Bioreaktors, was 1,5–2,1 µM gelöstem NO (bei 20,5 °C) entspricht. Das direkte Produkt der NO-Reduktion, N2O (Gleichung (3)), war entweder nicht nachweisbar (unterhalb der Nachweisgrenze (10–25 ppm); n = 96) oder wurde nur im Kopfraum in geringen Konzentrationen nachgewiesen (39,58 ± 20,5 ppm; n =). 128), was darauf hinweist, dass höchstens ~2,8 % des umgewandelten NO als N2O nachgewiesen werden konnten, was auf einen hocheffizienten Umsatz von N2O zu N2 schließen lässt (Gleichung (4)). Die beobachtete NO- und N2O-reduzierende Aktivität zusammen mit dem kontinuierlichen Wachstum der Kultur deutete darauf hin, dass die Anreicherungskultur durch NO-Reduktion zu N2 gekoppelt mit der Oxidation von Formiat wuchs.

Um den Nettobiomasseertrag zu ermitteln, führten wir einen 10-tägigen Versuch im Bioreaktor durch, bei dem Formiatverbrauch, NO-Reduktion und Biomasseproduktion gemessen wurden. Während dieses Zeitraums wurde NO um 1,57 (±0,02; n = 6) mmol NO pro Tag reduziert und Formiat wurde mit 2,44 (±0,06; n = 6) mmol Formiat pro Tag verbraucht, was nahezu identisch mit den während der Routine beobachteten Raten ist Bioreaktorbetrieb. Biomasse wurde mit einer Rate von 0,48 (±0,02; n = 6) mmol C in der Biomasse (C-mmol-Biomasse) pro Tag produziert, was einem Nettoertrag von 0,20 (±0,01; n = 6) C-mmol-Biomasse entsprach pro mmol Formiat.

Insgesamt betrug während des 10-tägigen Experiments das Verhältnis von NO-Reduktion zu Formiatverbrauch 1:1,56 (±0,02; n = 6). Basierend auf der erwarteten Stöchiometrie der NO-Reduktion gekoppelt mit der Formiatoxidation (1:1; Gleichung (5)) konnten 64 % des Formiatverbrauchs mit der NO-Reduktion in Verbindung gebracht werden, wohingegen die Assimilation von Formiat in Biomasse weitere 20 % ausmachte. Die verbleibenden 16 % des verbrauchten Formiats, die weder mit der NO-Reduktion noch mit der Biomasseassimilation in Verbindung gebracht werden konnten, werden vorläufig durch Zellzerfall und Freisetzung von gelöstem organischem Kohlenstoff erklärt, möglicherweise in Form von Zwischenprodukten und Stoffwechselabfällen.

Scheinbare Halbsättigungskoeffizienten (Km(app)), maximale Reduktionsraten (Vmax) und der Substrathemmkoeffizient (Ki; nur für NO) der Anreicherungskultur wurden für NO3−, NO2−, NO und N2O mithilfe von Batch-Inkubationen bestimmt ( Tabelle 1 und ergänzende Abbildung 2).

In allen Experimenten war die Anreicherungskultur sofort nach Substratzugabe aktiv. Von den vier getesteten Substraten wurde eine Substrathemmung nur für NO beobachtet, wenn auch bei einem relativ hohen Ki von 1,69–2,05 µM. NO war auch das Substrat, für das die Anreicherungskultur die höchste Affinität zeigte (Km(app) von 153–181 nM). Verglichen mit der Affinität der wenigen untersuchten denitrifizierenden Mikroorganismen für NO (im Allgemeinen mit Km-Werten <10 nm)5,24,25,26 war die Affinität der Anreicherungskultur jedoch eher gering, was mit den Anreicherungsbedingungen von übereinstimmte diese Mikroorganismen mit überschüssigem NO.

Die Affinitätswerte der Anreicherungskultur für NO3−, NO2− und N2O waren einander ähnlich und vergleichbar mit denen, die für denitrifizierende und N-oxidreduzierende Mikroorganismen berichtet wurden26,27,28,29,30,31,32,33. Die hohe Affinität der Anreicherung für N2O stimmte mit der effizienten Umwandlung von N2O zu N2 und dessen Abwesenheit oder vorübergehender Anreicherung im Bioreaktor bei sehr niedrigen Konzentrationen überein.

Um die Gemeinschaftszusammensetzung und das Stoffwechselpotenzial der NO-reduzierenden Anreicherungskultur zu untersuchen, wurde die Gesamt-DNA zu zwei verschiedenen Zeitpunkten (Tag 497 und Tag 1.269; Ergänzungstabelle 1) extrahiert und sequenziert. Metagenomische Lesevorgänge wurden zusammengestellt und in metagenomisch zusammengesetzte Genome (MAGs) eingeteilt, die mit Anmerkungen versehen und taxonomisch klassifiziert wurden. Aus der metagenomischen Probe vom Tag 1.269 erhielten wir 12 hochgradig vollständige MAGs (<3 % Kontamination und > 92 % Vollständigkeit) aus verschiedenen Bakterienstämmen (Tabelle 2 und Ergänzungstabelle 2), die ~ 85 % der mikrobiellen Gemeinschaft in der Anreicherungskultur repräsentierten ( angenähert durch den Anteil der metagenomischen Lesezuordnung). Fünf MAGs enthielten Gene, die für NOR- und N2O-Reduktasen (NOS) kodierten, die notwendig sind, um NO zu N2 zu reduzieren (Gleichungen (3) und (4)). Zwei MAGs kodierten nur NOS, was darauf hindeutet, dass diese Organismen NO nicht als Elektronenakzeptor verwendeten und stattdessen N2O reduzierten, das von anderen Zellen freigesetzt werden könnte. Die fünf verbleibenden MAGs enthielten kein NOR oder NOS.

Die beiden MAGs mit der höchsten relativen Häufigkeit im Metagenom, MAG1 und MAG5, entsprachen der Sterolibacteriaceae-Familie der Betaproteobakterien und enthielten die für NOR und NOS kodierenden Gene. Die Taxonomie dieser beiden MAGs wurde weiter untersucht, indem Tools zur Klassifizierung des gesamten Genoms mit Analysen der 16S-ribosomalen RNA (rRNA), der durchschnittlichen Nukleotididentität (ANI; Ergänzungstabelle 3) und der durchschnittlichen Aminosäureidentität (AAI; Ergänzungstabelle 4) kombiniert wurden (Details). beschrieben in den Zusatzinformationen). Diese Analysen zeigten, dass MAG1 und MAG5 bisher unbekannten Gattungen innerhalb der Familie der Sterolibacteriaceae entsprachen (Abb. 2 und ergänzende Abb. 3). Daher wurden MAG1 und MAG5 Ca genannt. Nitricoxidivorans perseverans gen. Nov., sp. Nov. und Ca. Nitricoxidireducens bremensis gen. Nov., sp. Nov. bzw.

Genome von kultivierten Vertretern der Familie der Sterolibacteriaceae und MAGs von nicht kultivierten Organismen, die eng mit Ca verwandt sind. Nitricoxidivorans perseverans (MAG1) und Ca. Nitricoxidireducens bremensis (MAG5) wurden von GTDB und NCBI erhalten. Die in dieser Studie gewonnenen Organismen sind fett markiert. Die Gattung Thauera (GCF_001696715, GCF_002245655, GCF_001051995, GCF_000443165, GCF_001591165, GCF_000310205, GCF_003030465, GCF_001922305, GCF_00031018 5 und GCF_000310225) wurde als Außengruppe verwendet. Der Baum wurde basierend auf der maximalen Wahrscheinlichkeit (1.000 Iterationen) mithilfe von IQ-TREE berechnet. An den Zweigknoten werden ultraschnelle Bootstrap-Werte96 über 95 % angezeigt. Der Maßstabsbalken zeigt 0,1 geschätzte Substitutionen pro Standort an. Der Satz bakterieller Einzelkopie-Markergene ist gemäß Lit. 76.

Die Fülle von Ca. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis im Inokulum und in der Anreicherungskultur wurde mithilfe der katalysierten Reporterablagerungs-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (CARD-FISH) mit separaten Oligonukleotidsonden bestimmt. Während Ca. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis machte in der Kläranlage (Ergänzungsabbildung 4) weniger als 1 % der Population aus, in der Anreicherungskultur ca. Nitricoxidireducens bremensis machte 13,66 % (±1,6 %) der Population aus und Ca. Nitricoxidivorans perseverans wurde mit einer relativen Häufigkeit von 81,01 % (±3,5 %) zur dominierenden Art (Abb. 3).

Doppeltes CARD-FISH wurde mit den Sonden Nper205 und Nbre448 durchgeführt, um auf Ca-Zellen abzuzielen. Nitricoxidivorans perseverans (grün) und Ca. Nitricoxidireducens bremensis (rosa), gefolgt von einer DAPI-Färbung aller Zellen (blau). Die Zellzählungen wurden in dreifachen Filterstücken aus CARD-FISH- und DAPI-Zählungen (n ≥ 1.000) durchgeführt. Maßstabsbalken, 10 µm.

Um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der NO- und N2O-reduzierenden Aktivität der Anreicherungskultur zugrunde liegen, wurden die MAGs von Ca. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis sowie das Metatranskriptom und Metaproteom wurden nach NOR und NOS und zugehörigen Proteinen untersucht.

Um NO zu reduzieren, werden sowohl Ca. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis verwendete eine Cytochrom-c-abhängige NO-Reduktase (ergänzende Abbildungen 5 und 6), da sie die katalytischen Gene norC und norB sowie alle akzessorischen Gene kodierte und transkribierte (Tabelle 3). NorB beider Organismen und NorC von Ca. Nitricoxidivorans perseverans wurden zusammen mit anderen im Nor-Gencluster kodierten Proteinen ebenfalls aus dem Metaproteom gewonnen (Tabelle 3 und Ergänzungstabellen 5 und 6). Das direkte Produkt der NO-Reduktion, N2O, wurde durch Ca reduziert. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis unter Verwendung von NOS der Klasse II (ergänzende Abbildung 7), die häufig eine höhere Affinität für N2O als NOS der Klasse I aufweisen, was mit den im Bioreaktor nachgewiesenen geringen N2O-Konzentrationen übereinstimmt34,35,36,37. Interessanterweise kodierten beide Organismen doppelte Kopien von nosZ-Genen, die untereinander identisch waren (das heißt, mit Ausnahme der nosZ-Kopien in Ca. Nitricoxidireducens bremensis, die sich in der Länge um ein Lysin unterschieden), was unseren Analysen der Genom-Taxonomie-Datenbank zufolge (GTDB) und Genomes from Earth's Microbiomes (GEM)-Datenbanken ist ein ungewöhnliches Merkmal von nur ~3,4 % der NOS-kodierenden Mikroorganismen, was auf die Bedeutung der N2O-Reduktion in Ca hinweist. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis. Alle Gene aus dem NOS-Cluster wurden im Metatranskriptom beider Mikroorganismen nachgewiesen (Tabelle 3 und Ergänzungstabellen 5 und 6). Darüber hinaus stammen fast alle NOS-Proteine ​​aus Ca. Nitricoxidivorans perseverans wurde im Metaproteom nachgewiesen, wohingegen nur die katalytische Untereinheit NosZ von Ca. Nitricoxidireducens bremensis konnte geborgen werden, wahrscheinlich aufgrund seiner viel geringeren Häufigkeit in der Anreicherungskultur.

Die unmittelbare Aktivität der Anreicherungskultur während Substrataffinitätstests mit NO3− und NO2− veranlasste uns, das Metagenom, Metatranskriptom und Metaproteom für von Ca kodierte NO2−- und NO3−-Reduktasen zu untersuchen. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis. Beide Mikroorganismen enthielten zwei Kopien der Cytochrom-cd1-Typ-NO2−-Reduktase nirS und, während Ca. Nitricoxidivorans perseverans trug sowohl periplasmatische (napAB) als auch membrangebundene NO3−-Reduktasen (narGHI), Ca. Nitricoxidireducens bremensis kodierte nur eine periplasmatische NO3−-Reduktase. Darüber hinaus wurden alle diese Gene zusammen mit den erforderlichen Chaperonen und Transportern im Metatranskriptom und mit einigen Ausnahmen im Metaproteom nachgewiesen (Tabelle 3 und Ergänzungstabellen 5 und 6).

Da Formiat der einzige Elektronendonor war, der der Anreicherungskultur zugeführt wurde, wurde vorhergesagt, dass Ca. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis würde die Reduktion von NO an die Formiatoxidation koppeln. Demnach wurden im Genom von Ca die drei Untereinheiten einer Selenocystein-haltigen Formiatdehydrogenase (FDH) vom N- oder O-Typ gefunden. Nitricoxidireducens bremensis (OEL88_12710, OEL88_12715 und OEL88_12720) und im Metatranskriptom und Metaproteom der Anreicherungskultur (Ergänzungstabelle 6). Überraschenderweise ist das Genom des dominanten Mikroorganismus Ca. Nitricoxidivorans perseverans enthielt kein eindeutig identifizierbares FDH. Da aufgrund unserer Analysen vorhergesagt wurde, dass sein Genom geschlossen ist, ist es unwahrscheinlich, dass bekannte FDHs übersehen wurden. Stattdessen Ca. Nitricoxidivorans perseverans könnte ein bisher unbekanntes FDH oder ein Enzym mit unbekannter, unkonventioneller Formiatoxidationsaktivität verwendet haben. Alternativ könnten andere Elektronendonoren verwendet worden sein, die der Anreicherungskultur nicht extern zur Verfügung gestellt wurden, sondern als metabolische Zwischenprodukte verfügbar gemacht wurden, die möglicherweise von anderen Mikroorganismen in der Anreicherung freigesetzt wurden.

Um Formiat als einzige Kohlenstoffquelle direkt zu assimilieren, ist Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase (FTL) für den ersten Schritt jedes derzeit bekannten Formiat-Assimilationswegs erforderlich38. Obwohl etwa 20 % des von der Anreicherungskultur verbrauchten Formiats der Kohlenstoffassimilation zugeschrieben wurden, konnten in den Genomen von Ca keine Gene gefunden werden, die für FTL kodieren. Nitricoxidivorans perseverans oder Ca. Nitricoxidireducens bremensis. Andere an Formiat-Fixierungsreaktionen beteiligte Enzyme wie Pyruvat-Formiat-Lyase, Laktat-Aldolase und 2-Ketobutyrat-Formiat-Lyase38 wurden ebenfalls nicht gefunden. Formiat verbrauchende Mikroorganismen nutzen oft nur Formiat als Energiequelle und beziehen ihren Kohlenstoff stattdessen durch CO2-Fixierung39,40; daher ist es denkbar, dass Ca. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis nutzte das im Bioreaktor verfügbare CO2 für die Zellkohlenstoffassimilation, während andere Mikroorganismen in der Anreicherungskultur Formiat verwendeten. Tatsächlich transkribierten beide Organismen alle Enzyme für den gesamten Calvin-Benson-Bassham-Zyklus (CBB) (Ergänzungstabellen 5 und 6), mit Ausnahme von Sedoheptulose-1,7-bisphosphat-Aldolase und Sedoheptulose-1,7-bisphosphat-Phosphatase, die fehlten ihre Genome, deren Funktionen jedoch durch Fructose-1,6-Bisphosphat-Aldolase und Fructose-1,6-Bisphosphat-Phosphatase41,42,43,44 ausgeführt werden könnten. Alle Enzyme des CBB-Zyklus entsprechen Ca. Nitricoxidivorans perseverans wurden auch im Metaproteom nachgewiesen, während einige von denen aus Ca. Nitricoxidireducens bremensis fehlten.

In denitrifizierenden Mikroorganismen werden Elektronen, die aus der Oxidation organischer oder anorganischer Substrate stammen, über eine Elektronentransportkette auf die verschiedenen N-Oxid-Reduktasen übertragen45. Ca. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis besaß die Gene für eine NADH-Chinon-Oxidoreduktase (Komplex I), eine Succinat-Dehydrogenase (Komplex II), mehrere C-Typ-Cytochrome, zwei verschiedene Häm-Kupfer-Cytochrom-C-Oxidasen (einschließlich des hochaffinen cbb3-Typs; Komplex IV) und eine H+/Na+-transportierende ATPase vom F-Typ (Komplex V) (Ergänzungstabellen 5 und 6). Ca. Nitricoxidireducens bremensis kodierte auch für einen Cytochrom-bc1-Komplex (Komplex III), der letztlich zur Übertragung der Elektronen auf NIR, NOR und NOS dient. Ca. Nitricoxidivorans perseverans enthielt jedoch weder die Gene für Cytochrom bc1 noch seine Alternativen Cytochrom b6f oder den alternativen Komplex III (ACIII)46. Wir vermuten Ca. Nitricoxidivorans perseverans könnte Komplex III vollständig umgehen und einen anderen Mechanismus verwenden, um Elektronen aus dem Chinonpool auf NOR und NOS zu übertragen, wie dies bei anderen denitrifizierenden Mikroorganismen beobachtet wurde47,48.

Darüber hinaus ca. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis präsentierte alternative Stoffwechselwege und das Potenzial für Chemolithotrophie durch die Oxidation von Wasserstoff und reduzierten Schwefelverbindungen (Ergänzende Informationen und ergänzende Tabellen 5 und 6).

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Kultivierung und Anreicherung von Mikroorganismen direkt unter Verwendung von exogenem NO als einzigem Elektronenakzeptor eine erfolgreiche Strategie zur Gewinnung von NO-reduzierenden Mikroorganismen und zur Untersuchung ihrer Physiologie ist. Die kontinuierliche Kultivierung mit überschüssigem NO und begrenzten Mengen an Formiat führte zur Anreicherung von zwei bisher unbekannten Arten, die zur relativ wenig untersuchten Familie der Sterolibacteriaceae gehören, wobei über 81 % der Zellen in der Kultur Ca entsprachen. Nitricoxidivorans perseverans und ~14 % zu Ca. Nitricoxidireducens bremensis.

Die Anreicherungskultur wandelte NO nahezu ohne Anreicherung des Zwischenprodukts N2O in N2 um und konnte sofort NO3− und NO2− verbrauchen, was darauf hindeutet, dass die Kultur die Fähigkeit zur vollständigen Denitrifikation besaß. Nachfolgende (meta)omische Analysen ergaben, dass sowohl Ca. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis nutzte Cytochrom-c-abhängige NO-Reduktasen (NorBC) und Clade-II-NosZ, um NO zu N2 zu reduzieren, und verfügte über die enzymatische Maschinerie, die zur Durchführung des vollständigen Denitrifikationsprozesses erforderlich war. Darüber hinaus exprimierten diese Organismen NO3- und NO2-Reduktasen in Abwesenheit dieser Substrate, selbst wenn nur NO und N2O vorhanden waren. Mehrere Studien haben berichtet, dass die Transkription von NIR und NOR co-reguliert ist49,50; Der Nachweis der NO3−-Reduktase-Expression während des Wachstums mit NO in Abwesenheit von NO3− ist jedoch eine seltene und interessante Beobachtung47. Es wird angenommen, dass NO3−-Reduktasen in Modellmikroorganismen durch die Anwesenheit von NO3− oder im Fall von NAP durch Bedingungen mit niedrigem Sauerstoffgehalt induziert werden51,52,53. Dennoch ist es denkbar, dass NO an der Regulierung aller vorgeschalteten N-Oxid-reduzierenden Proteine ​​in einer bisher unerkannten Vielfalt von Mikroorganismen beteiligt sein könnte, was darauf hindeutet, dass die Regulierung der N-Oxid-Reduktion komplexer ist als bisher angenommen.

Von den vier N-Oxiden hatte die Anreicherungskultur die höchste Affinität zu NO. Interessanterweise wurde bei mikromolaren NO-Konzentrationen, die für andere denitrifizierende Mikroorganismen toxisch sind, die NO-reduzierende Aktivität der Anreicherungskultur nur teilweise gehemmt (~40 % bei 6,6 µM; ergänzende Abbildung 2). Diese Beobachtungen stimmten mit den Bedingungen des im Bioreaktor vorhandenen überschüssigen NO (1,5–2,1 µM) überein und zeigten, dass die angereicherten Mikroorganismen nicht nur bei nanomolaren NO-Konzentrationen wachsen konnten, sondern auch bei hohen Konzentrationen dieses giftigen und klimaaktiven Gases bestehen blieben .

Während klar war, dass beide angereicherten Mikroorganismen NO und N2O als Elektronenakzeptoren verwendeten, war es nicht einfach, ihre Strategie zur Gewinnung von Reduktionsäquivalenten und zur Gewinnung von Zellkohlenstoff zu entschlüsseln. Während der über 1.500-tägigen Inkubationszeit wurden etwa 60 % des Formiats durch die Anreicherungskultur gekoppelt mit NO- und N2O-Reduktion oxidiert und etwa 20 % in der Biomasse fixiert. Allerdings konnte im dominanten Mikroorganismus Ca kein FDH gefunden werden. Nitricoxidivorans perseverans. Es ist möglich, dass Ca. Nitricoxidireducens bremensis oder andere Mikroorganismen in der Anreicherungskultur fixierten Formiat in komplexere Kohlenstoffverbindungen, die in die Anreicherungskultur freigesetzt und anschließend durch Ca oxidiert wurden. Nitricoxidivorans perseverans. Allerdings ist die Dominanz von Ca. Nitricoxidivorans perseverans im Bioreaktor legt nahe, dass dieser Mikroorganismus Formiat direkt mithilfe einer noch unbekannten FDH oder eines Proteins mit bisher nicht charakterisierter Formiat-oxidierender Aktivität oxidierte, möglicherweise einem anderen Molybdopterin-haltigen Protein wie einer der stark exprimierten NO3−-Reduktasen. Basierend auf dem Fehlen von Schlüsselproteinen, die in bekannten Formiatassimilierungswegen38 aus den MAGs von Ca erforderlich sind. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Bei Nitricoxidireducens bremensis nutzte keiner der Organismen Formiat als Kohlenstoffquelle, sondern fixierte CO2 über den CBB-Weg. Es ist wahrscheinlich, dass Ca. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis optimierten ihre Zellaktivität im Hinblick auf Energieeinsparung, indem sie die meisten verfügbaren organischen Elektronendonoren, die in der Anreicherungskultur begrenzt sind, oxidierten und überschüssiges CO2 als Kohlenstoffquelle nutzten.

Die Untersuchung von nur zwei Mikroorganismen, die mit NO angereichert wurden, ermöglichte es uns, Einblicke in die mikrobielle Atmung dieses hochreaktiven Gases und die Mechanismen zu gewinnen, die diese Organismen zur Regulierung ihrer Atmungsketten und zur Aufnahme von Zellkohlenstoff verwenden, von denen einige nicht mit dem übereinstimmten wurde durch die Untersuchung von Modellorganismen entdeckt und verdeutlicht die Grenzen von Stoffwechselvorhersagen, die auf Genomanalysen basieren. Derzeit ist der Beitrag von Mikroorganismen, die in einem weiten Bereich von NO-Konzentrationen wachsen können, zum Stickstoffkreislauf in natürlichen und technischen Umgebungen unbekannt. Dennoch lässt sich spekulieren, dass sich diese Mikroorganismen möglicherweise von den von anderen Mikroorganismen freigesetzten NO und N2O ernähren, nitrosativen Stress abbauen und dazu beitragen könnten, den Ausstoß dieser klimaaktiven Gase in die Atmosphäre zu minimieren. Solche Eigenschaften könnten auch für die mögliche Anwendung von NO- und N2O-reduzierenden Mikroorganismen bei der biologischen NOx-Entfernung aus Abwasser und Abgasströmen von entscheidender Bedeutung sein. Letztendlich wird uns die Untersuchung der physiologischen und biochemischen Eigenschaften von NO-atmenden Mikroorganismen aus verschiedenen Umgebungen ermöglichen, die mikrobielle Kontrolle des NO- und N2O-Umsatzes besser zu verstehen.

Schließlich wird die Kultivierung und Anreicherung von noch mehr NO-atmenden Mikroorganismen, potenziellen NO-Konvertern, denen eines oder mehrere der anderen N-Oxid-reduzierenden Enzyme fehlen, oder solchen, die noch unbekannte NO-Reduktasen kodieren, weiteres Licht auf die Entwicklung werfen von aeroben und N-Oxid-Atmungswegen und daran beteiligten Enzymen und deckt sogar biochemische Wege auf, die es Mikroorganismen ermöglichen, mit der aus NO-Umwandlungen gewonnenen Energie zu wachsen.

Ein kontinuierlicher Bioreaktor (Arbeitsvolumen 2,4 l; Applikon Biotechnology) wurde mit Biomasse (15 % v/v) aus dem Stickstoffentfernungsbecken der kommunalen Kläranlage (hanseWasser Bremen) beimpft. Unmittelbar nach der Beimpfung wurde NO (10 % N25 in He N46; Air Liquide) als einziger Elektronenakzeptor durch die Gasphase mit einer Durchflussrate von 0,3 ml min−1 verdünnt in Ar/CO2 (Ar 95 % N50) in den Bioreaktor eingeleitet , CO2 5 % N55; Air Liquide) mit einer Durchflussrate von 19,7 ml min−1, um eine NO-Einflusskonzentration von ~2.200 ppm zu erreichen und den Bioreaktor anoxisch zu halten. Die Kultur wurde kontinuierlich mit zwei Standardturbinen bei 500 U/min gerührt. Der Bioreaktor wurde in einem temperierten Raum bei 20 ± 2 °C aufbewahrt. Der pH-Wert der Kultur wurde mit einer pH-Elektrode (Applikon Biotechnology) überwacht und mit 1 M NaHCO3 automatisch bei ~7,3 gehalten. Die Kultur wurde kontinuierlich mit Mineralmedium versorgt, das 1 mM Ammonium als Stickstoffquelle und die folgenden Nährstoffe pro Liter enthielt: 150 mg CaCl2⋅2H2O, 100 mg MgSO4⋅7H2O, 50 mg KH2PO4, 0,5 ml Fe-Lösung (10,32 g NTA und 4,72 g FeSO4⋅7H2O pro Liter) und 0,5 ml Spurenelementlösung (30 g NTA, 207 mg MnCl2⋅ 4H2O, 115 mg CoCl2⋅6H2O, 250 mg ZnSO4⋅7H2O, 1,5 g CuSO4, 36 mg NaWO4⋅2H2O, 50 mg NaMoO4⋅2H2O , 192 mg NiCl2⋅6H2O, 28 mg SeO2, 150 mg CeCl3 und 30 mg H3BO3 pro Liter). Als einziger Elektronendonor wurde dem einströmenden Medium Formiat zugesetzt und seine Konzentration im Medium entsprechend seinem Verbrauch in der Kultur angepasst. Die Formiatkonzentration im Bioreaktor lag immer unter der Nachweisgrenze (<50 µm), mit Ausnahme von Störungen in der Anreicherungskultur (z. B. Reinigung des Bioreaktors). Zunächst wurde das Medium mit einer Durchflussrate von 130 ml pro Tag zugeführt und die Biomasse wurde mit einem speziell angefertigten Membranfilter (Porengröße 0,2 µm) im Bioreaktor zurückgehalten. Die Formiatkonzentration wurde in diesem Zeitraum schrittweise von 1 mM auf 20 mM erhöht. Am Tag 331 wurde der Membranfilter entfernt, der Bioreaktor in einen Chemostat umgewandelt und die mittlere Durchflussrate auf 250 ml pro Tag erhöht. Die Formiatkonzentration im Zuflussmedium wurde dann auf 10 mM eingestellt. Die einzigen für die Kohlenstoffassimilation bereitgestellten Kohlenstoffquellen waren Formiat, Bicarbonat im pH-Puffer und CO2 im einströmenden Gasgemisch. Die Aktivität und das Wachstum der Kultur wurden überwacht, indem zweimal pro Woche Proben aus der Flüssigkultur und dem Zuflussmedium entnommen wurden, um die Formiat- und Proteinkonzentrationen zu bestimmen, sowie aus den Zufluss- und Abgasen, um die NO- und N2O-Konzentrationen zu messen. Proben für Formiatmessungen wurden 15 Minuten lang bei 21.000 g zentrifugiert und die Überstände bis zur Analyse bei –20 °C gelagert. Proben für Proteinmessungen wurden nach der Probenahme direkt bei –20 °C gelagert. Alle Geschwindigkeitsberechnungen und Darstellungen im Zusammenhang mit der Aktivität der Anreicherungskultur im Bioreaktor wurden mit MATLAB R2019a (MathWorks) durchgeführt.

Die N2O-Konzentrationen im Abgasstrom und zunächst die NO-Konzentrationen in den Zu- und Abgasströmen wurden mit einem 7890B-Gaschromatographiesystem bestimmt, das mit einer PoraPlot Q-Säule (Agilent Technologies) ausgestattet war und an ein Quadrupol-GAM 2000-Massenspektrometer mit Sekundärelektronen gekoppelt war Multiplikator (InProcess Instruments). Ab Tag 269 wurden die NO-Konzentrationen durch Online-Messungen mit einem nCLD 82 NOx-Analysator (Eco Physics) mit einer Nachweisgrenze für NO von 0,1 ppm bestimmt. NO- und N2O-Konzentrationen im Kopfraum von Batch-Inkubationen, die während NO- und N2O-Affinitätstests verwendet wurden, wurden durch Injektion von Gasproben entweder in den NOx-Analysator oder in ein 7890A-Gaschromatographiesystem (Agilent Technologies) gemessen, das mit einer CP-PoraPlot Q-Säule und einem Mikro ausgestattet war -Elektroneneinfangdetektor (µECD). Die Formiatkonzentrationen wurden durch Ionenchromatographie unter Verwendung eines 930 Compact IC Flex bestimmt, der mit einer Metrosep A Supp 5–250/4.0-Säule (Metrohm) ausgestattet war. Bis zum Tag 616 wurden die Proteinkonzentrationen in der Anreicherungskultur mithilfe eines Proteinassays (Bio-Rad) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert; Nach Tag 616 wurden die Proteinkonzentrationen spektrophotometrisch aus lysierten Zellen (1 mM NaOH, 10 Minuten bei 95 °C inkubiert) unter Verwendung der BCA-Methode (Micro BCA Protein Assay Kit; Thermo Fisher) quantifiziert. Die NO3- und NO2-Konzentrationen in Batch-Inkubationen, die während der NO3- und NO2-Affinitätstests verwendet wurden, wurden nach einer angepassten Griess-Methode gemessen55,56.

Die Affinitäten der Anreicherungskultur für NO3−, NO2−, NO und N2O wurden mittels Batch-Inkubationen bestimmt. Für jede Ausgangskonzentration jedes Substrats wurden doppelte Batch-Inkubationen mit 8–20 ml aus dem Bioreaktor gesammelter Biomasse gestartet. Serumfläschchen mit 20 ml, 40 ml oder 60 ml wurden mit Butylgummistopfen und Aluminiumkappen verschlossen und mit Ar/CO2 (95:5) gespült, um Luft zu entfernen. Die Biomasse wurde nicht gewaschen, um einen Aktivitätsverlust zu vermeiden, und wurde entweder unverdünnt oder nach Verdünnung mit filtersterilisiertem, verbrauchtem Mineralmedium in die Fläschchen gegeben. Beimpfte Fläschchen wurden erneut mit Ar/CO2 (95:5) gespült und ein Überdruck von 200 mbar aufgebaut. Der pH-Wert wurde mit anoxischem 1 M NaHCO3 auf ~7,3 eingestellt. Als Elektronendonor für die Reduktionsreaktionen wurde Formiat im Überschuss zugesetzt. NO2– und NO3– wurden zu den Inkubationen aus anoxischen Vorräten hinzugefügt, um die gewünschte Ausgangskonzentration zu erreichen (0,5 μM, 1 μM, 3 μM, 5 μM, 7 μM, 10 μM, 15 μM, 25 μM, 35 μM, 45 μM oder). 60 μM). NO und N2O wurden aus 10 % NO (v/v, in He) und 100 % N2O (N50; Air Liquide) in den Kopfraum injiziert, um die gewünschten gelösten Konzentrationen (0,1 μM, 0,2 μM, 0,3 μM, 0,4 μM, 0,6 μM) zu erreichen μM, 0,85 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 6,5 μM, 8 μM, 15 μM, 30 μM oder 60 μM). Nach der Zugabe von NO und N2O wurden die Fläschchen 5–10 Minuten lang inkubiert, um vor der ersten Probenahme ein Gasgleichgewicht zu erreichen. Alle Fläschchen wurden bei 20 ± 2 °C auf einer Schüttelplatte bei 200–250 U/min inkubiert. Der Substratverbrauch wurde überwacht, indem in regelmäßigen Abständen entweder 0,7 ml der Flüssigkeit (für NO2−- und NO3−-Tests) oder 0,1–0,25 ml des Headspace-Gases (für NO- und N2O-Tests) während einer maximalen Inkubationszeit von 2 Stunden oder bis zur Substratentnahme entnommen wurden konnte nicht mehr erkannt werden. Die Proben wurden aus den Fläschchen entnommen, nachdem Nadeln und Spritzen sorgfältig mit Ar/CO2 gespült wurden, um eine Sauerstoffkontamination zu vermeiden. Das extrahierte Volumen wurde immer durch das äquivalente Volumen Ar/CO2 (95:5) ersetzt. Die zu jedem Zeitpunkt während der NO3−- und NO2−-Tests gesammelten Flüssigkeitsproben wurden sofort durch 0,22-µm-Filter filtriert und bis zur Analyse bei 4 °C gelagert. Headspace-Gasproben wurden direkt in den NOx-Analysator oder den µECD-Gaschromatographen injiziert, um die NO- bzw. N2O-Konzentrationen zu messen. Nach Abschluss jeder Inkubation wurden Proben zur Proteinquantifizierung gesammelt und bei –20 °C gelagert. Der Gesamtgasdruck in jedem Fläschchen, der pH-Wert und die Temperatur wurden überwacht und aufgezeichnet, um reproduzierbare Bedingungen für alle Tests sicherzustellen und zur Berechnung der NO- und N2O-Löslichkeiten zu verwenden.

Die Konzentrationen von NO3− und NO2− in jeder Probe, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten gesammelt wurde, wurden direkt zur Berechnung der NO3−- und NO2−-Reduktionsraten verwendet. Die gelösten Konzentrationen von NO und N2O wurden aus den Löslichkeitskonstanten des Henry-Gesetzes und den Partialdrücken der Gase im Kopfraum der Fläschchen abgeleitet. Die anfängliche Substratkonzentration in den NO- und N2O-Affinitätstests entsprach ihrer wässrigen Konzentration, und die Substratreduktionsraten wurden anhand der Gesamtmenge an Substrat (d. h. der gasförmigen und wässrigen Konzentrationen von NO oder N2O in den Fläschchen) berechnet. Die Substratreduktionsraten wurden durch die Proteinkonzentration in jedem Fläschchen normalisiert. Die experimentellen Daten wurden verwendet, um die Monod-Kinetik jedes Substrats gemäß dem an anderer Stelle beschriebenen nichtlinearen Anpassungsprotokoll der kleinsten Quadrate zu beschreiben57. Da bei hohen NO-Konzentrationen eine Abnahme der NO-Reduktionsraten beobachtet wurde, wurde die Haldane-Gleichung angewendet, um die Substrathemmkonstante für NO zu bestimmen. Anpassungsmaße und 95 %-Konfidenzintervalle für die kinetischen Substratkonstanten unter Verwendung der beiden Modelle wurden mit GraphPad Prism 9 (v.9.5.1.; GraphPad Software) berechnet und sind in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt.

Um den Nettobiomasseertrag der Anreicherungskultur zu bestimmen (der sowohl Zellwachstum als auch Zellzerfall berücksichtigt), wurden der Verbrauch an Formiat und die Produktion von Biomasse im Bioreaktor 10 Tage lang alle 48 Stunden gemessen. Für Formiatmessungen wurden alle 48 Stunden dreifache Flüssigkeitsproben aus dem Zu- und Ablauf entnommen. Abwasserproben wurden 10 Minuten lang bei 4 ° C und 21.000 g zentrifugiert, und sowohl Abwasserüberstände als auch Zulaufproben wurden bis zur Analyse bei –20 ° C gelagert. Dreifache Proben zur Proteinquantifizierung wurden aus dem Abwasser entnommen und bis zur Analyse bei –20 ° C gelagert. Die elementare Zusammensetzung der Biomasse im Bioreaktor wurde mit einem Vario Micro Cube Elementaranalysator (Elementar Analysensysteme) bestimmt und daraus die Kohlenstoffkonzentration in der Biomasse (C-mmol Biomasse) berechnet. Alle 48 Stunden wurden 5 ml der Anreicherungskultur in dreifacher Ausfertigung gesammelt und durch vorverbrannte Whatman GF/F 25 mm Glasmikrofaserfilter (GE Healthcare Life Sciences) unter Verwendung eines Vakuums von 200–400 mbar filtriert. Die Zellen wurden auf den Filtern zwei- bis dreimal mit phosphatgepuffertem Salzpuffer gespült. Die Filter wurden 2 Stunden lang bei 60 °C getrocknet, über Nacht in einer Exsikkatorkammer mit 12,5 M HCl inkubiert und erneut bei 60 °C getrocknet. Ganze Filter wurden dann in Zinnkapseln verpackt und mit dem Elementaranalysator gemessen. In die Analyse wurden Blindfilter einbezogen, um Hintergrundkohlenstoff und -stickstoff zu berücksichtigen. Eine Standardkurve mit Sulfanilamid (C6H8N2O2S) wurde nach dem gleichen Verfahren erstellt, um die Kohlenstoffmengen in den Proben zu berechnen.

An den Tagen 497, 1.269 und 1.304 wurden 15–20 ml Biomasse gesammelt und durch 20-minütige Zentrifugation bei 4 °C und 7.942 g pelletiert. Genomische DNA wurde aus Zellpellets mit dem DNAeasy PowerWater Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Gesamt-RNA wurde mit dem RNAeasy PowerWater Kit (Qiagen) extrahiert. Die resultierenden Konzentrationen von DNA und RNA wurden mit einem Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Die Vorbereitung und Sequenzierung der DNA- und RNA-Bibliothek wurde vom Max-Planck-Genomzentrum Köln (https://mpgc.mpipz.mpg.de/home/) unter Verwendung eines Illumina HiSeq 3000-Instruments (Illumina) durchgeführt, um Paired-End (2 × 150 bp) Lesevorgänge aus DNA- und RNA-Proben und ein PacBio Sequel-System (Pacific Biosciences) mit 1 SMRT-Zellen zur Generierung langer Lesevorgänge aus DNA-Proben. Kurze Lesevorgänge aus der DNA-Sequenzierung mit Illumina wurden mit Trimmomatic 0.39 (Ref. 58) getrimmt und mit SPAdes 3.15.3 mit der Option -meta59 zusammengesetzt. Das Binning der zusammengestellten Contigs wurde mit Maxbin 2.2.7 und Metabat 2.12.1 durchgeführt, und hochwertige Bins wurden mit dem DAS_Tool 1.1.1 ausgewählt. Von PacBio erhaltene lange Lesevorgänge wurden mit Canu 1.9 (Ref. 60) und Flye 2.9 (Ref. 61) zusammengestellt. Die Vollständigkeit, Kontamination und Stammheterogenität jedes Behälters wurde mit CheckM 1.1.2 (Ref. 62) bestimmt. Kurze Lesevorgänge aus der RNA-Sequenzierung wurden mit Trimmomatic gekürzt und jegliche im Transkriptom vorhandene ribosomale RNA wurde mit SortMeRNA 4.1 entfernt (Lit. 63). Die Metagenome wurden automatisch mit Prokka 1.14.5 (Lit. 64) annotiert, und eine manuelle Verfeinerung der Annotation ausgewählter Gene wurde durchgeführt, wobei die Annotation jedes Gens in der NR verglichen wurde (GenBank 249; National Center for Biotechnology Information (NCBI)). Datenbanken Pfam (35,0), UniProt (2022_1) und KEGG (101,0). Nach Proteinen von Interesse, die möglicherweise am Formiatstoffwechsel beteiligt sind, aber zunächst in MAG1 oder MAG5 fehlten, wurde weiter gesucht, indem die Sequenzen dieser Proteine ​​mit denen in Mitgliedern der Sterolibacteriaceae-Familie unter Verwendung von MAFFT 7.407 abgeglichen und mit hmmbuild (HMMER) Profile für jedes Protein erstellt wurden Paket 3.3.2) und deren Vergleich mit hmmscan (HMMER-Paket 3.3.2). Darüber hinaus wurde das Proteinkomplement von MAG1 und MAG5 als Abfrage in einer RPS-BLAST-Suche in der NCBI-Datenbank für konservierte Domänen verwendet, um weiter sicherzustellen, dass keine Proteine ​​mit bekannter Formiatassimilationsaktivität übersehen wurden. Das Vorhandensein von Genen, die FDH in MAG1 kodieren, wurde weiter untersucht, indem das Proteinkomplement von MAG1 anhand einer benutzerdefinierten Molybdopterin-Proteindatenbank mit Sequenzen aus GTDB (Version 207) und GEM (Version 2021)65,66 sowie anhand kürzlich veröffentlichter nicht kanonische FDHs67. Die benutzerdefinierte Datenbank enthielt alle Proteinsequenzen der Molybdän-bindenden Untereinheiten von Proteinen in der Superfamilie der komplexen Eisen-Schwefel-Molybdoenzyme (CISM), einschließlich aller bekannten FDHs68. Es wurden vier Proteine ​​identifiziert, die den großen Untereinheiten verschiedener Molybdoenzyme entsprechen: die Proteine ​​OHM77_07745, OHM77_04925 und OHM77_12545, bezeichnet als periplasmatische und membrangebundene NO3−-Reduktasen (NapA und NarG) bzw. Sulfitdehydrogenase (SoeA), die gut geeignet sind. studierte Mitglieder der CISM-Familie; und Protein OHM77_03730, kommentiert als hypothetisches Protein, das keinem bekannten FDH oder einem anderen charakterisierten Molybdopterin-Protein ähnelte. Die Transkriptomhäufigkeit der Gene in MAG1 und MAG5 wurde bestimmt, indem die Lesevorgänge auf den Gensequenzen jedes MAG mit minimap2 (2.26)69 kartiert und anschließend die Lesezahlen pro Gen berechnet wurden, wobei beide Schritte in coverM (0.6.1; https.) integriert wurden ://github.com/wwood/CoverM). Die Lesezahlen wurden dann um die Genlänge und die Gesamtzahl der Lesevorgänge im Transkriptomdatensatz korrigiert, um die RPKM zu erhalten.

Um die Häufigkeit mehrfacher Kopien von nosZ in den Genomen denitrifizierender und N2O-reduzierender Mikroorganismen zu untersuchen, wurde ein Genomdatensatz bestehend aus den Artenvertretern der GTDB und dem „GEM-OTU“-Satz des GEM mit fastANI bei 95 % ANI derepliziert (1.32)70. Der endgültige Datensatz mit 78.768 Genomen wurde mit DIAMOND (2.0.15)71 mit einem BLAST-Score-Ratio-Ansatz nach dem nosZ-Gen durchsucht, wie zuvor beschrieben72. Insgesamt wurden 6.004 nosZ-Gene in 5.799 einzigartigen Genomen gewonnen, wobei 195 Genome (3,4 %) mehr als eine Kopie des Gens enthielten.

Die taxonomische Platzierung der abgerufenen MAGs wurde mit CheckM 1.1.2, GTDB-Tk 1.7.0 (Ref. 73) und MiGA 1.1.2.2 (Ref. 74) erreicht. Im Fall von MAG1 und MAG5 wurde ihre taxonomische Zugehörigkeit durch 16S-rRNA-Gen-Phylogenien sowie ANI- und durchschnittliche AAI-Analysen ergänzt. Die ANIs zwischen unseren MAGs und kultivierten Vertretern der Sterolibacteriaceae-Familie wurden mit FastANI 1.33 nach Behandlung mit EMBOSS (6.5.0) für die Genome berechnet, die mehr als einen Contig umfassen, um verkettete Genome zu erhalten. Der AAI wurde mit dem Skript aai.rb (ENVEOMICS 0.1.1)75 anhand der Aminosäuresequenz der Proteine ​​berechnet. Ein Gesamtgenombaum wurde unter Verwendung von 120 verketteten Einzelkopie-Markergensequenzen76 von MAGs erstellt, die in dieser Studie erhalten wurden und mit der Familie der Sterolibacteriaceae (MAG1, MAG5, MAG2 und MAG6) verwandt sind, zwei öffentlich verfügbaren MAGs, die eng mit MAG1 und MAG5 verwandt sind. und die Genome kultivierter Mitglieder der Sterolibacteriaceae-Familie, verfügbar in GTDB und NCBI. Für die Berechnung des phylogenetischen Baums des 16S-rRNA-Gens verwendeten wir die 16S-rRNA-Gensequenzen derselben MAGs, die in dieser Studie erhalten und in den gesamten Genombaum einbezogen wurden, nämlich diejenigen aus der Familie der Sterolibacteriaceae, die in der SILVA-Datenbank verfügbar sind (SILVA SSU Ref NR 99 138.1). 77 und NCBI, und als Außengruppe haben wir Sequenzen aus der Gattung Thauera der Familie Rhodocyclaceae ausgewählt.

Um den HCO-Baum zu berechnen, wurden Sequenzen aus jeder Familie und die in kultivierten Mitgliedern der Sterolibacteriaceae-Familie vorhandenen NOR-Proteine ​​mithilfe von Blastp gegen NR (GenBank 249; NCBI) abgerufen. Für NosZ-Baumberechnungen verwendeten wir Proteine ​​der verschiedenen Kladen, die im FunGene-Repository (7.3)78 verfügbar sind, und die NosZ-Proteine, die in den kultivierten Mitgliedern der Familie der Sterolibacteriaceae vorhanden sind. Sequenzabgleiche wurden mit MAFFT 7.407 durchgeführt. Phylogenetische Bäume wurden basierend auf der maximalen Wahrscheinlichkeit (1.000 Iterationen) mit IQ-TREE 1.6.12 (Ref. 79) mit der Option –m MFP berechnet und mit iTOL (6.7.5.)80 visualisiert. Die Ausrichtung der aktiven HCO-Stellen erfolgte mithilfe von MAFFT 7.407 mit einem Vertreter jeder Familie aus der HCO-Superfamilie und den aus MAG1 und MAG5 abgerufenen norB-Sequenzen.

Am Tag 1.548 wurden 15 ml Biomasse gesammelt, durch 20-minütige Zentrifugation bei 7.942 g und 4 °C pelletiert und bei –80 °C gelagert. Biomassepellets wurden in 100 µl MilliQ-Wasser resuspendiert und unter Rühren 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, bevor sie 10 Minuten lang in einem Ultraschallbad (Branson 5800 Ultraschallreiniger) beschallt wurden. Die Proben wurden 20 Minuten lang bei 4 °C und 14.000 g zentrifugiert, der Überstand wurde als „lösliche“ Extrakte in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführt und RapiGest SF (Waters) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % (v/v) zugegeben. Die Pellets wurden mit 100 µl MilliQ-Wasser gewaschen, bevor 50 µl 2 % (v/v) RapiGest SF-Lösung zugegeben und 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt wurden. Die Proben wurden 20 Minuten lang mit einer bindungsbrechenden TCEP-Lösung (Thermo Fisher Scientific) reduziert, bevor sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mit 50 mM Chloracetamid alkyliert wurden. Der enzymatische Aufschluss erfolgte durch Inkubation der Proteinextrakte über Nacht bei 37 °C mit 0,4 µg LysC (Wako Chemicals Europe) und 0,4 µg Trypsin (Promega). RapiGest SF wurde durch 40-minütige Inkubation tryptischer Verdaus in 0,5 % Trifluoressigsäure bei 37 °C und anschließende 20-minütige Zentrifugation bei 14.000 g bei 4 °C entfernt. Die Proben wurden sowohl vor als auch nach der salzvermittelten Fällung mit organischen Lösungsmitteln analysiert81.

Tryptische Verdauungen wurden doppelt durch Nanoflow-Flüssigkeitschromatographie (nanoElute; Bruker Daltonics) mit Online-Ionenmobilitätsspektrometrie-Tandem-Massenspektrometrie (timsTOF Pro 2; Bruker Daltonics) und Echtzeit-Proteinidentifizierungstechnologie unter Verwendung der parallelen Datenbanksuchmaschine in Echtzeit gemessen (PaSER 2023; Bruker Daltonics). Peptide wurden direkt auf die C18-Umkehrphasen-Analysesäule (Bruker FIFTEEN 0,075 mm × 150 mm, 1,9 µm Partikel, 120 Å Porengröße, C18 ReproSil AQ; Bruker Daltonics) bei einem konstanten Druck von 800 bar geladen und mit einem 60- Minutenlanger linearer Gradient von 3–45 % Acetonitril in 0,1 % Ameisensäure mit 0,02 % Trifluoressigsäure bei 500 nl min−1 bei 45 °C. Aus der Säule eluierende Peptide wurden durch serielle Fragmentierung mit paralleler Akkumulation im datenabhängigen Erfassungsmodus (dda-PASEF)82 unter Verwendung der Standardmethode mit einem Arbeitszyklus von 1,1 Sekunden (Massenbereich 100–1.700 m/z; Mobilitätsbereich 0,6–1,6 1) analysiert /K0; Akkumulationszeit, 100 ms; Rampenzeit, 100 ms; PASEF-Zyklen, 10; dynamischer Ausschluss, 0,4 min). Erworbene Ionenmobilitätsspektrometrie-Tandem-Massenspektrometrie-Spektren wurden direkt in die PaSER-Box gestreamt, um sie mithilfe der Suchmaschine ProLuCID (1.3) in Echtzeit in der Datenbank zu durchsuchen83. Fragmentierungsspektren wurden anhand einer benutzerdefinierten Proteinsequenzdatenbank durchsucht, die mit den Proteinsequenzen von MAGs erstellt wurde, die in der neuesten Metagenomik-Probe eine relative Häufigkeit von über 0,5 % aufwiesen, entsprechend MAG1 bis MAG8, und einschließlich 28.576 Proteinen. Die Suche wurde durch die folgenden Einstellungen eingeschränkt: 20 ppm Vorläufer-Massentoleranz, 30 ppm Fragment-Ionen-Massentoleranz, strikte tryptische Spaltung, maximal 4 fehlende Spaltungen, Carbamidomethyl (C) als feste Modifikation und Desamidierung (NQ), Oxidation (M). und Formylierung (K) als variable Modifikationen. Einzelne Suchergebnisse wurden mit DTASelect (2.0) und aktiviertem TIMScore kombiniert und validiert, um eine Falscherkennungsrate von ≤ 1 % auf Proteinebene zu erreichen.

Eine Suche auf probeBase84 ergab keine zuvor verfügbaren Sonden, die auf die 16S-rRNA-Gensequenzen von Ca abzielten. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis. Zwei Oligonukleotidsonden wurden entwickelt, um auf diese Organismen abzuzielen, wobei die Sondendesign- und Sondenvergleichsfunktionen der ARB-Software (6.1)85 und der Datenbank SILVA SSU Ref NR 99 138.177,86 zum Einsatz kamen. Aus dem Metagenom extrahierte 16S-rRNA-Gensequenzen in voller Länge (>1.500 bp) wurden in die Datenbank importiert und mit SINA (SILVA Incremental Aligner 1.2.12)87 ausgerichtet. Die Sonde S-*-Nper-0205-aA-23 (Nper205, 5′-TGTCGCGCGAGGTCGTTTCCAAT-3′) zielte nur auf Ca. Nitricoxidivorans perseverans ohne Fehlpaarungen und wies mindestens eine Fehlpaarung mit allen anderen Sequenzen in der Datenbank und mindestens fünf Fehlpaarungen mit den anderen aus dem Metagenom extrahierten 16S-rRNA-Sequenzen auf. Eine Helfersonde (5′-ACTAGCTAATCCGGCATCGGCCGCT-3′) wurde entwickelt, um eine effiziente Hybridisierungseffizienz von Nper205 mit den Zielorganismen sicherzustellen. Sonde S-*-Nbre-0448-aA-19 (Nbre448, 5′-TTAGCGACGACCGTTTCGT-3′) gezielt ohne Fehlpaarungen Ca. Nitricoxidireducens bremensis und fünf weitere unkultivierte Organismen in der Datenbank, die in unserer Anreicherungskultur nicht vorhanden waren und mindestens eine Fehlpaarung mit allen anderen Sequenzen in der Datenbank und mindestens drei Fehlpaarungen mit den anderen aus dem Metagenom extrahierten 16S-rRNA-Sequenzen aufwiesen. Die optimalen Formamidkonzentrationen für die Hybridisierung der Nper205- und Nbre448-Sonden wurden aus Sondendissoziationsprofilen88 ermittelt, die mit der Bildanalysesoftware daime89 erstellt wurden.

Biomasse, die am Tag 1.256 frisch aus dem Bioreaktor gesammelt wurde, und Schlamm, der am selben Tag und Ort wie das Inokulum für die Anreicherungskultur gesammelt wurde, wurden mit 2 % Paraformaldehyd fixiert, wie an anderer Stelle beschrieben90. Fixierte Proben wurden auf 0,22 μm Polycarbonatfilter (Millipore) filtriert und bis zur Analyse bei –20 °C gelagert.

Um die Häufigkeit von Ca abzuschätzen. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis in der Anreicherungskultur und dem denitrifizierenden Schlamm, aus dem es beimpft wurde, wurde CARD-FISH an Filterstücken mit Zellen aus der Anreicherungskultur und dem Inokulum unter Verwendung der Sonden Nper205 und Nbre448 durchgeführt, wie an anderer Stelle beschrieben91. Nper205- und Nbre448-Sonden erforderten Formamidkonzentrationen im Hybridisierungspuffer von 40 % bzw. 30 % (v/v). Positive und negative Kontrollen mit einer äquimolaren Mischung der Sonden EUB338-I, EUB338-II und EUB338-III92,93 sowie mit der Sonde NON338 (Ref. 94) waren enthalten. Nach CARD-FISH wurden die Zellen mit DAPI gefärbt, um auf die DNA aller Mikroorganismen abzuzielen. Relative Häufigkeit von Ca. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis wurden aus CARD-FISH- und DAPI-Zählungen (n ≥ 1.000) in dreifachen Filterstücken bestimmt, die entweder mit Nper205 oder mit Nbre488 hybridisiert wurden. Double CARD-FISH wurde durchgeführt, um gleichzeitig Ca-Zellen sichtbar zu machen. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis durch Hybridisierung mit der Sonde Nper205, gefolgt von der Inaktivierung von Peroxidasen und einem zweiten Hybridisierungsschritt mit der Sonde Nbre448. Für die Zellzählung und Bildaufnahme wurde das Zeiss Axio Imager M2 Epifluoreszenzmikroskop mit einer Axiocam 506 Monokamera (Zeiss) verwendet.

Ca. Nitricoxidivorans (ni.tric.o.xi.di.vo'rans. NL neut. n. nitricum oxidum, NO; L. pres. part. vorans, fressend; NL part. adj. nitricoxidivorans, fressend NO, basierend auf seiner Fütterung auf NEIN). Die Typusart der Gattung ist Ca. Nitricoxidivorans perseverans.

Ca. Nitricoxidivorans perseverans (per.se've.rans. L. part. adj. perseverans, ausdauernd, bezieht sich auf seine ständige Präsenz in der Anreicherungskultur).

Ca. Nitricoxidireducens (ni.tric.o.xi.di.re.du'cens. NL neut. n. Stickoxid, NO; L. v. reduzieren, reduzieren; NL mask. part. n. Nitricoxidireducens, reduzierend NO). Die Typusart der Gattung ist Ca. Stickoxidreduktion von Bremen.

Ca. Nitricoxidireducens bremensis (bre.men'sis. ML mask. adj. bremensis, gehört zur deutschen Stadt Bremen, aufgrund seiner Anreicherung von einem Standort in Bremen, Deutschland).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Rohdaten aus metagenomischen und metatranskriptomischen Analysen sowie alle in dieser Studie generierten MAGs wurden im NCBI unter der BioProject-Nummer PRJNA849246 hinterlegt. Die MAGs von Ca. Nitricoxidivorans perseverans (MAG1) und Ca. Nitricoxidireducens bremensis (MAG5) sind unter den BioSample-Nummern SAMN30388482 und SAMN30388483 und den Genomzugangsnummern CP107246 und JAOTRT000000000 hinterlegt. Metaproteomics-Daten, einschließlich Rohdatendateien und ProLuCID-Suchergebnissen, wurden über die PRIDE-Datenbank95 unter der Kennung PXD037586 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Die in dieser Studie verwendeten Datenbanken sind SILVA SSU Ref NR 99 138.1, NR (GenBank 249; NCBI), Pfam 35.0, UniProt Release 2022_01, KEGG Release 101.0, GTDB Release 207, GEM 2021 und FunGene 7.3. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Crutzen, PJ Der Einfluss von Stickoxiden auf den atmosphärischen Ozongehalt. QJR Meteorol. Soc. 96, 320–325 (1970).

Google Scholar

Johnston, H. Reduzierung von stratosphärischem Ozon durch Stickoxidkatalysatoren aus Überschalltransportabgasen. Wissenschaft 173, 517–522 (1971).

CAS PubMed Google Scholar

Hughes, MN in Globins und anderen Stickoxid-reaktiven Proteinen, Teil A, Bd. 436 (Hrsg. Poole, RK) 3–19 (Academic Press, 2008).

Cole, JA Anaerobe bakterielle Reaktion auf Stickoxidstress: weit verbreitete Missverständnisse und physiologisch relevante Reaktionen. Mol. Mikrobiol. 116, 29–40 (2021).

CAS PubMed Google Scholar

Zumft, WG Die biologische Rolle von Stickstoffmonoxid in Bakterien. Bogen. Mikrobiol. 160, 253–264 (1993).

CAS PubMed Google Scholar

Heckler, I. & Boon, EM Einblicke in Stickoxid-modulierte Quorum-Sensing-Pfade. Vorderseite. Mikrobiol. 10, 2174 (2019).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuypers, MMM, Marchant, HK & Kartal, B. Das mikrobielle Stickstoffkreislaufnetzwerk. Nat. Rev. Microbiol. 16, 263–276 (2018).

CAS PubMed Google Scholar

Hu, Z., Wessels, HJCT, van Alen, T., Jetten, MSM & Kartal, B. Stickoxid-abhängige anaerobe Ammoniumoxidation. Nat. Komm. 10, 1244 (2019).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Zumft, WG Stickoxidreduktasen von Prokaryoten mit Schwerpunkt auf dem respiratorischen Häm-Kupfer-Oxidase-Typ. J. Inorg. Biochem. 99, 194–215 (2005).

CAS PubMed Google Scholar

Mancinelli, RL & McKay, CP Die Entwicklung des Stickstoffkreislaufs. Orig. Lebensentwicklung. Biosph. 18, 311–325 (1988).

CAS PubMed Google Scholar

Martin, RS, Mather, TA & Pyle, DM Vulkanische Emissionen und die frühe Erdatmosphäre. Geochim. Kosmochim. Acta 71, 3673–3685 (2007).

CAS Google Scholar

Ducluzeau, AL et al. War Stickoxid die erste tiefe Elektronensenke? Trends Biochem. Wissenschaft. 34, 9–15 (2009).

CAS PubMed Google Scholar

Ducluzeau, A.-L. et al. Die Entwicklung respiratorischer O2/NO-Reduktasen: eine Perspektive über den Tellerrand der Phylogenetik hinaus. JR Soc. Schnittstelle 11, 20140196 (2014).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Saraste, M. & Castresana, J. Cytochromoxidase entwickelte sich durch Basteln mit Denitrifikationsenzymen. FEBS Lett. 341, 1–4 (1994).

CAS PubMed Google Scholar

van der Oost, J. et al. Die Häm-Kupfer-Oxidase-Familie besteht aus drei verschiedenen Typen terminaler Oxidasen und ist mit der Stickoxidreduktase verwandt. FEMS Mikrobiol. Lette. 121, 1–9 (1994).

PubMed Google Scholar

Kartal, B. et al. Molekularer Mechanismus der anaeroben Ammoniumoxidation. Natur 479, 127–130 (2011).

CAS PubMed Google Scholar

Zumft, AG Zellbiologie und molekulare Grundlagen der Denitrifikation. Mikrobiol. Mol. Biol. Rev. 61, 533–616 (1997).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lycus, P. et al. Phänotypischer und genotypischer Reichtum an Denitrifikatoren, enthüllt durch eine neuartige Isolierungsstrategie. ISME J. 11, 2219–2232 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Roco, CA, Bergaust, LL, Bakken, LR, Yavitt, JB & Shapleigh, JP Modularität stickoxidreduzierender Bodenbakterien: Verknüpfung von Phänotyp und Genotyp. Umgebung. Mikrobiol. 19, 2507–2519 (2017).

CAS PubMed Google Scholar

Pichinoty, F., Mandel, M. & Garcia, J.-L. Die Eigenschaften neuartiger mesophiler denitrifizierender Bacillus-Kulturen in tropischen Böden. J. Gen. Microbiol. 115, 419–430 (1979).

Google Scholar

Potter, WT et al. Biomimetische und mikrobielle Reduktion von Stickoxid. Appl. Biochem. Biotechnologie. 51, 771–784 (1995).

Google Scholar

Vosswinkel, R., Neidt, I. & Bothe, H. Die Produktion und Nutzung von Stickoxid durch einen neuen, denitrifizierenden Stamm von Pseudomonas aeruginosa. Bogen. Mikrobiol. 156, 62–69 (1991).

CAS PubMed Google Scholar

Wink, DA, Darbyshire, JF, Nims, RW, Saavedra, JE & Ford, PC Reaktionen des bioregulatorischen Wirkstoffs Stickoxid in sauerstoffhaltigen wässrigen Medien: Bestimmung der Kinetik für Oxidation und Nitrosierung durch Zwischenprodukte, die bei der Stickoxid/Sauerstoff-Reaktion entstehen. Chem. Res. Toxicol. 6, 23–27 (1993).

CAS PubMed Google Scholar

Conrad, R. Bodenmikroorganismen als Kontrolleure atmosphärischer Spurengase (H2, CO, CH4, OCS, N2O und NO). Mikrobiol. Rev. 60, 609–640 (1996).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Remde, A. & Conrad, R. Metabolismus von Stickoxid im Boden und denitrifizierenden Bakterien. FEMS Mikrobiol. Ökologisch. 8, 81–93 (1991).

Google Scholar

Zafiriou, OC, Hanley, QS & Snyder, G. Produktion und Kreislauf von Stickoxid und Lachgas während der dissimilatorischen Nitritreduktion durch Pseudomonas perfectomarina. J. Biol. Chem. 264, 5694–5699 (1989).

CAS PubMed Google Scholar

Almeida, JS, Reis, MAM & Carrondo, MJT Konkurrenz zwischen Nitrat- und Nitritreduktion bei der Denitrifikation durch Pseudomonas fluorescens. Biotechnologie. Bioeng. 46, 476–484 (1995).

CAS PubMed Google Scholar

Betlach, MR & Tiedje, JM Kinetische Erklärung für die Anreicherung von Nitrit, Stickoxid und Lachgas während der bakteriellen Denitrifikation. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 42, 1074–1084 (1981).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Conthe, M., Parchen, C., Stouten, G., Kleerebezem, R. & van Loosdrecht, MCM O2- versus N2O-Atmung in einer kontinuierlichen mikrobiellen Anreicherung. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 102, 8943–8950 (2018).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dalsgaard, T. & Bak, F. Nitratreduktion in einem sulfatreduzierenden Bakterium, Desulfovibrio desulfuricans, isoliert aus Reisfeldboden: Sulfidhemmung, Kinetik und Regulierung. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 60, 291–297 (1994).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Murray, RE, Parsons, LL & Smith, MS Kinetik der Nitratverwertung durch gemischte Populationen denitrifizierender Bakterien. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 55, 717–721 (1989).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Strous, M., Kuenen, JG & Jetten, MSM Schlüsselphysiologie der anaeroben Ammoniumoxidation. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 65, 3248–3250 (1999).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Suenaga, T. et al. Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung hochaffiner N2O-reduzierender Bakterien in einem gasdurchlässigen Membranreaktor. Umgebung. Wissenschaft. Technol. 53, 12101–12112 (2019).

CAS PubMed Google Scholar

Jones, CM, Graf, DR, Bru, D., Philippot, L. & Hallin, S. Die unerklärte, aber reichlich vorhandene Lachgas-reduzierende mikrobielle Gemeinschaft: eine potenzielle Lachgas-Senke. ISME J. 7, 417–426 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

Sanford, RA et al. Unerwartete Diversität und Häufigkeit nichtdenitrifizierender Lachgasreduktase-Gene in Böden. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 109, 19709–19714 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Suenaga, T., Riya, S., Hosomi, M. & Terada, A. Biokinetische Charakterisierung und Aktivitäten von N2O-reduzierenden Bakterien als Reaktion auf verschiedene Sauerstoffniveaus. Vorderseite. Mikrobiol. 9, 697 (2018).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoon, S., Nissen, S., Park, D., Sanford, RA & Löffler, FE Die Lachgasreduktionskinetik unterscheidet Bakterien, die NosZ der Gruppe I beherbergen, von denen, die NosZ der Gruppe II beherbergen. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 82, 3793–3800 (2016).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bar-Even, A. Formiat-Assimilation: die Stoffwechselarchitektur natürlicher und synthetischer Wege. Biochemistry 55, 3851–3863 (2016).

CAS PubMed Google Scholar

Dijkhuizen, L. & Harder, W. Aktuelle Ansichten zur Regulierung der autotrophen Kohlendioxidfixierung über den Calvin-Zyklus in Bakterien. Antonie van Leeuwenhoek 50, 473–487 (1984).

CAS PubMed Google Scholar

Maia, LB, Moura, JJG & Moura, I. Molybdän- und Wolfram-abhängige Formiatdehydrogenasen. J. Biol. Inorg. Chem. 20, 287–309 (2015).

CAS PubMed Google Scholar

Gerbling, K.-P., Steup, M. & Latzko, E. Fructose-1,6-Bisphosphatase Form B aus Synechococcus leopoliensis hydrolysiert sowohl Fructose als auch Sedoheptulosebisphosphat. Pflanzenphysiologie. 80, 716–720 (1986).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tamoi, M., Ishikawa, T., Takeda, T. & Shigeoka, S. Molekulare Charakterisierung und Resistenz gegen Wasserstoffperoxid von zwei Fructose-1,6-bisphosphatasen aus Synechococcus PCC 7942. Arch. Biochem. Biophys. 334, 27–36 (1996).

CAS PubMed Google Scholar

Nakahara, K., Yamamoto, H., Miyake, C. & Yokota, A. Reinigung und Charakterisierung von Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolasen der Klassen I und II aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803. Pflanzenzellphysiologie. 44, 326–333 (2003).

CAS PubMed Google Scholar

Wenn, J.-G. & Bowien, B. Analyse der cbbF-Gene von Alcaligenes eutrophus, die Fructose-1,6-/Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase kodieren. Curr. Mikrobiol. 31, 55–61 (1995).

CAS PubMed Google Scholar

Simon, J. & Klotz, MG Diversität und Entwicklung bioenergetischer Systeme, die an mikrobiellen Stickstoffverbindungsumwandlungen beteiligt sind. Biochim. Biophys. Acta 1827, 114–135 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

Kaila, VRI & Wikström, M. Architektur bakterieller Atmungsketten. Nat. Rev. Microbiol. 19, 319–330 (2021).

CAS PubMed Google Scholar

Cava, F., Zafra, O. & Berenguer, J. Ein Cytochrom c, das Nitratreduktase enthält, spielt eine Rolle beim Elektronentransport zur Denitrifikation in Thermus thermophilus ohne Beteiligung des bc-Atmungskomplexes. Mol. Mikrobiol. 70, 507–518 (2008).

CAS PubMed Google Scholar

Bell, LC, Richardson, DJ & Ferguson, SJ Identifizierung der Stickoxidreduktaseaktivität in Rhodobacter capsulatus: Der Elektronentransportweg kann sowohl Cytochrom c2 als auch den Cytochrom bc1-Komplex entweder nutzen oder umgehen. J. Gen. Microbiol. 138, 437–443 (1992).

CAS PubMed Google Scholar

Vollack, KU & Zumft, WG Stickoxid-Signalisierung und Transkriptionskontrolle von Denitrifikationsgenen in Pseudomonas stutzeri. J. Bakteriol. 183, 2516–2526 (2001).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arai, H., Kodama, T. & Igarashi, Y. Wirkung von Stickoxiden auf die Expression der nir- und nor-Gene für die Denitrifikation in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Mikrobiol. Lette. 170, 19–24 (1999).

CAS PubMed Google Scholar

Bueno, E. et al. Unterschiedliche Reaktion auf Mikrooxie und Stickoxide der Denitrifikationsgene napEDABC, nirK und norCBQD von Bradyrhizobium japonicum. Stickoxid 68, 137–149 (2017).

CAS PubMed Google Scholar

Härtig, E., Schiek, U., Vollack, KU & Zumft, WG Nitrat- und Nitritkontrolle der respiratorischen Nitratreduktion bei denitrifizierendem Pseudomonas stutzeri durch ein Zweikomponenten-Regulationssystem, das homolog zu NarXL von Escherichia coli ist. J. Bakteriol. 181, 3658–3665 (1999).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Philippot, L. et al. Charakterisierung und Transkriptionsanalyse von denitrifizierenden Pseudomonas fluorescens-Clustern, die die Gene nar, nir, nor und nos enthalten. Biochim. Biophys. Acta 1517, 436–440 (2001).

CAS PubMed Google Scholar

Hassan, J., Bergaust, LL, Molstad, L., de Vries, S. & Bakken, LR Homöostatische Kontrolle von Stickoxid (NO) bei nanomolaren Konzentrationen in denitrifizierenden Bakterien – Modellierung und experimentelle Bestimmung der NO-Reduktase-Kinetik in vivo in Paracoccus denitrificans. Umgebung. Mikrobiol. 18, 2964–2978 (2016).

CAS PubMed Google Scholar

Miranda, KM, Espey, MG & Wink, DA Eine schnelle, einfache spektrophotometrische Methode zum gleichzeitigen Nachweis von Nitrat und Nitrit. Nitric Oxide 5, 62–71 (2001).

CAS PubMed Google Scholar

García-Robledo, E., Corzo, A. & Papaspyrou, S. Eine schnelle und direkte spektrophotometrische Methode zur sequentiellen Bestimmung von Nitrat und Nitrit bei niedrigen Konzentrationen in kleinen Volumina. Mar. Chem. 162, 30–36 (2014).

Google Scholar

Kemmer, G. & Keller, S. Nichtlineare Datenanpassung nach der Methode der kleinsten Quadrate in Excel-Tabellen. Nat. Protokoll. 5, 267–281 (2010).

CAS PubMed Google Scholar

Bolger, AM, Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: ein flexibler Trimmer für Illumina-Sequenzdaten. Bioinformatik 30, 2114–2120 (2014).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nurk, S., Meleshko, D., Korobeynikov, A. & Pevzner, PA metaSPAdes: ein neuer vielseitiger metagenomischer Assembler. Genomres. 27, 824–834 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koren, S. et al. Canu: Skalierbare und genaue Long-Read-Assemblierung durch adaptive K-Mer-Gewichtung und Wiederholungstrennung. Genomres. 27, 722–736 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kolmogorov, M. et al. metaFlye: Skalierbare Long-Read-Metagenom-Assemblierung mithilfe von Wiederholungsdiagrammen. Nat. Methoden 17, 1103–1110 (2020).

CAS PubMed Google Scholar

Parks, DH, Imelfort, M., Skennerton, CT, Hugenholtz, P. & Tyson, GWCheckM: Bewertung der Qualität mikrobieller Genome, die aus Isolaten, Einzelzellen und Metagenomen gewonnen wurden. Genomres. 25, 1043–1055 (2015).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kopylova, E., Noé, L. & Touzet, H. SortMeRNA: schnelle und genaue Filterung ribosomaler RNAs in metatranskriptomischen Daten. Bioinformatik 28, 3211–3217 (2012).

CAS PubMed Google Scholar

Seemann, T. Prokka: Schnelle Annotation des prokaryotischen Genoms. Bioinformatik 30, 2068–2069 (2014).

CAS PubMed Google Scholar

Parks, DH et al. Eine vollständige Domänen-zu-Art-Taxonomie für Bakterien und Archaeen. Nat. Biotechnologie. 38, 1079–1086 (2020).

CAS PubMed Google Scholar

Nayfach, S. et al. Ein genomischer Katalog der Mikrobiome der Erde. Nat. Biotechnologie. 39, 499–509 (2021).

CAS PubMed Google Scholar

Arias-Cartín, R. et al. Identifizierung und Charakterisierung einer nichtkanonischen Menachinon-verknüpften Formiatdehydrogenase. J. Biol. Chem. 298, 101384 (2022).

PubMed Google Scholar

Grimaldi, S., Schoepp-Cothenet, B., Ceccaldi, P., Guigliarelli, B. & Magalon, A. Die prokaryotische Mo/W-bisPGD-Enzymfamilie: ein katalytisches Arbeitstier in der Bioenergetik. Biochim. Biophys. Acta 1827, 1048–1085 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

Li, H. Minimap2: Paarweise Ausrichtung für Nukleotidsequenzen. Bioinformatik 34, 3094–3100 (2018).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jain, C., Rodriguez-R, LM, Phillippy, AM, Konstantinidis, KT & Aluru, S. Hochdurchsatz-ANI-Analyse von 90.000 prokaryotischen Genomen zeigt klare Artengrenzen. Nat. Komm. 9, 5114 (2018).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Buchfink, B., Reuter, K. & Drost, H.-G. Empfindliche Proteinausrichtungen im Lebensbaummaßstab mit DIAMOND. Nat. Methoden 18, 366–368 (2021).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Speth, DR & Orphan, VJ Das Metabolic Marker Gene Mining bietet Einblicke in die globale mcrA-Diversität und wirft in Verbindung mit der gezielten Genomrekonstruktion weiteres Licht auf das Stoffwechselpotenzial der Methanomassiliicoccas. PeerJ 6, e5614 (2018).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Chaumeil, P.-A., Mussig, AJ, Hugenholtz, P. & Parks, DH GTDB-Tk: ein Toolkit zur Klassifizierung von Genomen mit der Genome Taxonomy Database. Bioinformatik 36, 1925–1927 (2020).

CAS Google Scholar

Rodriguez-R, LM et al. Der Webserver des Microbial Genomes Atlas (MiGA): Taxonomische und Gendiversitätsanalyse von Archaeen und Bakterien auf der Ebene des gesamten Genoms. Nukleinsäuren Res. 46, W282–W288 (2018).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rodriguez-R, LM & Konstantinidis, KT Die Enveomics-Sammlung: eine Toolbox für spezielle Analysen mikrobieller Genome und Metagenome. Vorabdruck bei PeerJ Preprints https://doi.org/10.7287/peerj.preprints.1900v1 (2016).

Parks, DH et al. Die Wiederherstellung von fast 8.000 aus Metagenomen zusammengesetzten Genomen erweitert den Stammbaum des Lebens erheblich. Nat. Microbiol 2, 1533–1542 (2017).

CAS PubMed Google Scholar

Quast, C. et al. Das SILVA-Ribosomal-RNA-Gendatenbankprojekt: verbesserte Datenverarbeitung und webbasierte Tools. Nukleinsäuren Res. 41, D590–D596 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

Fish, J. et al. FunGene: die funktionelle Genpipeline und das Repository. Vorderseite. Mikrobiol. 4, 291 (2013).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Minh, BQ et al. IQ-TREE 2: Neue Modelle und effiziente Methoden zur phylogenetischen Inferenz im genomischen Zeitalter. Mol. Biol. Entwicklung 37, 1530–1534 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v5: ein Online-Tool für die Anzeige und Annotation phylogenetischer Bäume. Nukleinsäuren Res. 49, W293–W296 (2021).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baghalabadi, V., Razmi, H. & Doucette, A. Salzvermittelte Fällung mit organischen Lösungsmitteln zur verbesserten Rückgewinnung von Peptiden, die durch Pepsinverdau erzeugt werden. Proteome 9, 44 (2021).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meier, F. et al. Online Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF) mit einem neuartigen Massenspektrometer für die Mobilität gefangener Ionen. Mol. Zelle. Proteomics 17, 2534–2545 (2018).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, T. et al. ProLuCID: ein verbesserter SEQUEST-ähnlicher Algorithmus mit erhöhter Empfindlichkeit und Spezifität. J. Proteom. 129, 16–24 (2015).

CAS Google Scholar

Loy, A., Horn, M. & Wagner, M. probeBase: eine Online-Ressource für rRNA-zielgerichtete Oligonukleotidsonden. Nukleinsäuren Res. 31, 514–516 (2003).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ludwig, W. et al. ARB: eine Softwareumgebung für Sequenzdaten. Nukleinsäuren Res. 32, 1363–1371 (2004).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yilmaz, P. et al. Die taxonomischen Rahmenwerke SILVA und „All-species Living Tree Project (LTP)“. Nukleinsäuren Res. 42, D643–D648 (2014).

CAS PubMed Google Scholar

Pruesse, E., Peplies, J. & Glöckner, FO SINA: Präzises Hochdurchsatz-Multiple-Sequenz-Alignment ribosomaler RNA-Gene. Bioinformatik 28, 1823–1829 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M. & Schleifer, K.-H. Phylogenetische Oligodesoxynukleotidsonden für die wichtigsten Unterklassen von Proteobakterien: Probleme und Lösungen. Syst. Appl. Mikrobiol. 15, 593–600 (1992).

Google Scholar

Daims, H., Lücker, S. & Wagner, M. daime, ein neuartiges Bildanalyseprogramm für mikrobielle Ökologie und Biofilmforschung. Umgebung. Mikrobiol. 8, 200–213 (2006).

CAS PubMed Google Scholar

Amann, RI, Krumholz, L. & Stahl, DA Fluoreszenz-Oligonukleotid-Untersuchung ganzer Zellen für determinative, phylogenetische und Umweltstudien in der Mikrobiologie. J. Bakteriol. 172, 762–770 (1990).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pernthaler, J., Pernthaler, A. & Amann, R. Automatisierte Zählung von Gruppen marinen Picoplanktons nach Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 69, 2631–2637 (2003).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amann, RI et al. Kombination von 16S-rRNA-zielgerichteten Oligonukleotidsonden mit Durchflusszytometrie zur Analyse gemischter mikrobieller Populationen. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 56, 1919–1925 (1990).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Daims, H., Brühl, A., Amann, R., Schleifer, K.-H. & Wagner, M. Die domänenspezifische Sonde EUB338 reicht für den Nachweis aller Bakterien nicht aus: Entwicklung und Bewertung eines umfassenderen Sondensatzes. Syst. Appl. Mikrobiol. 22, 434–444 (1999).

CAS PubMed Google Scholar

Wallner, G., Amann, R. & Beisker, W. Optimierung der fluoreszierenden In-situ-Hybridisierung mit rRNA-zielgerichteten Oligonukleotidsonden für die durchflusszytometrische Identifizierung von Mikroorganismen. Cytometry 14, 136–143 (1993).

CAS PubMed Google Scholar

Perez-Riverol, Y. et al. Die PRIDE-Datenbankressourcen im Jahr 2022: eine Drehscheibe für massenspektrometriebasierte Proteomik-Beweise. Nukleinsäuren Res. 50, D543–D552 (2022).

CAS PubMed Google Scholar

Hoang, DT, Chernomor, O., von Haeseler, A., Minh, BQ & Vinh, LS UFBoot2: Verbesserung der ultraschnellen Bootstrap-Näherung. Mol. Biol. Entwicklung 35, 518–522 (2018).

CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken hanseWasser Bremen für die Möglichkeit, die Kläranlage Seehausen zu beproben; LH Orellana Retamal und B. Tschitschko für ihren Beitrag zu den phylogenetischen und taxonomischen Analysen; B. Schink und A. Oren für ihre Vorschläge zur Benennung von Ca. Nitricoxidivorans perseverans und Ca. Nitricoxidireducens bremensis; K. Kitzinger für ihre Hilfe beim Design von Nukleotidsonden; B. Vekeman für wissenschaftliche Diskussionen; und A. Wallenius, J. Köppen, D. Tienken und N. Böttcher für ihre technische Unterstützung. PG-A., NS und BK wurden durch ein Startstipendium des Europäischen Forschungsrats (640422) und die Max-Planck-Gesellschaft unterstützt. IG-H. und DRS wurden von der Max-Planck-Gesellschaft gefördert. HJCTW wurde durch einen ZonMw Medium Investment Grant (40-00506-98-9001) unterstützt.

Open-Access-Förderung durch die Max-Planck-Gesellschaft.

Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie, Bremen, Deutschland

Paloma Garrido-Amador, Niek Stortenbeker, Daan R. Speth, Inmaculada Garcia-Heredia und Boran Kartal

Translational Metabolic Laboratory, Abteilung für Labormedizin, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande

Hans JCT Wessels

School of Science, Konstrukteursuniversität, Bremen, Deutschland

Boran Kartal

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

BK und PG-A. konzipierte und analysierte Experimente. PG-A. gepflegte Kulturen, führte Aktivitätsexperimente und analytische Messungen durch und bereitete Material für Metagenomik, Metatranskriptomik und Metaproteomik vor. NS pflegte Kulturen und führte analytische Messungen durch. IG-H., DRS und PG-A. führte Metagenomik- und Metatranskriptomik-Analysen durch. HJCTW führte Metaproteomik-Analysen durch. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse. PG-A. und BK hat die Arbeit mit Beiträgen aller Mitautoren verfasst.

Korrespondenz mit Boran Kartal.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Microbiology dankt Magnus Ø. Arntzen, George Wells und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Informationen, Abb. 1–7, Tabellen 1–7 und Referenzen.

Mengen an ein- und ausströmendem NO, Formiat und N2O im Bioreaktor.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Garrido-Amador, P., Stortenbeker, N., Wessels, HJCT et al. Anreicherung und Charakterisierung einer Stickoxid-reduzierenden Mikrobengemeinschaft in einem kontinuierlichen Bioreaktor. Nat Microbiol 8, 1574–1586 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01425-8

Zitat herunterladen

Eingegangen: 09. Februar 2023

Angenommen: 14. Juni 2023

Veröffentlicht: 10. Juli 2023

Ausgabedatum: August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01425-8

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt